PLoS ONE: Hypoxi-Inducerbar MIR-210 er en uafhængig Prognostisk Factor og Bidrager til Metastase i kolorektal Cancer

Abstrakt

MicroRNA-210 (miR-210), master hypoxamir, spiller pleiotrope roller i visse kræftformer ; men dens rolle i udviklingen af ​​human colorektal cancer stadig uklar. Heri rapporterer vi, at miR-210 er ofte opreguleret i kolorektale cancer væv, med høj miR-210-ekspression signifikant korrelerer med stor tumorstørrelse, lymfeknude metastaser, avanceret klinisk fase og dårlig prognose. Funktionelt, miR-210 overekspression fremmer migration og invasion af kolorektal cancer celler. Endvidere kan MIR-210 induceres af hypoxi og medierer hypoxi-induceret metastase af kolorektale cancerceller. Desuden er vacuole membranprotein 1 (VMP1) identificeret som det direkte og funktionelle mål for MIR-210. Således MIR-210 er en nyttig biomarkør for hypoxiske tumorceller og prognostisk faktor, der spiller en væsentlig rolle i colorektal cancer metastase

Henvisning:. Qu A, Du L, Yang Y, Liu H, Li J, Wang L, et al. (2014) Hypoxi-inducerbare MIR-210 er en uafhængig Prognostisk Factor og Bidrager til Metastase i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (3): e90952. doi: 10,1371 /journal.pone.0090952

Redaktør: Fabio Martelli, IRCCS-Policlinico San Donato, Italien

Modtaget: September 19, 2013; Accepteret: 6 feb 2014; Udgivet: 14. marts 2014

Copyright: © 2014 Qu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.271.916, 81.301.506); Shandong-provinsen Natural Science Foundation of China (nr ZR2010H004); Forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina (nr 20120131110055) og National Key Clinical Medical Specialties fundament. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er fortsat den tredje mest almindelige malignitet i hele verden og tegner sig for den femte hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i Kina [1]. Selv om de seneste forbedringer i diagnostiske teknikker og klinisk ledelse har øget tidlig påvisning af CRC og faldt dødeligheden, ca. 25% af CRC patienter til stede med stadie IV sygdom [1]. Endvidere patienter med fremskreden sygdom ofte udvikle tilbagevendende sygdom som følge af forlænget radikale resektioner dermed viser ekstremt dårlige overlevelsesrater grund metastase [2], og det 5-årige postsurgical overlevelsesrate falder fra 90% til 10% eller endnu mindre efter metastase er opstået . Et stigende antal undersøgelser har vist, at både tumorceller og mikro-miljø faktorer iscenesætte de kritiske begivenheder, der fører til metastase [3], hvilket understreger behovet for yderligere at forstå tumor mikromiljø og molekylære mekanismer, der er involveret i tumor metastase.

Hypoxi eller lav spænding oxygen, er et fælles træk ved fast tumor mikromiljø. Hypoksiske tumorer tendens til at være mere aggressiv, mere tilbøjelige til at metastasere, mere modstandsdygtige over for konventionelle behandlinger, og er forbundet med en dårlig prognose [4] – [6]. Genet, der koder HIF1 (hypoxi-inducerbar faktor-1), som er sammensat af de HIF1α og HIF1β underenheder, er måske den mest undersøgte gen, der spiller en væsentlig rolle i respons på hypoxi [7]. HIF1α er stabilt under hypoxiske betingelser, med dens udtryk hastigt faldende under normoxiske betingelser, hvorimod HIF1β udtrykkes konstitutivt under både [8] betingelser. Beviser er akkumulerende vedrørende betydningen af ​​HIF1α udtryk i forskellige solide tumorer [9] – [11], og øget HIF1α udtryk er for nylig blevet rapporteret at bidrage til kolorektal cancer metastaser [12], [13]

