PLoS ONE: Differential Angivelse af miRNA i kolorektal cancer: Sammenligning af parret tumorvæv og tilstødende Normal mucosa Brug High-Throughput Sequencing

Abstrakt

Vi præsenterer resultaterne af en global undersøgelse af dysregulerede miRNA i parrede prøver af normal slimhinde og tumor fra otte patienter med colorectal cancer. Selv om der er eksisterende data af miRNA bidrag til kolorektal tumorigenese, disse studier er typisk små til studier af cellelinier eller ikke-parrede tumorprøver mellemstore. Den foreliggende undersøgelse er at vores viden unik i to henseender. For det første er de normale og tilstødende tumor vævsprøver parret, således under hensyntagen til de grundlæggende forskelle mellem individer, når der testes for differentiel ekspression. For det andet bruger vi high-throughput sekventering, hvilket muliggør en omfattende undersøgelse af alle miRNA udtrykt i vævene. Vi bruger Illumina sekventering teknologi til at udføre sekventering og to forskellige værktøjer statistisk test for forskelle i læste optællinger pr gen mellem prøver: kantskæreren, når du bruger oplysningerne pair og DESeq når ignorerer denne information, dvs., behandling tumor og normale prøver som selvstændige grupper. Vi identificerer 37 miRNA, der er betydeligt dysreguleret i både statistiske metoder, 19 nedreguleret og 18 opreguleret. Nogle af disse miRNA er tidligere publiceret som potentielle regulatorer i kolorektale adenokarcinomer såsom miR-1, miR-96 og miR-145. Vores omfattende undersøgelse af differentielt udtrykte miRNA bekræfter således nogle af de eksisterende fund. Vi har også opdaget 16 dysregulerede miRNA, som til vores viden ikke tidligere har været forbundet med kolorektal carcinogenese: Følgende betydeligt nedreguleret miR-490-3p, -628-3p /-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5 p, -3656 og opreguleret miR-105, -549, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -3180-3p, -4326. Selv om undersøgelsen er foreløbig med kun otte patienter inkluderet, mener vi resultaterne føje til den nuværende viden om miRNA dysregulering i kolorektal carcinogenese. Som sådan resultaterne ville tjene som en robust uddannelse indstillet til validering af potentielle biomarkører i en større kohorte undersøgelse. Endelig har vi også præsentere data understøtter hypotesen om, at der er forskelle i miRNA udtryk mellem adenokarcinomer og neuroendokrine tumorer i tyktarmen

Henvisning:. Hamfjord J, Stangeland AM, Hughes T, Skrede ML, Tveit KM, Ikdahl T et al. (2012) Differential Angivelse af miRNA i kolorektal cancer: Sammenligning af parret tumorvæv og tilstødende Normal mucosa Brug High-Throughput Sequencing. PLoS ONE 7 (4): e34150. doi: 10,1371 /journal.pone.0034150

Redaktør: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: September 6, 2011; Accepteret: 23 februar 2012; Udgivet: 17 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Hamfjord et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Ekstern finansiering modtaget fra “Ivar, Ragna og Morten Huller Legat the promote av kreftforskningen i Norge” (Ivar, Ragna og Morten Huller ‘Foundation til at tjene kræftforskning i Norge). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de hyppigst forekommende kræftformer verdensplan [1]. Prognose afhænger af tumor scenen på tidspunktet for diagnosen. Der er stor fokus på opdagelse og validering af tidlig påvisning markører samt forudsigende og prognostiske faktorer som gennemgået af Asghar

et al

. [2]. Den molekylære tilblivelsen af ​​CRC er blandt de bedst beskrevet af alle menneskelige kræftformer. Den Vogelstein model [3] har i årenes løb blevet ændret og udvidet, som eksemplificeret ved SLABÝ

et al

. [4].

