PLoS ONE: Promotor Hypermethylering medieret nedregulering af FBP1 i Human hepatocellulært carcinom og tyktarmskræft

abstrakt

FBP1, fructose-1,6-bisphosphatase-1, en glukoneogenese regulatorisk enzym, katalyserer hydrolysen af ​​fructose-1,6-bisphosphat til fructose-6-phosphat og uorganisk phosphat. Mekanismen, at det fungerer til at antagonisere glykolyse og blev epigenetisk inaktiveret gennem NF-kappaB pathway i gastrisk cancer er blevet rapporteret. Men stadig ukendt sin rolle i leveren carcinogenese. Her undersøgte vi ekspressionen og DNA-methylering af FBP1 i primære HCC og colon tumor. FBP1 blev ringe udtrykt i 80% (8/10) humant hepatocellulært carcinom, 66,7% (6/9) liver cancer cellelinjer og 100% (6/6) coloncancer-cellelinjer, men var højere i parrede tilstødende ikke-tumorvæv og immortaliserede normale cellelinier, som var godt korreleret med dets promotor status for methylering. Methylering blev yderligere påvist i primære HCCs, mave- og tyktarmskræft tumorvæv, men ingen eller lejlighedsvis i parrede tilstødende ikke-tumorvæv. Detaljeret methylering analyse af 29 CpG sites på et 327-bp promotorregion af bisulfit genomisk sekventering bekræftet sin methylering. FBP1 lyddæmpning kunne vendes ved kemisk demethylering behandling med 5-aza-2′-deoxycytidin (Aza), hvilket indikerer direkte epigenetisk inaktivering. Gendannelse FBP1 udtryk i lave udtrykte celler betydeligt hæmmet vækst og koloni celle dannelse evne gennem induktion af G2-M-fasen cellecyklusstop. Endvidere er de observerede virkninger var sammenfaldende med en stigning i reaktive oxygenarter (ROS) generation. Sammenfattende epigenetisk inaktivering af FBP1 er også almindelig i human lever og tyktarmskræft. FBP1 synes at være en funktionel tumor suppressor involveret i leveren og colon carcinogenese

Henvisning:. Chen M, Zhang J, Li N, Qian Z, Zhu M, Li Q, et al. (2011) Promotor Hypermethylering medieret nedregulering af FBP1 i Human hepatocellulært carcinom og tyktarmskræft. PLoS ONE 6 (10): e25564. doi: 10,1371 /journal.pone.0025564

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: Juni 13, 2011; Accepteret: September 5, 2011; Udgivet: 19 oktober 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra programmet Major Videnskab og Teknologi Special Project Kina ellevte femårsplan (nr 2008ZX1002-004), den kinesiske stat Basic Research Foundation Grant (2007CB512904), Shanghai Sci og Tech Research program (08JC1403900), og for Outstanding Medical Academic leder af Shanghai (08GWD19). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er fortsat den tredje hyppigste årsag til kræft død på verdensplan, og den anden mest almindelige malignitet i Kina. Den molekylære patogenese HCC forbliver stort set ukendt. Det er blevet en hypotese, at udvikling og progression af HCC er en følge af kumulative genetiske og epigenetiske begivenheder. CpG hypermethylering fungerer som en alternativ mekanisme til gen-inaktivering, og det er nu anerkendt som en vigtig mekanisme under tumor initiering og progression, herunder leverkræft [1], [2]. Det er vigtigt og spændende at identificere nye gener tavshed ved promotor hypermethylering i leverkræft, fordi afvigende tumorsuppressorgen (GTS) hypermethylering er både en mekanisme og en biomarkør for tumorigenese [3].