MikroRNA’er. (miRNA, Mirs) er en ny klasse af endogene, små, ikke-kodende RNA oligonukleotider, som regulerer genekspression ved at målrette den 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af den tilsvarende mRNA [14], [15]. Dysregulering af miRNA er en velkendt centrale proces i patogenesen af ​​mange cancerformer og kan forekomme på ethvert punkt, fra start til metastase. Der er en funktionel forbindelse mellem hypoxi og microRNA dysregulering i kræft. For eksempel har Chen H rapporteret, at MIR-103/107 blev forøget i nærvær af hypoxi og kunne bidrage til hypoxi-stimuleret metastase i CRC [16]. Mange microRNA, såsom miR-21, 93, 103, 107, 192, 195, 210, og 213, kan induceres og markant opreguleret af HIF1α i kræftceller under hypoxiske betingelser [17], [18]. Blandt de miRNA induceret af HIF1α, miRNA-210 er den mest fremtrædende og konsekvent opreguleret miRNA under hypoxiske respons i forskellige typer tumorceller og normale celler [19], [20]. For nylig, Ying et al. viste, at hypoxi-induceret miR-210 kunne øge migration og invasion af hepatocellulært carcinom (HCC) [21], og Redova og kolleger fandt, at nedregulering af miR-210 hæmmede vandrende og invasive potentiale renalcellecarcinom (RCC) [ ,,,0],22], Rothe rapporterede lignende resultater i brystkræft [23]. De fleste undersøgelser har vist, at MIR-210 kan virke som et onkogent miRNA og er forbundet med en dårlig prognose i nogle humane epiteliale cancere [21], [24] – [26]. Imidlertid har nogle undersøgelser vist, at miR-210 udtryk går tabt under tumorigenese og at miRNA udøver en tumor-suppressor virkninger for menneskers epitel æggestokkene og esophageal pladecellekræft [27], [28]. Disse data indikerer, at MIR-210 kan spille afgørende roller i tumorigenese og cancer progression og kan udøve forskellige effekter på forskellige kræftformer. Selv om det er blevet rapporteret, at MIR-210 udtrykkes og stærkt opreguleret som respons på hypoxi i CRC cellelinjer (HCT-116 og HT-29), hvis funktion MIR-210 i kolorektal cancer er ikke blevet belyst til dato, og dens rolle i kolorektal cancer progression fortsat uklart.

i den aktuelle undersøgelse har vi fokuseret på miR-210, den hypoxi-induceret miRNA, og undersøgt sit udtryk i humane CRC væv, analyseret dets overensstemmelse med klinisk-patologiske karakteristika og prognose, og derefter afslørede rolle miR-210 i hypoxi-induceret metastase i kolorektal cancer progression.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

Vævsprøver, herunder tumorvæv og tilstødende ikke-kræft væv, blev opnået fra 193 CRC patienter på tidspunktet for kirurgi ved Institut for Almen kirurgi, Qilu Hospital i Shandong University, Jinan, Kina, fra juni 2003 til februar 2008. Ingen af ​​patienterne havde nogensinde modtaget nogen kemoterapi, strålebehandling eller kirurgi. Alle væv blev øjeblikkeligt anbragt i flydende nitrogen og frosset ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion. Denne undersøgelse blev godkendt af Etisk Komité Qilu Hospital, Shandong University, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient.

De klinisk-patologiske data, herunder køn, alder, tumor placering, tumor stadie, tumorstørrelse, lokal invasion, histologisk differentiering og lymfeknudemetastase blev opsamlet efterfølgende. Varigheden af ​​opfølgning blev beregnet fra datoen for kirurgi til døden eller sidste opfølgning, og vi afsluttede opfølgningen i april 2012. Patienterne blev udelukket fra analysen af ​​klinisk-patologiske karakteristika og prognose, hvis de havde ufuldstændige journaler eller utilstrækkelig opfølgning.

Cell kultur

CRC cellelinier (HT-29, SW480, og SW620) og HEK (humane embryonale nyre) 293T cellelinie blev købt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og HCT116 cellelinie blev købt fra Shanghai Institute for Biokemi og Cellebiologi (Kina). Alle cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; hyaline, Logan, UT) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. For at inducere hypoxi blev cellerne udsat for en konstant strøm af en blanding med lav oxygengas (1% O

2, 5% CO

2, og 94% N

2) i en befugtet inkubation kammer (MiniGalaxy, RSBiotech, Irvine, Skotland).