MikroRNA’er (Mirs) er små ikke-kodende RNA-molekyler 18-25 nukleotider i længden, først opdaget i begyndelsen af ​​1990’erne i

C. elegans

[5]. De opretholde homøostase ved at ændre genekspression i forskellige celleprocesser såsom differentiering, proliferation, overlevelse og apoptose [6]. Det anslås, at mere end 10% af alle protein-kodende humane gener kan reguleres af disse mekanismer [7]. Den seneste række menneskelige Mirs optaget i miRBase overstiger et tusind [8], og den stigende brug af high-throughput sekventering kører videre opdagelse. Undersøgelser har også vist, at Mirs kan dysreguleret i forskellige humane cancere, og dermed fungere som tumorsuppressorer eller onkogener [9], [10]. Disse molekyler er interessante, da de kan være potentielle biomarkører for diagnose eller prognose og fungere som potentielle mål i kræft specifik terapi som gennemgået af Cho

et al

. [11], [12]. Det endelige mål ville være skræddersyet medicin med genotype-fænotype kræftnetværk som køreplanen for kliniske beslutninger [13].

Mange undersøgelser har fokuseret på miR udtryk profilering i kolorektal cancer. De fleste af disse undersøgelser har analyseret et mindre antal Mirs ved hjælp af real-time polymerasekædereaktion (PCR) eller hybridisering baseret teknologi, dels fra cellelinier eller ikke-parrede patientens væv [14], [15], [16], [17 ], [18]. Kun få studier har mere globalt sekventeret Mirs i større skala til ekspression profil, ligesom undersøgelsen om melanom [19] og kolorektal [20] microRNAome. Sidstnævnte undersøgelse var enestående i sin art og præsenteret en række nye formodede Mirs ved at bruge en eksperimentel tilgang opkaldt fatamorgana. Men da denne undersøgelse går tilbage flere år, kun en delmængde af modne Mirs kendes i dag var aktivt undersøgt.

Global udtryk for Mirs har traditionelt blevet vurderet ved hjælp af hybridisering baseret array-teknologier. Disse arrays er baseret på sekvensspecifik hybridisering efter mærkning med et fluorescerende farvestof. Fluorescensintensitet registreres og afspejler ekspressionen af ​​et givet gen. Ved at bruge flere farvestoffer, kan forskellen i fluorescens anvendes som et indeks for genekspression. High-throughput sekventering, på den anden side, bruger eksempel transkripter som udgangstemplate. Direkte sekventering udføres derefter med en række reaktioner under anvendelse fluorofor terminator nukleotider. Sekvens læser kortlægges derefter tilbage til referencen genom eller en database af transkripter og antallet af sekvensen læser mapping tilbage til en specifik transkript er et mål for genekspression. I det almindelige tilfælde af mRNA, skal normaliseres for længden af ​​transkriptet og det samlede antal læser genereret for prøven denne tæller. I tilfælde af Mir er normaliseringen for transskriptet længde ikke påkrævet, da læser dækker den fulde længde af transkriptet. Differentiel ekspression måles derefter som forskellen i normaliserede tællinger for et givet gen. En nylig publikation sammenligner forskellen genekspression i

D. pseudoobscura

ved brug array-teknologi og high-throughput sekventering. De fleste af ekspressionsniveauerne er ens mellem de metoder, med en tilsvarende ydeevne [21]. En lignende undersøgelse af

S. cerevisiae

har vist, at de metoder, enige temmelig godt for gener med mellemstore niveauer af udtryk, men korrelationen er meget lav for gener med enten lave eller høje ekspressionsniveauer. Dette skyldes til dels den stærkt øgede dynamikområde til kvantificering af genekspression, som den high-throughput sekventering metoden [22]. High-throughput sekventering yderligere betragtes overlegen, når der beskæftiger sig med den struktur og dynamik af transkriptomet. Eksempler på dette omfatter ekspression af ukendte målsekvenser, RNA-redigering arrangementer og andre RNA sekvensvariationer såsom polymorfier [21], [22], [23].