FBP1, fructose-1, 6-bisphosphatase 1, en glukoneogenese regulatorisk enzym, katalyserer hydrolysen af ​​fructose-1,6-bisphosphat til fructose-6-phosphat og uorganisk phosphat. Fructose-1,6-diphosphatase mangel er forbundet med hypoglykæmi og metabolisk acidose. Det blev rapporteret [4], at FBP1 som tjener til at antagonisere glycolyse blev nedreguleret gennem NF-kappaB pathway i Ras-transformerede NIH3T3-celler. NF-kappaB funktioner nedstrøms for Ras at fremme epigenetisk nedregulering af FBP1. Inhibering af NF-kappaB omvendt promotor methylering-medieret FBP1 nedregulering. Desuden promotor methylering af FBP1 var relevant for gastrisk carcinogenese, for eksempel blev køn, TNM stadier og overlevelse signifikant associeret med FBP1 promoter methylering. Desuden blev det undersøgt [5], at FBP1 promotor methylering bidrager til nedsat ekspression af FBPase i brystcancer. Når ikke-maligne og maligne vævsprøver fra den samme patient blev sammenlignet en sammenhæng mellem en forøgelse af FBPase-promotor-methylering og et fald på FBPase mRNA niveauer blev observeret. Dog ingen resultater vist for FBP1 epigenetisk inaktivering i leveren carcinogenese.

Reaktive ilt arter (ROS), kemisk reaktive molekyler, der indeholder ilt, herunder ilt-ioner og peroxider, er de vigtigste formidlere af cellulær oxidativ stress og redox dysregulering involveret i kræft initiering og progression. Det er nu almindeligt accepteret, at konstitutivt forhøjede niveauer af cellulær oxidativ stress og afhængighed af mitogen og anti-apoptotiske ROS-signalering i cancerceller er involveret i carcinogenese. Paradoksalt nok bortset fra at være involveret i proliferativ, anti-apoptotiske, metastatisk og angiogen signalering, ROS kan også udøve cytotoksiske og proapoptotiske funktioner, ville begrænse tumorigenicitet og malign progression [6], [7]. FBP1 er et multifunktionelt protein, der er, ud over sin funktion i glukoneogenese, er involveret i ROS produktion efter behandling med MMS eller i kronologisk alderen celler [8]. I mangel af FBP1 celler overlever MMS behandling bedre og endda formere efter langvarig behandling. Dette kunne være resultatet af reduceret produktion af ROS observeret i ΔFBP1 mutanten som reaktion på alkyleringsmidlet methylmethane sulfonat (MMS) behandling og aldring. Manglende FBP1 forbedret overlevende af ældede celler i fuld medium og resulterede i en forsinket induktion af ROS-produktion. Overekspression af FBP1 reduceret evnen til at danne kolonier selv for ubehandlede kulturer, kortere levetid og øget induktion af RNR2 promotor efter MMS behandling.

Her viste vi, at FBP1 undergik promoter CpG hypermethylering-associeret lyddæmpning i menneskelig lever og tyktarmskræft. Analysen af ​​lever og tyktarmskræft cellelinjer og væv viste, at FBP1 hypermethylering var en fælles begivenhed i human lever og tyktarmskræft. Vi viste også, at FBP1 fungerer som en TSG at undertrykke cancercellevækst gennem induktion af G2-M-fasen cellecyklusstandsning og en stigning i ROS-generering niveauer. Epigenetiske ændringer i cellulær redox homeostase og ROS niveauer vil påvirke levedygtigheden gennem redox modulation af mitokondrie permeabilitet overgang pore åbning, der fører til cytochrom C frigivelse, apoptosome montering og aktivering af bøddel caspaser, hvilket er understøttende for ROS-rettet cancer kemoterapeutika.

Materialer og metoder

cancer cellelinjer, Primær tumorvæv og RNA /DNA ekstraktion

Ni menneskelige leverkræft cellelinjer (HepG2, Hep3B, Huh7, HCC-LM3, BEL-7402, SMMC-7721, blev Sk-HEP1, MHCC-97h og MHCC-97L), der anvendes til HCCs analyse. En udødeliggjort normale human lever cellelinier L02 blev brugt som “normale” kontroller til HCCs analyse. Seks humane coloncancer-cellelinjer (HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo og RKO) blev anvendt til tyktarmskræft analyse og humane normale voksne colonvæv blev anvendt som “normale” kontroller. Alle cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Va., USA). Medmindre det specifikt er angivet, celler blev dyrket i DMEM-medium (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO

2 og 95% fugtighed. For farmakologisk demethylering blev celler behandlet med 5 uM 5-aza-2′-deoxycytidin (Aza) (Sigma, St. Louis, Mo., USA) i 3 på hinanden følgende dage. Dyrkningsmediet blev skiftet hver 24. time. En tilsvarende koncentration af vehikel (DMSO) blev anvendt som kontrol

Primære HCCs blev opnået fra patienter leverkræft i Huashan Hospital på tidspunktet for kirurgi.; matchede ikke-tumor prøver fra patienter leverkræft blev også opnået mindst 2 cm fjernt fra tumoren. Ikke-tumor dele blev trimmet væk fra de frosne tumorblokke og de udvalgte tumor områder havde mere end 80% tumorceller som bekræftet ved histologi. Menneskelig gastrisk, colon tumorvæv og normale voksne colon væv blev leveret af kinesisk medicin Hospital i Zhejiang. Alle patienter gav informeret samtykke til opnåelse undersøgelsen prøver.

Total RNA og genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Total RNA og DNA-koncentrationer blev kvantificeret ved NanoDrop 1000 (NanoDrop, Wilmington, Del., USA).

Real-Time RT-PCR

En revers transkriptionsreaktion blev udført under anvendelse af 1 ug totalt RNA med høj kapacitet cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA). MRNA ekspressionsniveauer af FBP1 blev bestemt af Real-Time RT-PCR ved hjælp SYBR Green Master Mix Kit og ABI 7500 Real-Time RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Californien., USA). Glyceraldehyd-3- fosfat dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en intern kontrol af RNA integritet. Real-Time RT-PCR blev udført tre gange. Primere anvendt til FBP1 var:. FBP1-F 5′-ATCCCCTTGATGGATCTTCC-3 ‘og FBP1-R 5′-TCCAGCATGAAGCAGTTGAC-3’ (208 bp produkt)

bisulfitbehandling af DNA og methyleringsspecifik PCR

Genomisk DNA blev behandlet med bisulfit med Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, Calif., USA) ifølge protokollen tilvejebragt. Methylering-specifik PCR (MSP) blev udført i 40 cykler med annealing temperatur ved 60 ° C. Methylering-specifikke primere var: FBP1-MF 5′-TGAAGATTTAAGTAGGCGGAGTC-3 ‘og FBP1-MR 5′-ATAAACACTAACCG CAAATACGAA-3′, og unmethylation-specifikke primere var: FBP1-UF 5’-GAAGATTTAAGTA GGTGGA GTTGTG-3 ‘og FBP1 -ur 5’-CTAACAAAAAAACTAACAAACCAAC-3 ‘

Bisulfite genomisk sekventering

Bisulfite-behandlede genomisk DNA blev opformeret ved hjælp bisulfit genomisk sekventering (BGS) primere, FBP1-BF:. 5′-TGATTTTGGAGGAAATAGTTATAGTTTTT- 3 ‘og FBP1-BR: 5′-TAATACAACTAAACCAAACCAAAC-3’. PCR-produkterne blev renset med ILLUSTRERET GFX ™ PCR og gel band rensning kit (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sverige) og klonet ind pCR4-TOPO vektor til sekventering (Invitrogen). Mindst fire kolonier blev tilfældigt udvalgt til plasmid ekstraktion og sekventering analyse ved hjælp af ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit i ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems).