RNA-isolering, cDNA-syntese, og kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen , Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Alle manipulationer af RNA blev udført under RNase-fri betingelser. RNA-koncentrationen blev målt under anvendelse af en BioPhotometer plus (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) ved 260 nm, og det isolerede RNA blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Til analysen af ​​HIF1α og VMP1mRNA ekspression, blev total RNA (1 ug) revers transkriberet til cDNA under anvendelse af SuperScript kit (Toyobo, Osaka, Japan), og QRT-PCR analyser blev udført ved anvendelse af SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japan) og en ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). De fold ændringer i HIF1α og VMP1 mRNA-ekspression blev kvantificeret ved hjælp af 2

-ΔΔCT relativ kvantificering metode med β-actin som en husholdning kontrol. Primerne til β-actin (fremadrettet primer: 5′-TGGAGTCCTGTGGCATCCACGAAA-3 ‘, revers primer: 5′-TGTAACGCAACTAAGTCATAGTCCG-3′), HIF-1α (fremadrettet primer: 5’-ATCGCGGGGACCGATT-3 ‘, revers primer: 5’ -CGACGTTCAGAACTTATCTTTTTCTT-3 ‘) og VMP1 (fremadrettet primer: 5′-GAGATGCTGGAACATGCAGA-3′, revers primer: 5’-TTGCTCCACTATGTGCTTGC-3 ‘) blev indkøbt fra BioSune, Shanghai, Kina. For miRNA udtryk, blev cDNA syntetiseret ved hjælp gen-specifikke primere (Ribobio, Guangzhou, Kina) og M-MLV RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i en 20-pi reaktion volumen. RT-reaktionen reagenser indeholdt 1 ug RNA-template, 1 pi 10 mM dNTP-blanding, 2 pi 0,1 M DTT, 4 pi 5 × første streng puffer, og 1 pi 40 U /pl RNase inhibitor. Volumenet blev indstillet med RNA-fri H

2O. Revers-transkriptionsreaktion blev udført tre gange for at fjerne eventuelle outliers. Mirna ekspression blev vurderet ved anvendelse QRT-PCR og et ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). De fold ændringer i miRNA udtryk blev bestemt ved hjælp af 2

-ΔΔCT metode; ekspressionen blev normaliseret til U6 lille nukleare RNA (U6) ekspressionsniveau. Desuden den relative ekspression af miRNA, HIF1α og VMP1 i HT-29 celler brudt som kalibrator i hver kørsel og blev sat til værdien af ​​1.

Transfektion med miRNA /plasmid

CRC celler blev udpladet ved en densitet på 5 x 10

4 celler /brønd i plader med 24 brønde eller ved 1,5 × 10

5 celler /brønd i plader med 6 brønde og blev dyrket ca. 24 timer før transfektion. Efter at cellerne nåede 50% konfluens, transient transfektion af miRNA efterligner /inhibitor (RiboBio, Guangzhou, Kina) og /eller plasmid blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. For hvert eksperiment blev transfektionseffektiviteten vurderet ved QRT-PCR ved 24 timer efter transfektion.

Migration og invasion assays in vitro

Transwell kamre (diameter på 6,5 mm, porestørrelse på 8 um ) (Corning, NY, USA) belagt med eller uden Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) blev anvendt til at udføre migrationen og invasion-assays. Ved 24 timer efter transfektion, HT-29 (5 x 10

4 celler) eller SW480 (1 × 10

5 celler) cellerne blev resuspenderet i et medium indeholdende 1% FBS og placeret i top kammer hver indsats. En alikvot af medium indeholdende 10% FBS (500 pi) blev tilsat til de nedre kamre. Efter inkubation i 24 timer ved 37 ° C blev cellerne klæber til nedre membran farvet med 0,1% krystalviolet, afbildes (200 ×) og talt under anvendelse af et IX81 omvendt mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Luciferaseassay

Luciferase reporter assay blev udført ved hjælp af pmiR-REPORTTM vektorer (RiboBio, Guangzhou, Kina) indeholdende vildtype (WT) -VMP1 3′-UTR sekvenser eller mutant (MUT) -VMP1 3 “-UTR sekvenser. HEK293T celler blev transient cotransficeret med MIR-210 efterligner /MIR-negativ kontrol og WT-VMP1 3′-UTR vektor /MUT VMP1 3′-UTR vektor. Luciferaseaktiviteter blev målt ved anvendelse af Dual-Luciferase assay kit (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner 48 timer efter transfektion.