Da disse funktioner i high-throughput sekventering antyder, at det er en fremragende metode til globale undersøgelser af små RNA, vi medtaget otte patienter med tarmkræft undergår kirurgisk resektion af colon for at studere tumor specifikke ændringer i miR udtryk ved hjælp af Illumina high-throughput sekventering teknologi. Væv af normal slimhinde og tumor blev indsamlet fra kirurgiske prøver for alle patienter, og derfor opnåelse af et unikt sæt af parrede prøver. Vores analyse af sekvensen datasæt vi fremstillet af disse prøver kan vi identificere Mirs der ikke tidligere har været forbundet med kolorektale adenocarcinomer. Vi har også konstateret forskelle i miR ekspression mellem adenokarcinomer og en neuroendokrin tumor i tyktarmen. Disse resultater føje til den nuværende viden om miR dysregulering i kolorektal carcinogenese.

Resultater

Otte patienter blev tilfældigt udvalgt i henhold til specifikationerne kønsspecifikke (mænd kun) fra en kolorektal cancer kohorte. Total RNA fra tumorvæv og tilstødende normale slimhinde blev ekstraheret. I indledende analyse af differentiel ekspression mellem tumor og tilstødende normale slimhinde, et par demonstrerede et ekspressionsmønster forskellig fra resten af ​​parrene. Histopatologi blev gennemgået af en patolog (tabel 1), og det var tydeligt, at en patient var fejlklassificeres og nærede en atypisk Neuroendokrin tumor (NET), mens resten var adenokarcinomer. Alle yderligere statistiske analyser behandlet patienten med NET som en særskilt sag fra de resterende patienter. Procentdelen af ​​tumorceller og stromale komponenter blev også skønnet i hæmatoxylin og eosin farvede sektioner fra primær tumor, der viser, at syv af otte prøver nærede mere end 60% tumorceller (tabel 1).

16 prøver lykkedes sekventeret under anvendelse Illumina Genome Analyzer II (Illumina, CA, USA) og behandles ved hjælp miRanalyzer [24] med et gennemsnit på 562 modne Mirs mappet til miRBase pr sekventeringsforsøget når tillader én mismatch nukleotid (figur 1B). Ca. 80% af sekventering læser kortlagt til modne humane Mirs i miRBase (frigive 16) i sytten af ​​atten sekventering kørsler, den resterende læser meste kort til andre dele af transkriptomet. I den sidste prøve (normalt væv N7) der var en meget lavere procentdel af læser, at kortet til miRBase (37,2% af det samlede læser) (figur 1A). Dette kan skyldes tekniske problemer under forberedelsen. Desuden blev et par hundrede formodet roman miR-sekvenser og gen loci i referencen genom (HSA hg18) forudsagt fra sekventering kørsler. Disse formodede sekvenser udgør en lille brøkdel af det samlede læse count (data ikke vist).

Panel A med procentdel af sekventering læser kortlagt til modne Mirs (sort) af det samlede læser pr eksperiment. Panel B med antallet af modne Mirs identificeret pr sekventering eksperiment. Det samlede antal af modne menneskelige Mirs i miRBase frigive 16 (n = 1212) er medtaget som reference.

Differential udtryk (DE) af identificerede Mirs fra miRBase blev beregnet ved hjælp af to bioinformatiske værktøjer, DESeq [25 ] og edger [26]. Kantskærer implementerer funktionalitet til at udføre både parret og ikke-parrede test (oplysningerne par ignoreres, og normal og tumorprøver behandles som selvstændige grupper), mens DESeq ikke kan udføre parrede test, men nyder godt af yderligere statistiske justeringer i forhold til kantskærer. Behandling af normale og tumor prøver som to uafhængige grupper er teoretisk forudsiges at være den mere konservative test siden, i modsætning til den parrede test, betyder det ikke højde for baseline forskelle mellem patienter. Ved at bruge begge metoder, får vi to sæt markant differentielt udtrykte Mirs. Skæringspunktet mellem disse to sæt er en meget konservativ forudsigelse af de væsentligt dysreguleret Mirs. Desuden kunne vi observere, i hvilket omfang den ikke-parrede test er mere forsigtig end den parrede. Første gange ændring af kendte Mirs blev analyseret mellem grupperne af adenocarcinom (n = 7) og normal slimhinde (n = 8), derefter mellem neuroendokrine tilfælde (n = 1) og normal slimhinde (n = 8) ved anvendelse DESeq (figur 2A og 2C). Når man ser på de adenocarcinomer som gruppe og brug af Benjamini og Hochberg justering [27] for multiple test (FDR 0,1), i alt 52 Mirs signifikant dysreguleret sammenlignet med den normale slimhinde: 28 blev nedreguleret og 24 opreguleret (tabel S1). Den neuroendokrine tilfælde imidlertid demonstreret i alt 38 Mirs betydeligt dysreguleret sammenlignet med den normale slimhinde gruppen, alle opreguleret (tabel S2). Interessant, er kun 6 Mirs repræsenteret i begge histopatologiske grupper: miR-7, -96, -204, -1269, -1827 og -3177. I denne analyse er der således i alt 46 og 32 Mirs der synes noget specifikt for adenocarcinom og neuroendokrine histopatologi henholdsvis.