Konstruktion af FBP1 udtrykker Vector

FBP1 udtrykkende vektor blev konstrueret ved kloning af FBP1 åbne læseramme i fuld længde i mammale ekspressionsvektor pcDNA3.1. Fuldlængde FBP1 åbne læseramme blev amplificeret fra normale mave-cDNA ved hjælp af high-fidelity PFU DNA-polymerase (Invitrogen). Primerne anvendt til kloning var FBP1-CF: 5′-CGGAATTCCGATGGCTGACCAGGCGCCCTTCGA-3 ‘og FBP1-CR: 5′-GCAAGCTTCCTGGGCAGAGTGCTTCTCATACACC-3’ accomp- anied med dobbelt enzym skæringssteder EcoRI og Hind III. Sekvensen og orienteringen af ​​insertet blev bekræftet ved DNA-sekventering.

kolonidannelse Assay Salg

humanlever cancerceller transient transficeret med pcDNA3.1 tom vektor eller pcDNA-FBP1 udtrykkende vektor blev anvendt til monolag kolonidannelse assayet at vurdere cellulær vækst in vitro. Celler blev dyrket natten over i en 12-brønds plade (5 x 10

5 celler /brønd) og transficeret med pcDNA3.1 tom vektor eller pcDNA-FBP1 udtrykkende vektor ved anvendelse FuGENE 6 (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Otteogfyrre timer senere blev transfektanterne genudpladet i tre eksemplarer og dyrket i 10~15 dage i komplet DMEM-medium indeholdende G418 (400 ug /ml). Overlevende kolonier blev farvet med ensianviolet efter methanol fiksering og synlige kolonier (≥ 50 celler) blev talt. Forsøgene blev gentaget tre gange.

Cell Growth Assay

Celler vækst blev bestemt ved en ikke-radioaktiv proliferation assay baseret på evnen hos metabolisk aktive celler til at konvertere 3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl) -5 (3-carboxymethonyphenol) -2 – (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) i formazan. Overlevende celler efter G418-selektion blev genudpladet i en 96-brønds plade med forskellige celleantal og dyrket i komplet DMEM-medium indeholdende G418 (400 ug /ml) i yderligere 72 timer. Mængden af ​​formazan blev målt som ovenfor. Mængden af ​​formazan blev målt ved 490 nm absorbans efter en time inkubation med CellTiter 96 vandig One Solution Reagent følge instruktionerne.

Cell Cycle Analysis og Bestemmelse af ROS Production

Overlevende celler efter G418 udvælgelse blev trypsinbehandlet, vasket i phosphatbufret saltvand, og fikseret i iskold 70% ethanol-phosphatbufret saltvand. Efter udvaskning ethanol blev de fikserede celler behandlet med 0,01% RNase (10 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) i 10 minutter ved 37 ° C og derefter farvet med 0,05% propidiumiodid i 20 minutter ved 4 ° C i mørke. Fordelingen celle cyklus blev bestemt ved anvendelse af en FACScan flowcytometri (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) og analyseret med Modfit software (Phoenix, San Diego, CA, USA). Celler, som undergår apoptose blev påvist som sub-G1 population på grund af tab af fragmenteret DNA. Salg

ROS-niveauer blev målt ved anvendelse af 2′-7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) (Invitrogen) i en flowcytometriassayet som beskrevet [9].

Statistik Analyse

resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Student

t

test blev anvendt til at sammenligne forskellene i FBP1 udtryk om effekten af ​​kolonidannelse og celleproliferation. Alle statistiske beregninger blev udført ved hjælp af SPSS-version 11.0 til Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL). Værdi af

P

. 0,05 blev taget som statistisk signifikans

Resultater

nedregulering af FBP1 i Human Liver og andre Digestive Kræft

udtryk for FBP1 blev dramatisk nedreguleret i 66,7% (6/9) human lever cancer cellelinjer, herunder HepG2, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97h og MHCC-97L (figur 1A) sammenlignet med humane normale leverceller LO2. Ligeledes downregualtion af FBP1 blev også fundet i 100% (6/6) menneskelige kolon kræft cellelinjer, herunder HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo og RKO (figur 1A) sammenlignet med humant normalt voksent colon væv. For at vide, om nedregulering af FBP1 bør tilskrives DNA methylering, udtryk for FBP1 i human lever og tyktarmskræft cellelinjer før og efter Aza behandling blev bestemt af Real-Time RT-PCR. Udtrykket af FBP1 var signifikant opreguleret i leverkræft cellelinier HepG2, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97h og MHCC-97L (6/9, 66,7%) efter Aza behandling (Figur 1B) og også i kolon cancer cellelinjer HT29, SW620, LoVo og RKO (4/6, 66,7%) (figur 1B), hvilket indikerer, at FBP1 sandsynligvis nedreguleres via promotor hypermethylering i human lever og tyktarmskræft.