Western blot-

Total protein af dyrkede celler blev ekstraheret ved RIPA buffer indeholdende PMSF. BCA proteinassaykit (Beyotime, Haimen, Kina) blev anvendt til bestemmelse af koncentrationen. Proteiner adskilles via SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Efter blokering blev membranen inkuberet med muse-anti-VMP1 polyklonalt antistof (Abcam, Southampton, UK) eller anti-β-actin-monoklonalt museantistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), efterfulgt af inkubering med HRP-konjugeret sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Signaler blev bestemt ved en kemiluminescensdetektion (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Statistisk analyse

SPSS (Statistisk pakke for Social Sciences) softwarepakke, udgave 18.0 (Chicago, IL, USA), blev anvendt til at analysere alle data. Vi brugte først Kolmogorov-Smirnov test for at afgøre fordelingen af ​​data i hver gruppe. Dataene er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD) eller median (interkvartile område), når værdierne normalt eller unormalt fordelte henholdsvis. Statistiske forskelle mellem grupperne blev testet ved anvendelse af Mann-Whitney

U

-test, Students

t

-test, eller en Kruskal-Wallis test, som er relevant. Korrelationen mellem MIR-210 og HIF1α (eller VMP1) blev bestemt ved Pearsons korrelationsanalyse. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere overlevelse og overlevelse forskelle mellem undergrupperne blev undersøgt under anvendelse af log-rank test. En Cox regressionsmodellen (Proportional fare model) blev anvendt til univariate analyse og multivariat analyse af prognostiske faktorer. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når

P

. 0,05

Resultater

MIR-210 er ofte opreguleret i kolorektal cancer væv og involveret i CRC udvikling

De ekspressionsniveauerne af miR-210 i 193 par af humane CRC væv og tilsvarende ikke-kræft væv blev undersøgt ved hjælp af QRT-PCR. For at sikre, at henvisningen genet U6 ikke ændrer mellem tumorvæv og tilsvarende ikke-cancervæv, vi beregnet de gennemsnitlige Ct-værdier som 2

-Ct. Niveauet af U6 viste ingen signifikante forskelle mellem tumor og tilsvarende ikke-kræft prøver (2

-CtTumor /2

-CtNon-kræft = 0,93;

P

= 0,34) (Figur S1 ). Resultaterne viste, at MIR-210-ekspression i CRC væv var signifikant opreguleret i forhold til produktionen i de tilstødende normale væv (

P

0,001, figur 1A.). Desuden var 58% (111 af 193) af prøverne viste mere end 2-fold opregulering af MIR-210 sammenlignet med de ikke-kræft vævsprøver, hvilket indebærer, at overekspression af MIR-210 er en almindelig hændelse i CRC. I et kontrolleret forsøg, vi også fundet miR-21, en anden overudtrykte miR i CRC [29], var signifikant opreguleret i CRC væv sammenlignet med tilstødende ikke-tumorvæv (

P

0,001, figur S2 ), hvilket bekræfter gennemførlighed og pålidelighed vores metode. Desuden HIF1α udtryk i CRC væv var opreguleret (

P

0,001; Figur 1D) og positivt korreleret med miR-210-ekspression i CRC væv (r = 0,402,

P

. figur 1E)

(A) MIR-210-ekspression blev testet under anvendelse QRT-PCR i 193 par af humane CRC væv (CRC) og tilstødende ikke-tumor-væv (NT), og dets ekspression. blev normaliseret til det niveau af U6 lille nukleare RNA (U6) ekspression i hver prøve. (B) Fold ændringer i miR-210-ekspression i hver parret prøve. Dataene er repræsenteret som en log