Skematisk illustration af statistiske metode. Paneler A og C viser tilgang med ikke-parrede statistikker og den DESeq værktøj. Panel B viser tilgang med parrede statistikker og kantskæreren værktøj. Se tekst for yderligere detaljer.

Da vi gransket den parrede prøver af tumor og normal slimhinde væv fra de samme patienter, vi udførte også en test af de syv adenocarcinom sager ved hjælp af parrede statistikker Edger (figur 2B ). I alt 118 Mirs blev identificeret som væsentlig dysreguleret under de samme betingelser som for de ikke-parrede analyse (tabel S3). Af disse var der 81 Mirs, der ikke blev identificeret i den ikke-parrede analyse, og en fælles overlap på 37 for de to metoder. Dette bekræfter forudsigelsen at den ikke-parrede analyse er den mere konservative test, selv om der er 15 Mirs identificeret som dysreguleret i DESeq ikke-parrede test, som ikke blev identificeret ved den parrede analyse i Edger (figur 3).

Det er klart, at der er 37 almindelige Mirs fundet at være dysreguleret betydeligt ved brug af både statistiske metoder (tabel 2). Der er omtrent lige fordeling mellem ned- og op-regulerede Mirs. Der er både ydmyge (ca. 10-10 000 absolut læser) og stærkt (ca. 10 000-5 000 000 absolutte læser) udtrykte Mirs repræsenteret i den fælles miR delmængde, to bemærkelsesværdige eksempler er miR-7 og miR-1 hhv. Når man ser på ekspressionsniveauerne globalt i form af alle identificerede Mirs, der er en global opregulering af udtryk i tumoren sammenlignet med normal slimhinde (betragtet fra den parrede analyse af adenokarcinomer).

Den high-throughput sekventering blev eksperimentelt valideret ved anvendelse af en kvantitativ polymerase-kædereaktion for udvalgte Mirs og vævsprøver (figur S1). Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere inter-platform valideringsresultater [28]:. Resultaterne mellem de forskellige metoder korrelerer, men denne sammenhæng er langt fra perfekt

Diskussion

Flere undersøgelser har fundet, at Mirs er globalt nedreguleret i forskellige kræftformer, med en sammenhæng mellem graden af ​​differentiering og global ekspressionsniveauer af Mirs. Selv om det er blevet anført, at den globale nedregulering fremmer celle transformation og tumorigenese [10], [15], [29], en stor udtryk profilering undersøgelse af solide tumorer ved Volinia

et al

. observerede ikke nedregulering af Mirs som tidligere rapporteret [30]. Vores undersøgelse tyder på, at den globale nedregulering er ikke tilfældet for de kolorektale adenokarcinomer i vores kohorte, selvom et betydeligt antal individuelle Mirs er nedreguleret i adenokarcinomer i forhold til de normale prøver.