(A) FBP1 udtryk i humane lever og tyktarmskræft cellelinjer og normale kontroller blev bestemt af Real-Time RT-PCR. GAPDH blev anvendt til at normalisere skabelonen beløb. (B) Relativ FBP1 udtryk før og efter Aza behandling blev bestemt af Real-Time RT-PCR. GAPDH blev anvendt til at normalisere skabelonen beløb. Det blev vist som gennemsnitlige fold ændringer ± SD.

methylering af FBP1 Promotor i Human Liver og tyktarmskræft

faktisk en typiske CpG Islands (CGI) blev fundet omkring FBP1 exon 1 bruger følgende kriterier: GC-indhold 55%, Obs CpG /Exp CpG 0,65, og længde 500 bp (figur 2A). status methylering af denne CGI i humane lever og tyktarm kræftceller blev bestemt ved MSP. Som vist i figur 2B blev methylering af FBP1 promotor let påvises i leverkræft cellelinier HepG2, HuH7, HCC-LM3, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97h og MHCC-97L, og human tyktarmskræft cellelinier HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo og RKO. Desuden BGS afslørede også, at FBP1 promotoren var stærkt methyleret i HepG2, Huh7, BEL-7402 celler og 8T tumorvæv, og ingen methylering blev dedtected i 8N tilstødende ikke-tumorvæv (figur 2C).

(A ) Skematisk struktur FBP1 CGI, med exon 1 og MSP og BGS region angivet. Hver kort, lodret linje repræsenterer en CpG site. Positionen af ​​MSP primere blev markeret som pile. status for methylering af FBP1 CGI blev analyseret ved MSP (B) og BGS (C). MSP = Methylering-specifik PCR; USP = Unmethylation-specifik PCR. For BGS i (C), hver cirkel angiver en CpG-stedet og cirkler udfyldt sort repræsenterer methylerede CpG sites. En række af cirkler repræsenterer en enkelt koloni.

Nedregulering og Promoter Hypermethylering af FBP1 i humane primære tumorvæv

For yderligere at bekræfte relevansen af ​​FBP1 promotor CGI hypermethylering i mediering af sin lyddæmpning i human lever, mave- og tyktarmskræft, FBP1 ekspression og promotor-methylering i primært hepatocellulært carcinom, gastriske og colon tumorvæv og tilstødende ikke-tumorvæv blev analyseret ved Real-Time RT-PCR og MSP hhv. FBP1 ekspression blev signifikant nedreguleret i 80% (8/10) humane lever tumorvæv, 100% (5/5) i gastrisk og 80% (4/5) colon tumorvæv (figur 3A) sammenlignet med tilstødende ikke-tumorvæv . Desuden blev promotor methylering ofte opdages ved hjælp af MFP i tumorprøver men ikke ikke-tumorvæv (figur 3B), hvilket indikerer, at nedregulering af FBP1 var involveret i carcinogenese af human lever og andre fordøjelsesforstyrrelser kræftformer.

( A) udtrykket af FBP1 i leveren, mave og tyktarm tumorvæv og tilstødende ikke-tumorvæv blev bestemt af Real-Time RT-PCR. 1~10 T /N: leverkræft, 11-15 T /N: mavekræft, 16~20 T /N: tyktarmskræft. (B) Status methylering af FBP1 promotor i primær leveren, blev gastrisk og kolon tumorvæv og tilstødende ikke-tumorvæv opdaget af MSP. Repræsentative resultater blev vist. 1~3 T /N: leverkræft, 4~5 T /N: coloncancer, 6~9 T /N: mavekræft. “T” angiver tumorvæv og “N” repræsenterer tilstødende ikke-tumorvæv.