2-gange ændring (cancer /normal), der blev defineret som 1 (overekspression) og -1 (underekspression); de resterende fold ændringer blev defineret som uændret. (C) at overekspression af MIR-210 blev fundet i 58% (111 af 193) af CRC væv sammenlignet med de tilstødende ikke-tumor-væv. (D) HIF1α mRNA-ekspression blev detekteret i CRC væv (CRC) og tilstødende ikke-tumor-væv (NT), og dets ekspression blev normaliseret til det niveau af β-actin-ekspression i hver prøve. (E) Korrelationen mellem MIR-210-ekspression og HIF1α mRNA-niveauer i CRC væv blev analyseret ved anvendelse Pearsons korrelationsanalyse. (F) Kaplan-Meier samlede overlevelse kurver i henhold til niveauet af miR-210-ekspression. De patienter med højt miR-210-ekspression havde en signifikant dårligere 5-års samlede overlevelsesrate end dem med lav miR-210-ekspression (

P

0,001). Medianen miR-210 ekspressionsniveauet i tumorprøver blev valgt som cut-off point.

Vi yderligere opsummeret sammenslutningen af ​​MIR-210 ekspressionsniveauerne med forskellige klinisk-patologiske karakteristika i CRC væv og fandt, at miR-210-ekspression var signifikant korreleret med stor tumorstørrelse (

P

= 0,014), lokal invasion (

P

= 0,047), positiv regional lymfeknude metastaser (

P

= 0,001), og TNM stadie (

P

= 0,005). Der var imidlertid ingen signifikante sammenhænge mellem miR-210 udtryk og patientens køn, alder, tumor placering eller histologi bedømmelse (alle

P

0,05). De detaljerede resultater af de statistiske test mellem miR-210-ekspression og klinisk-patologiske egenskaber er anført i tabel 1.

MIR-210 er en uafhængig prognostisk markør for den samlede overlevelse CRC patienter

i alt 50 patienter døde under opfølgningsperioden, og den kumulative 5-års samlede overlevelsesrate var 56,9%. Brug af medianen af ​​miR-210 ekspressionsniveauerne som cutoff, vi delte de 116 CRC patienterne i to grupper: en høj miR-210 udtryk gruppe og en lav miR-210 udtryk gruppe. Vi anvendte derefter Kaplan-Meier overlevelse kurve analyse for at vurdere den prognostiske værdi af MIR-210 i colorektal cancer. Resultaterne viste, at patienter med højt MIR-210-ekspression havde en signifikant ringere prognose end dem med lav MIR-210-ekspression (

P

0,001, figur 1F.). For at vurdere, om miR-210-ekspression var en uafhængig indikator for samlet overlevelse for CRC patienter, vi først anvendt en univariate Cox proportionel risiko regressions model til at estimere den enkelte hazard ratio for alle de klinisk-patologiske parametre. Resultaterne viste, at den samlede overlevelse var signifikant relateret til MIR-210 ekspressionsniveauet (RR = 2,621; 95% CI, 1,457-4,712;

P

= 0,001) og fire andre parametre (tumorstørrelse lokal invasion, regional lymfeknude metastaser, og TNM fase; alle

P

0,05). I den multivariate analyse, Cox proportional hazards model involverer de fem væsentlige prognostiske faktorer identificeret miR-210 udtryk som en selvstændig prognostisk faktor for patienter med CRC (

P

= 0,008). Den statistiske værdi af MIR-210-ekspression og de andre klinisk-patologiske parametre udledt fra Cox proportional hazards regression model er anført i tabel 2.

MIR-210 udtrykkes i CRC-cellelinjer og fremkaldes af hypoxi i CRC-celler

Vi undersøgte ekspressionsniveauet af mIR-210 i et panel af CRC cellelinjer, herunder HCT-116, HT-29, SW620 og SW480. Resultaterne viste, at niveauet af MIR-210 var højest i HT-29-celler sammenlignet med de andre tre cellelinier, og dens niveau var lavest i SW480-celler (Fig. 2A). Baseret på dette udtryk mønster, valgte vi derfor HT-29 og SW480 for følgende undersøgelser. Som beskrevet i figur 2D og 2E, fandt vi, at MIR-210 niveauer øges som reaktion på hypoksi i disse celler. Endvidere ekspressionen af ​​MIR-210 stærkt forøget ved langvarig eksponering for hypoxi, hvilket indikerer, at MIR-210 faktisk blev induceret ved hypoxi i CRC cellelinier.