Ifølge den miRecords database [31], miR-1 har 117 validerede targets og kan potentielt interagere med flere vigtige gener i carcinogenese af kolorektal cancer. I en undersøgelse fra 2009 blev MIR-1 og MIR-551b (blandt andre) sig at have lavere ekspression i embryonale stamceller i forhold til differentierede celler og i colorektal cancer i forhold til normal slimhinde [17]. Dette er i overensstemmelse med vores fund af nedreguleret miR-1 og miR-551b i kolorektale adenokarcinomer. Nedreguleret MIR-1 er også observeret i den neuroendokrine tilfældet. MIR-1 er yderligere blevet rapporteret til at være ned-reguleret og foreslog en tumor-undertrykkende funktion ved at målrette transgelin 2-genet (

TAGLN2

) i blærekræft [32] og hoved og hals skællede celle carcinomer [33] .

mIR-145 er nedreguleret i adenocarcenomas af vores undersøgelse, og dette miR er ofte blevet forbundet med nedregulering i tarmkræft [16], [34], [35], [36] . Det menes at have en tumor-suppressor rolle, dels ved at målrette insulinreceptoren substratet 1 (ISR-1) og type I insulin-lignende vækstfaktor-receptor (IGF-IR). Tab af miR-145 hæmning stiger antiapoptotiske signaler i cellen og fremmer cellevækst [37], [38].

I en undersøgelse fra 2010 blev miR-195 fundet at være nedreguleret i 81 kolorektal cancer væv sammenlignet med matchede normal slimhinde, og dette er i overensstemmelse med vores resultater for adenokarcinomer. Dette miR menes at målrette Bcl-2 og således udøve sin pro-apoptotiske funktion når fysiologisk reguleret [39]. En anden undersøgelse viste, at en reduceret ekspression af MIR-195 forekom oftere hos patienter med lymfeknudemetastaser og avanceret tumor stadium. Lav ekspressionsniveauerne var også dårlige prædiktorer for samlet overlevelse [40].

I to mindre undersøgelser, en af ​​tyktarmskræft uden lymfeknude metastaser [41] og den anden af ​​mavekræft [31], miR-378 var fundet at være nedreguleret i tumorerne sammenlignet med normalt tilstødende væv som det ses i vores undersøgelse. Det er imidlertid blevet rapporteret, at miR-378 fremmer celle overlevelse og tumorvækst ved at målrette Sufu og Fus-1 [42], og det kan også spille en modificerende rolle med andre Mirs i angiogenese [43]. Der er yderligere bevis på, at Myc /miR-378 /TOB2 /cyclin D1 funktionelt modul regulerer onkogen transformation [44].

MIR-383 er også nedreguleret i adenokarcinomer i forhold til normalt væv. Så vidt vi ved dette ikke er blevet rapporteret for kolorektale adenokarcinomer, men er blevet observeret i en lille undersøgelse om mavekræft [45]. Der er god overensstemmelse mellem vores resultater af ned-regulerede Mirs i kolorektale adenokarcinomer og tidligere offentliggjorte rapporter. Samt Mirs beskrevet ovenfor, identificerede vi et betydeligt antal andre ensartet nedreguleret Mirs, mindre nævnt i litteraturen; -139-5p, -363, -422a, -486-5p, -490-3p, -628-3p, -628-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5p og -3656 (tabel 2 ). Dette understreger potentialet i high throughput sekventering som et redskab til at identificere Mirs potentielt relateret til carcinogenese der kunne have været savnet hjælp vifte baseret teknologi.

MIR-7 har en funktionel rolle i differentieringen af ​​epitelceller i tarmen , revideret af Tazawa

et al

. [46]. Det menes at regulere ekspressionen af ​​transmembrane glycoprotein CD98, som har en vigtig rolle i celleadhæsion gennem interaktion med integrin beta-1. Opregulering af MIR-7 undertrykker CD98-ekspression i Caco2-BBE celler og dermed modulerer beta-1-integrin-laminin-1 vekselvirkninger. Dette kan yderligere påvirke proliferation og differentiering af enterocytter under migration over krypten-villus aksen [47]. MIR-7 er blevet rapporteret til at fungere som en tumor-suppressor i schwannomas [48], men som et onkogen i lung pladecellecarcinomer [49]. Der er ny dokumentation, at forøget EGFR ekspression er forbundet med en øget MIR-7 niveau, i det mindste i skælcellecarcinomer. MIR-7 til gengæld henvender ETS2 repressor faktor (ERF), dæmper EGFR og modulerer cellevækst [49]. Det er derfor muligt, at MIR-7 kan fungere i flere feedback og feedforward sløjfer, både som tumor-suppressor og onkogen afhængigt tumortype. Vores resultater antyder kraftigt, at MIR-7 opreguleres i både kolorektale adenocarcinomer og i neuroendokrine tilfældet. Baseret på tidligere resultater og offentliggjort validerede mål for miR-7 som