FBP1 Overekspression Reduceret Cancer Cell kolonidannelse Evner og hæmmede væksten af ​​lever og Colon Cancer Cells

virkningen af ​​eksogent FBP1 ekspression på væksten af ​​human lever cancerceller blev undersøgt ved et monolag kolonidannelse assayet. For yderligere at undersøge den potentielle rolle FBP1 i tumor undertrykkelse, blev liver kræftceller SMMC-7721 og tyktarmskræft SW480 transficeret med pcDNA-FBP1 udtrykker vektor og cellen koloni dannelse evne blev undersøgt under udvælgelsen af ​​G418. Sammenlignet med kontrolceller transficeret med tom vektor pcDNA3.1, cancerceller transficeret med pcDNA-FBP1 udtrykkende vektor udviste nedsat kolonidannelse evne (figur 4B). Disse data antyder, at FBP1 kan spille en rolle i tumor suppression. Desuden blev FBP1 stabil ekspressionsniveauer i de celler, herunder SW480 og SMMC-7721 bekræftes også af Real-Time RT-PCR som vist i figur 4A.

(A) FBP1 ekspressionsniveau i den transfekterede SW480 og SMMC- 7721 celler blev bekræftet af Real-Time RT-PCR. (B) Virkningen af ​​ektopisk FBP1 ekspression på leverkræft cellevækst blev undersøgt ved monolag kolonidannelse assayet. Det scannede kolonidannelse i seks brønde blev vist i panelet .. (C) Væksten i lever og tyktarmskræft cellelinjer (SW480 og SMMC-7721) med og uden FBP1 udtryk blev bestemt med MTS cellevækst assay. Stabil ekspression af FBP1 undertrykkes væksten af ​​lever og colon cancerceller. Resultaterne blev vist som værdier af gennemsnit ± SD. P-værdier blev beregnet under anvendelse af Students t-test (* p 0,05).

Når pcDNA-FBP1 blev transficeret ind SW480 og SMMC-7721 celler, vækstinhiberende funktion FBP1 i disse celler blev bekræftet af MTS cellevækst assay. PcDNA-FBP1 udtrykkende vektor blev transficeret ind i disse celler, blev væksthastigheden af ​​humane lever og colon cancerceller efter FBP1 overekspression dramatisk reduceret i MTT cellevækst assay (p 0,05, figur 4C), der viser en vækst-undertrykkende virkning af FBP1 på kræftceller.

Ektopisk ekspression af FBP1 induceret G2-M Phase Arrest

for at bestemme den molekylære mekanisme, hvormed FBP1 undertrykte kolonidannelse og celleproliferation, undersøgte vi effekten af ​​FBP1 på cellecyklusfordeling . Efter propidiumiodidfarvning, fluorescens-aktiveret cellesortering analyse af FBP1 overudtrykt SW480 og SMMC-7721 celler viste en stigning i antallet af G2-M-fase celler og et fald i antallet af S-fase celler (Figur 5A og 5B).

cellecyklusfordeling af lever og coloncancercellelinie (SW480 og SMMC-7721) med og uden FBP1 ekspression blev vurderet ved flowcytometri analyse. (A) og (B) Repræsentant fluorescens -aktiverede cellesortering analyse af kræftceller transficeret med eller uden FBP1.

FBP1 Overekspression forøget intracellulær ROS Production

ROS niveauer er målt i cancerceller utransficerede og transficeret med pcDNA-FBP1 udtrykkende vektor. Eksogene FBP1 udtryk klart forøgede intracellulære ROS niveauer i SMMC-7721 og SW480-celler (figur 6A og 6B). Derfor FBP1 kunne øge ROS produktion som udøver cytotoksiske og proapoptotiske funktioner og begrænse tumorigenicitet og malign progression.

Virkningen af ​​ektopisk FBP1 ekspression på oxidativt stress blev bestemt ved flowcytometri assay som vist i (A) og (B ). Stabile celler blev farvet med DCFH-DA og derefter redoxtilstanden af ​​celler blev målt ved flowcytometri.