(A) MIR-210 ekspression i CRC cellelinier. (B, C) HIF1α mRNA-ekspression i HT-29 (B) og SW480 (C) celler under hypoxiske betingelser. (D, E) MIR-210 ekspression i HT-29 (D) og SW480 (E) celler under hypoxiske betingelser. Dataene er præsenteret som gennemsnittet af tre målinger, og fejlsøjlerne repræsenterer SD af middelværdien. *

P

. 0,05

MIR-210 fremmer CRC celle migration og invasion og medierer hypoxi-induceret migration og invasion af CRC celler

For at måle de biologiske egenskaber af mIR-210 i CRC-celler, vi transient modulerede mIR-210 ekspressionsniveauet ved transfektion med mIR-210 efterligner eller inhibitor. Som vist i figur 3, transfektionseffektiviteten var meget høj i HT-29 og SW480 cellelinier. Transwell eksperimenter med eller uden Matrigel blev udført for at teste virkningen af ​​MIR-210 på CRC cellemigration og invasion, og vi fandt, at opregulering af MIR-210 af MIR-210 efterligner forøgede migration og invasion evne CRC-celler (Fig . 4A, 4C). I overensstemmelse med disse resultater, transfektion med MIR-210-inhibitor medførte en signifikant formindskelse af migration og invasion evne CRC-celler sammenlignet med celler transficeret med miR negativ kontrol (fig. 4B, 4D). Tilsammen vores observationer indikerer, at MIR-210 kunne fremme migration og invasion evne CRC-celler. Salg

(A, C) MIR-210 Ekspression i HT-29 (A) og SW480 (C) celler blev steg betydeligt efter transfektion med miR-210 efterligner. (B, D) MIR-210-ekspression i HT-29 (A) og SW480 (C) celler blev stærkt formindsket efter transfektion med MIR-210-inhibitor. Dataene er præsenteret som gennemsnittet af tre målinger, og fejlsøjlerne repræsenterer SD af middelværdien. *

P

. 0,05 sammenlignet med den tilsvarende negative kontrol

(A, B) Transwell migration analyser af HT-29 og SW480 celler blev udført efter transfektion med miR- 210 efterligner (A) eller hæmmer (B). (C, D) Transwell invasions assays af HT-29 og SW480 celler blev udført efter transfektion med MIR-210 efterligner (C) eller inhibitor (D). I alle paneler, at resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. NC, negativ kontrol.

Fordi vi demonstrerede miR-210 kunne øge migration og invasion potentiale CRC celler, vi hypotese, at miR-210 også kunne formidle den hypoxi-induceret migration og invasion af CRC celler . For at bekræfte denne hypotese, udførte vi transwell assays for at undersøge migration og invasion potentiale CRC celler under hypoxiske betingelser og fandt, at migration og invasion evnen af ​​disse CRC celler blev signifikant forøget sammenlignet med celler under normoxiske betingelser. Endvidere transfektion med MIR-210 inhibitor dramatisk formindsket migration og invasion evne til hypoksiske CRC celler, hvorimod transfektion med MIR-210 efterligner yderligere forbedret migrering og invasion evne CRC celler (Fig. 5). De ovenstående resultater viser, at MIR-210 spiller en vigtig rolle i hypoxi-induceret migration og invasion af CRC-celler.