EGFR

,

PAK1

,

RAF1, IRS1 /2

og

CD98

[ ,,,0],31], er det rimeligt at hypotesen, at denne miR kan være involveret i regulering af intracellulær signalering, vækst og differentiering af tarmkræft.

De udtryk for miR-96, miR-135b og miR-493 blev forøget i flere undersøgelser af kolorektal cancer, samt i vores undersøgelse [14], [17], [50]. MIR-135 har vist sig at direkte målrette 3’UTR af

APC

og inducere nedstrøms Wnt pathway [51]. Vores resultater viser også, at MIR-552 og -592 udtryk blev forhøjet i adenocarcinomer sammenlignet med normale væv. Tidligere publicerede data for disse to Mirs demonstrerede en opregulering i tarmkræft med dygtige mismatch reparation status (MFR), men nedregulering i MMR mangelfulde tumorer i forhold til normal colon væv [17]. Yoon

et al

observeret, at MIR-296 interagerede med 3’UTR af

CDKN1A

(p21 /WAF1) genet, og at denne miR var ofte opreguleres under immortalisering af humane celler [52]. Interessant, vi også observere en opregulering af miR-296-3p. Dette miR kunne som sådan bidrage til carcinogenese ved at hæmme p53-p21 /WAF1 vej.

Der er ikke mange publikationer om funktionen af ​​miR-549 (Chr15 i

KIAA1199

), og til vores viden ingen i forhold til colorektal cancer. Interessant er det gen omskriver denne miR lokaliseret i

KIAA1199

gen. Dette gen af ​​ukendt funktion er tidligere blevet rapporteret at være stærkt opreguleret i kolorektale adenomer (n = 32) og carcinomer (n = 25) blev analyseret i en undersøgelse af Sabates-Bellver

et al

. Undersøgelsen viser også, at ekspressionen af ​​19 Wnt mål var nært korreleret med opregulering af

KIAA1199

, og at udtrykket i normal slimhinde var begrænset til celler i den nedre del af colon krypter [53], [ ,,,0],54]. Den overekspression af

KIAA1199

er senere blevet bekræftet for colon adenomer [55] og mavekræft [56]. Hvis

KIAA1199

og miR-549 er co-transskriberet, kan dette forklare den øgede ekspressionsniveauer af miR-549 findes i vores undersøgelse. Desuden, som opregulering synes at være en tidlig begivenhed fra tidligere offentliggjorte undersøgelser, at miR-549 potentielt kunne være et surrogat biomarkør for adenom udvikling og tidlige adenocarcinom stadier. Dette bør undersøges nærmere i større studier.

En undersøgelse af epigenetisk tavshed Mirs i kolorektal cancer fandt, at miR-1247 blev methyleret i HCT116 celler. HCT116 og DLD1 celler blev derefter transficeret med en MIR-1247 mimic hvilket resulterede i et signifikant fald i cellevækst og metabolisk aktivitet i begge cellelinier. DKO celler (HCT 116 celler slettet for DNA methyltransferase) gjorde dog ikke formindske cellevækst når introduceret til mimic, men forårsagede nedsat celle migration [57]. Rollen af ​​denne miR stadig uklart, men det er blevet antaget at fungere som en tumorsuppressor. Vi fandt denne miR at være opreguleret i adenocarcinomer, som kunne tyde på forskellige mål i de rene cellelinjer sammenlignet med en organiseret tumorvæv.