Diskussion

Flere og flere hidtil ukendte tumorsuppressorgener har vist sig at være inaktiveret ved promotor-hypermethylering. Promotor methylering blev derfor foreslået som en vigtig markør for identifikation af hidtil ukendte tumorsuppressorgener. I den aktuelle undersøgelse identificerede vi, at FBP1 blev ofte nedreguleret i 66,7% HCC cellelinjer og 100% coloncancer-cellelinjer (figur 1A), og i 80% primære HCCs, 100% gastriske tumorer og 80% colontumorer (figur 3A). Hypermethylering blev yderligere påvist i 66,7% HCC-cellelinier og 100% coloncancer-cellelinjer (figur 2B), og også i primære tumorvæv (figur 3B). I modsætning hertil blev FBP1 hypermethylering næppe påvises i normale liver cellelinier og lejlighedsvis i parrede tilstødende ikke-tumorvæv, hvilket antyder en vigtig rolle af FBP1 i patogenesen af ​​leveren og andre fordøjelsesforstyrrelser kræftformer. Vi påviste yderligere, at behandling med demethyleringsreagenset Aza opreguleres FBP1 ekspression i ringe udtrykte cancerceller (figur 1B), og status for methylering blev bekræftet ved genomisk sekventering, hvilket indikerer, at DNA-hypermethylering medieret FBP1 inaktivering.

I kræft, den dynamikken i genetisk og epigenetisk gendæmpning er meget forskellige. Somatisk genetisk mutation fører til en blok i produktion af funktionelt protein fra mutante allel. Hvis en selektiv fordel gives til cellen, cellerne udvider klonalt at give anledning til en tumor, hvor alle celler mangler evnen til at producere protein. I modsætning hertil epigenetisk medieret gen-nedregulering sker gradvist. Det begynder med en subtil fald i transskription, fremme et fald i beskyttelse af CpG øen fra spredningen af ​​flankerende heterochromatin og methylering i øen. Dette tab resulterer i gradvise forøgelser af individuelle bindingssteder for CpG, som varierer mellem kopier af det samme gen i forskellige celler. For eksempel blev højere FBP1 detekteret i Huh7 og HCC-Lm3 celler med højt methylering niveau i promotorregionen (figur 1A og 2B). Selvom promotor methylering ofte inaktiveret FBP1 i humane lever- og tyktarmskræft cellelinjer, kan vi ikke udelukke inddragelse af andre mekanismer, der er ansvarlige for FBP1 nedregulering, såsom fejl i histon remodeling. For eksempel, i Hep3B, Huh7, HCC-LM3, SW480 og HCT116 celler, FBP1 promotoren ikke fuldt opreguleret efter Aza behandling (figur 1B).

Desuden skal tjene som ny markør til at definere hidtil ukendte tumorsuppressorgener, kan promoter hypermethylering også anvendes som en følsom markør for cancer diagnose og prognose forudsigelse [10], [11]. Desværre, på grund af manglende stort antal tumorvæv, vi kunne ikke teste FBP1 methylering i rigelige væv og yderligere analysere sit samarbejde med de kliniske karakteristika, såsom alder, køn, tumor kvalitet og overlevelse. Vi var nødt til at bestemme FBP1 udtryk og methylering status på kun 10 par primær HCCs, 5 par gastrisk tumorvæv og 5 par kolon tumorvæv (figur 3), hvilket antyder, at FBP1 fungerer som en ny tumor suppressor kandidat nedreguleres via promotor hypermethylering i lever og tyktarmskræft. Det er også den første rapport, der viser, at FBP1 epigenetisk er bragt til tavshed i human lever og tyktarm carcinogenese. Når FBP1 promotor methylering blev påvist ved en høj frekvens i primære carcinoma væv, men ikke ikke-tumor normale gastriske væv, kan FBP1 promotor methylering være en potentiel biomarkør for kræft diagnose.