(A, B) Transwell migration og invasion assays af HT-29 og SW480 celler blev udført efter transfektion med miR-210 efterligner eller den negative kontrol (NC) under normoxiske eller hypoxiske betingelser. (C, D) Transwell migration og invasion assays af HT-29 og SW480 celler blev udført efter transfektion med MIR-210 inhibitor eller den negative kontrol under normoxiske eller hypoxiske betingelser. I alle paneler, at resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

VMP1 er et direkte mål for miR-210

Targetscan identificerer, at 3′-UTR af VMP1 indeholder forudsagt bindingssted for mIR-210 (fig. 6A). Luciferaseaktivitet assay viste, at MIR-210 inhiberede luciferaseaktiviteten af ​​WT 3′-UTR signifikant, men ikke Mut 3′-UTR af VMP1 i HEK293T celler (Fig. 6B). Endvidere overekspression af MIR-210 inhiberede signifikant VMP1 mRNA og protein niveauer i HT-29 og SW480 celler (fig. 6C, 6D) og VMP1 niveau blev omvendt korreleret med MIR-210-ekspression i primære CRC væv (r = -0,318,

P

0,01;. figur 6E). Disse data tyder på, at miR-210 negativt regulerer VMP1 udtryk ved direkte at målrette sine 3′-UTR sekvenser.

(A) De formodede miR-210 bindende sekvenser i VMP1 3′-UTR. (B) Luciferaseaktivitet assay blev udført for HEK293T celler cotransficeret med pmiR-RAPPORT ™ vektorer indeholdende WT-VMP1 3′-UTR eller MUT-VMP1 3′-UTR sekvenser og miR-210 efterligner. Data er præsenteret som normaliseret gange ændring i luciferaseaktivitet. (C, D) VMP1 mRNA og protein blev bestemt i HT-29-celler og SW480-celler transficeret med MIR-210 efterligner eller MIR-negativ kontrol ved QRT-PCR og Western blot hhv. (E) Inverse korrelation mellem miR-210-ekspression og VMP1 mRNA-niveauer i CRC væv blev analyseret ved hjælp af Pearsons korrelationsanalyse.

Overekspression af VMP1 delvist vender migration og invasion af CRC celler induceret af miR-210

for at bestemme om VMP1 er involveret i miR-210 induceret metastaser af CRC celler, vi udførte redning analyser. Som vist i figur 7, kunne MIR-210 efterligner forøge den metastatiske evne CRC-celler og nedsat metastatisk potentiale blev observeret i VMP1-overudtrykkende celler sammenlignet med kontrolceller. Endvidere kunne samtidig overekspression af MIR-210 og VMP1 delvist ophæver MIR-210-induceret metastatisk potentiale i CRC-celler. Disse resultater viser, at MIR-210 kan fremme CRC cellemigration og invasion ved at målrette VMP1.

(a, b) Transwell migration og invasion-assays blev udført i VMP1-overekspression HT-29-celler cotransficeret med MIR-210 efterligner eller negativ kontrol. (C, D) Transwell migration og invasion-assays blev udført i VMP1-overekspression SW480-celler cotransficeret med MIR-210 efterligner eller negativ kontrol. I alle paneler, at resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

Diskussion

Hypoxi er en fremherskende karakteristisk træk ved de fleste solide tumorer, og den robuste hypoxi-induceret miRNA, miR-210 er i øjeblikket betragtes som “master-miRNA” af hypoxi respons [15]. Det er derfor vigtigt at undersøge de potentielle roller miR-210 i fast tumor progression, da dette miRNA har vist sig at spille en central rolle i udviklingen af ​​kræft under hypoxiske betingelser [21], [30]. Vores resultater giver det første bevis på, at miR-210 er overudtrykt i CRC væv og fungerer som en nøglefaktor i udviklingen af ​​CRC.