Endelig er der få, om nogen, rapporter om funktionen og rolle i colon adenokarcinomer fra følgende Mirs up-reguleret i vores undersøgelse: -105, -483-3p, -584, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -3180-3p og -4326 (tabel 2).

som vi inkluderet en neuroendokrin tumor (NET) i denne undersøgelse, kunne vi drage fordel af at analysere denne separat med en tilsvarende statistisk metode som for adenokarcinomer. Selv om vi er delvist arbejder uden replikater kan DESeq værktøj håndtere denne udfordring [25]. NET er sjældne tumorer, der stammer fra neuroendokrine celler på forskellige steder i kroppen, herunder mave-site. Der er en stigende forekomst, dels på grund af en bedre registrering og eventuelt bedre diagnostiske værktøjer [58]. Imidlertid har meget få studier undersøgt miR udtryk i NET. I vores undersøgelse, de NET aksjer et par væsentlige Mirs med adenocarcinomer, men hvad er mere slående er nogle af de unikke og højt udtrykte Mirs (tabel S2). Disse har store fold ændringer sammenlignet med ikke-parrede normale væv og også en højere relative ekspression sammenlignet med de adenocarcinomer. Udtrykket mønster af Mirs i NET adskiller udstrakt fra den normale slimhinde. Dette kan naturligvis være delvis skyldes den neuroendokrine væv selv som er funktionelt og genetisk forskellige fra normalt epitel og stroma. Ikke desto mindre kan den identificerede Mirs potentielt hjælpe skelne mellem maligne neuroendokrine celler i tyktarmen og normal mucosa (som vores data antyder), og muligvis også mellem godartede neuroendokrine celler og normale slimhinder (ingen data). Prøven størrelse på én betyder, at NET data kun kan betragtes som vejledende. Men efter vores mening, de betydelige forskelle i sæt af forskelligt regulerede Mirs mellem de to typer af kræft fortjener, der skal indberettes. Vores observation tyder på, at det kan være frugtbart for yderligere at undersøge disse MIR markører, da de kan være nyttige for at fastslå oprindelsen af ​​dårligt differentierede kolorektal kræft.

mikrodissektion af tumorvæv har ikke været standard i undersøgelser, der tidligere udført. Vi har dog undersøgt histopatologi af vævsprøver, og anslået tumor og stromale procenter. Tumoren procent var omkring 67% i gennemsnit, et godt stykke over gennemsnittet for en undergruppe af KAM kohorten (n = 139), som var 49% +/- 24% (data ikke offentliggjort). Desværre, en prøve i datasættet var afvigende med en lav tumor procentdel (tabel 1), og dette er en svaghed i vores undersøgelse. Ideelt set bør undersøgelsen prøver have haft en mere homogen tumor befolkning. Der er imidlertid en forestilling om, at den normale slimhinde består hovedsageligt af epitelceller og stroma. Ved sammenligning tumorvævet og normal slimhinde, er vi primært sammenligne tumorceller (med varierende mængder af stroma) med epitelceller og stroma i den normale slimhinde. Som sådan mener vi effekten af ​​en for lav tumor procentdel vil være falsk negative resultater.

I high-throughput eksperimenter (uanset matrix eller sekventering baseret), er det almindeligt at udføre en validering eksperiment bruger en anden teknologi. Vi udførte en sådan validering forsøg under anvendelse af en kvantitativ polymerase-kædereaktion for udvalgte Mirs og vævsprøver (figur S1). Resultaterne viser en positiv sammenhæng mellem de to forskellige teknologiske platforme. Der er syv Mirs for hvilke fold ændringer er meget forskellige i valideringen. Sådanne forskelle i fold skift mellem teknologiplatforme er ikke usædvanligt, hvilket fremgår af en undersøgelse af forskellen miR udtryk ved hjælp af Affymetrix, Agilent, og Illumina microarray platforme, samt kvantitativ PCR og high-throughput sekventering [28]. Selv bekymring, er denne iagttagelse ikke afkræfte de opnåede resultater. Faktisk er det blevet observeret, at fremgangsmåder til miR genekspressionsprofilering er stærkt forspændt mod visse Mirs, forhindrer nøjagtig bestemmelse af absolutte tal. Den observerede skævhed er stærkt bestemt af den anvendte metode til biblioteket forberedelse. Men da fordomme er systematisk og meget reproducerbar for en given teknologi, er genekspressionsprofilering velegnet til bestemmelse relative ekspressionsniveauer forskelle mellem prøver, så længe den samme teknologi bruges på tværs prøver [23]. I vores undersøgelse, på grund af de store mængder af cDNA nødvendig for high-throughput sekventering analyse, vi har ikke tilstrækkelig cDNA rådighed for kvantitativ PCR validering for alle patienter. Vi måtte derfor gøre en anden runde af RNA ekstraktion fra tilstødende væv hvor det er muligt. Enhver heterogenitet mellem de tilstødende væv kan føje til variation hos validerings- data (figur S1).