Som vist i figur 4, genoprettelse af FBP1 ekspression markant undertrykt vækst kræftceller. Men den underliggende molekylære mekanisme bag FBP1 fungerer som en tumor suppressor fortsat ukendt. Det er blevet bekræftet [4], at FBP1 funktioner til at modvirke glykolysen. Som det er velkendt, cancerceller har en højere aerob glycolyse, men ikke oxidative fosforylering. Fructose-1,6-bisphosphat er en af ​​de vigtigste mellemprodukter i glykolyse og dens niveau hovedsageligt kontrolleres af fructose-6-fosfat-kinase og fructose-1,6-bisphosphatase. Det blev konstateret, at produktionen af ​​lactat efter FBP1 ekspression blev signifikant reduceret, hvilket viser undertrykkelsen af ​​aerobe glycolyse af FBP1. Desuden cellecykluskontrolpunkter er vigtige kontrolmekanismer, der sikrer den korrekte udførelse af cellecyklus begivenheder. Væksten suppression induceret af ektopisk FBP1 ekspression synes at være forårsaget af standsning af cellecyklus da antallet af celler med cellecyklus blokering (G2-M fasen) blev forøget efter FBP1 re-ekspression (figur 5).

i lang tid blev ROS anset onkogene siden det blev impliceret i kræft progression og metastase. Vedvarende oxidativ stress har været forbundet med mammacancer og mange epitel kræftformer såsom kolon og halscancer [12]. Imidlertid har talrige undersøgelser vist den forårsagende inddragelse af ROS-dannelse i mediering af cancercelle apoptose induceret af forskellige kemoterapeutiske standardmidler herunder paclitaxel, cisplatin, bortezomib og etoposid. Bemærkelsesværdigt er det blevet påvist, at cisplatin apoptogenicity afhænger dannelse af ROS og forekommer uafhængig af DNA-skader nukleare, hvilket antyder, at apoptogenic oxidativ stress er den afgørende mekanisme af cisplatin-induceret celledød [13]. Ud over at forårsage standsning af cellecyklus ved S-fasen, vigtigst i denne undersøgelse, kan den vækstinhiberende virkning af FBP1 som tumorsuppressor også være medieret gennem at øge produktionen af ​​intracellulær ROS (figur 6). Vores resultater var i overensstemmelse med de tidligere offentliggjorte oplysninger [8] viser fructose-1,6-bisphosphatase medierer cellulære reaktioner på DNA-skader og aldring i Saccharomyces cerevisiae. Men hvor ROS udøve cytotoksiske og proapoptotiske funktioner, der vil begrænse tumorigenicitet og malign progression, blev det foreslået, at ændringer i cellulær redox homeostase og ROS-niveauer vil påvirke levedygtigheden gennem redox modulering af mitokondriel permeabilitetsovergang pore åbning, der leder til cytochrom c-frigivelse, apoptosome samling, og aktivering af bøddel caspaser, hvis cellulære ROS niveauet når en vis tærskel uforenelig med cellulære overlevelse [7], [14].

sammenfattende fandt vi, at FBP1 ofte reduceres med promotor hypermethylering i de fleste lever og tyktarm cancer cellelinjer og primære tumorvæv. Vores resultater antydede, at epigenetisk inaktivering af FBP1 var en vigtig faktor i human lever og colon carcinogenese. Vi viste også, at promotor hypermethylering-medieret inaktivering af FBP1 kunne vendes ved farmakologisk demethylering og restaurering af FBP1 undertrykt tumorcellevækst gennem induktion G2-M-fasen cellecyklusstandsning og en stigning i ROS-generering. Derfor vil det være værdifuldt at undersøge mulighederne for anvendelse af FBP1 som en molekylær markør til påvisning og behandling af disse maligne sygdomme.

Tak

Vi takker Mr. Wang Cheng for nyttige diskussion og teknisk hjælp. Vi takker også Mr. Jiang Jiukun for at give MHCC-97h og MHCC-97L HCC cellelinjer og Dr. Chen Qian for at levere menneskelige gastriske og tyktarmskræft væv.