dysreguleret udtryk for miR-210 er blevet uigendriveligt påvist i forskellige humane maligniteter. Cai et al. viste, at MIR-210-ekspression var betydeligt højere i pædiatriske osteosarcom patienter og var signifikant associeret med aggressive klinisk-patologiske træk og en dårlig prognose [31]. Men Tsuchiya [32] rapporterede, at MIR-210-ekspression blev markant nedreguleret hos patienter med dårligt differentieret esophageal pladecellecarcinom. I modsætning hertil Greither et al. [33] rapporterede, at der var ingen statistisk signifikante korrelationer mellem miR-210 udtryk og eventuelle aggressive klinisk-patologiske funktioner i bløddelssarkom. Disse uharmoniske resultater kan forklares ved de forskellige roller, som miR-210 kan spille i patogenesen af ​​forskellige kræftformer. Her har vi bemærket en markant opregulering af MIR-210-ekspression i CRC væv, og MIR-210 overekspression var signifikant korreleret med aggressive klinisk-patologiske træk, såsom en stor tumorstørrelse, positiv regional lymfeknude-metastase, lokal tumorinvasion, og en avanceret klinisk scene. Vi fandt også, at miR-210-niveau var positivt korreleret med HIF1α udtryk, der var relateret til metastase og ugunstige prognose for CRC [12], [13]. Disse resultater viste, at miR-210 kan spille vigtige roller i udviklingen af ​​den gradvise fænotype af CRC.

Med hensyn til overlevelse, blev univariate og multivariate analyser udført for at udforske potentialet prognostiske værdi af miR-210 i CRC . Resultaterne af den univariate analyse viste, at patienter med højere MIR-210 niveauer havde en dårligere prognose end dem med en lavere MIR-210 niveau. Endvidere resultaterne af den multivariate analyse af Cox proportional hazards regressionsmodel viste, at MIR-210 var en uafhængig prognostisk faktor for patientens samlede overlevelse efter kirurgi. Disse resultater er i overensstemmelse med de undersøgelser, der rapporteres af Camps et al. i brystcancer [34] og Gee et al. i hoved og halscancer [35]. Sammen med vores resultater, disse resultater viser, at miR-210 kunne være en lovende prognostisk markør for at identificere patienter med en dårlig prognose.

Den funktionelle udforskning af miR-210 viste, at miR-210 spiller centrale roller i mange cellulære processer involveret i fysiologiske og maligne tilstande. MIR-210 kan være involveret i erythropoiese og kan også fremme adipogenese [36], [37]. Som den mest konsekvent og robust opreguleret miRNA under hypoxiske betingelser, MIR-210 regulerer mange aspekter af hypoxi veje, såsom den angiogene respons af endotelceller for hypoxi [38]. Konsistente resultater har vist, at opreguleret ekspression af MIR-210 er involveret i hypoxi /VEGF-signalvejen i brystcancer [34]. I epitelial ovariecancer, dog MIR-210 er ofte slettet og kan hæmme cellecyklusprogression [27].

I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at overekspressionen af ​​MIR-210 markant fremmet migration og invasion af CRC-celler. Vores data indebærer, at miR-210 fungerer som en onkogene miRNA i human kolorektal cancer for at fremme metastase, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af tidligere undersøgelser [21] – [23]. Vi bekræftede også tidligere resultater, som viste, at MIR-210 var opreguleret i CRC-celler som respons på hypoxi, og at MIR-210 blev induceret i en tidsafhængig måde. Disse resultater indikerer, at MIR-210 er også en hypoxisk markør i CRC patienter, som det er i andre cancere, herunder hoved- og halskræft [35]. Endvidere fandt vi, at MIR-210 medieret af hypoxi-induceret migration og invasion af CRC-celler. , Foruden sine roller i tilpasning af tumorceller til lav-oxygen stress og som en markør for tumor hypoxi, foreslår vi, at forhøjede niveauer af MIR-210 kan have biologiske funktioner forbundet med malignitet og metastase af tumorer, potentielt forklare hvorfor mIR-210 er forbundet med en dårlig prognose hos kræftpatienter. Yderligere undersøgelser afslørede, at VMP1 var den funktionelle nedstrøms mål for miR-210 i CRC. VMP1 er et transmembrant protein lokaliseret til intracellulære vakuoler, der oprindeligt blev beskrevet som et protein associeret med akut pancreatitis [39]. I nyrekræft metastaser og metastatisk brystcancer cellelinjer, er VMP1 reduceres [40]. Og i HCC er VMP1 identificeret som en downstream mål for miR-210 og den reducerede VMP1 korrelerer med tumor metastaser [21]. I overensstemmelse med disse undersøgelser, fandt vi, at VMP1 også reduceres i CRC prøver og virker til at undertrykke tumor metastatisk potentiale.