Denne undersøgelse er vores viden enestående i, at globale high-throughput sekventering har været brugt til at karakterisere miR udtryk i parret colorectal cancer væv og tilstødende normale slimhinde. Selvom foreløbig, mener vi, at resultaterne kan anvendes som et solidt træningssæt for en større kohorte undersøgelse. Vi udnyttet parret og ikke-parrede statistik, og identificerede 37 Mirs der er dysreguleret i de syv adenocarcinom sager i både statistiske metoder; 19 nedreguleret og 18 opreguleret. Vores omfattende undersøgelse af differentielt udtrykte Mirs bekræfter nogle af de eksisterende resultater. Vi har også opdaget 16 dysregulerede Mirs der, så vidt vi ved, er ikke tidligere blevet associeret med kolorektal carcinogenese. Vores resultater tyder på, at disse kan være vigtige regulatorer og at yderligere undersøgelser af potentielle MIR mål og deres mulige anvendelse som prædiktive eller prognostiske markører er berettiget. Særligt interessant er miR-549-genet placeret i

KIAA1199

som selv tidligere har været forbundet med opregulering i colon adenomer og karcinomer. Hvis miR er co-transskriberet, kunne det være en potentiel surrogat markør for tidlig påvisning af sygdommen i kropsvæsker eller afføring. Undersøgelsen har også kastet nyt lys over potentielle MIR biomarkører, der synes at være specifik for NET i tyktarmen.

Materialer og metoder

Kohorte

Otte kolorektal cancer patienter blev udvalgt fra en norsk kolorektal cancer kohorte (

Kolorectalcancer, arv og miljø,

KAM) baseret på parametrene alder og køn. Alle patienter var mænd med en gennemsnitsalder på 60 år. Alle vævsprøver blev ekstraheret fra kirurgiske prøver. Den normale slimhinde blev opsamlet i en distal del af tarmen tæt resektionsrandene. Prøver blev efterfølgende nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret i en fryser ved -80 grader Celsius. Syv af patienterne blev bekræftet at have adenokarcinomer og en blev karakteriseret som et Neuroendokrin tumor ved histopatologisk undersøgelse. Kliniske og histopatologiske karakteristika for de patienter er opsummeret i tabel 1.

RNA-ekstraktion og Digital Sequencing

Totalt RNA fra patienterne blev ekstraheret fra 10 frosne snit af 10 um for tumor og normalt væv henholdsvis ved hjælp af Mirvana kit (Ambion, TX, USA) ifølge producentens protokol. Nogle prøver blev koncentreret i et vakuum centrifuge at opnå den nødvendige koncentration på 1 pg /pl. Tilstedeværelsen af ​​små RNA blev bekræftet på en Bioanalyzer 2100 (Agilent, CA, USA) uden tegn på nedbrydning, når de evaluerer OD-forholdet 260/280. Grundbeløbet var 10 ug totalt RNA, og præparatet protokol blev udført ifølge producentens anbefalinger. Lille RNA blev isoleret fra totalt RNA på en 15% Novex TBE-Urea PAGE gel. Området repræsenterer band størrelse på 18-30 nucleotider (nt) blev skåret ud og fragmenteret blev RNA elueret i 0,3 M NaCl og renset på en Spin X-søjle. 5′-adaptor blev ligeret i 6 timer ved 20 ° C. Lille RNA med ligeret 5′-adaptor blev isoleret på en 15% Novex TBE-Urea PAGE gel (Invitrogen, CA, USA).