PLoS ONE: Dereguleret Angivelse af SRC, LYN og CKB kinaser af DNA-methylering og dens mulige rolle i Gastric Cancer invasiv og Metastase

Abstrakte

kinaser er nedstrøms modulatorer og effektorer i flere cellulære signalering kaskader og spille nøgleroller i udviklingen af ​​neoplastisk sygdom. I denne undersøgelse var det et mål at evaluere SRC, LYN og CKB-protein og mRNA-ekspression, såvel som deres promotor methylering, i gastrisk cancer. Vi fandt forhøjet ekspression af SRC og LYN kinase mRNA og protein, men nedsatte niveauer af CKB kinase, ændringer, der kan have en rolle i invasivitet og metastase af gastriske tumorer. Ekspression af de tre undersøgte kinaser var også forbundet med MYC onkogen ekspression, en mulig biomarkør for mavekræft. For at forstå de mekanismer, der regulerer ekspressionen af ​​disse gener, vi vurderede DNA-promotor-methylering af de tre kinaser. Vi fandt, at reduceret

SRC

og

LYN

methylering og øget

CKB

methylering var forbundet med mavekræft. Den reducerede

SRC

og

LYN

methylering var forbundet med forøgede niveauer af mRNA og proteinekspression, hvilket antyder, at methylering af DNA er involveret i regulering af ekspressionen af ​​disse kinaser. Omvendt reduceres

CKB

methylering blev observeret i prøver med reduceret mRNA og proteinekspression, hvilket tyder CKB ekspression viste sig at være kun delvist reguleret af DNA-methylering. Derudover fandt vi, at ændringer i DNA-methylering mønster af de tre undersøgte kinaser også var forbundet med den gastriske cancer indtræden, fremskreden mavekræft dybere tumorinvasion og tilstedeværelsen af ​​metastaser. Derfor SRC, LYN og CKB udtryk eller DNA methylering kan være nyttige markører til forudsigelse af tumor progression og målretning i anti-cancer strategier

Henvisning:. Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, Montenegro RC, et al. (2015) Dereguleret Angivelse af SRC, LYN og CKB kinaser af DNA-methylering og dens mulige rolle i Gastric Cancer invasiv og Metastase. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10,1371 /journal.pone.0140492

Redaktør: Jose G. Trevino, University of Florida, USA

Modtaget: Maj 27, 2015; Accepteret: September 25, 2015; Udgivet: 13. oktober 2015

Copyright: © 2015 Mello et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; tilskud # 471.072 /2012-5 og 402.283 /2013-9, fællesskab til MCS og RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa do Pará (FAPESPA; bevilge #ICAAF 123/2014 til RRB) og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; tilskud # 2009 /07.145-9; fællesskab til MFL) som tilskud og stipendier awards. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde hyppigste kræftform og den næsthøjeste dødsårsag kræft på verdensplan [1]. Behandling af GC på fremskredne stadier stadig vanskeligt, og prognosen er stadig fattige, dels som følge af lokalt recidiv, tumor invasion og /eller metastaser. Den generelle relative 5-års overlevelse er i øjeblikket mindre end 20% [2]. En bedre forståelse af biologi progression af denne neoplasi er afgørende for at reducere dødeligheden med udviklingen af ​​hidtil ukendte forvaltning patient og terapeutiske strategier.

Phosphotransferases, også kendt som kinaser, er downstream modulatorer og effektorer i flere cellulære signalering kaskader og spille nøgleroller i udviklingen af ​​neoplastisk sygdom [3]. Til dato har adskillige protein kinase-interagerende lægemidler blevet registreret til kliniske forsøg [4]. Vi har tidligere udført screening for at identificere kinase proteiner udtrykt i GC under anvendelse indfangningsforbindelse massespektrometri [5, 6] (S1 fil), og 22 kinase proteiner, herunder SRC, LYN og CKB, blev påvist (S1 tabel). Disse tre kinaser blev udvalgt til yderligere undersøgelser (S1 Fig).

SRC var den første proto-onkogen opdaget, og det spiller en central rolle i cellulær signaltransduktion. Afvigende SRC-aktivitet er observeret i adskillige humane cancere, herunder GC [7-9], og det kan være vigtigt i tumorudvikling og progression [10, 11]. Den mitogene funktion af SRC er, i det mindste delvist medieret af induktion af MYC, en cellecyklus regulator og transskriptionsfaktor [12, 13]. Vores gruppe tidligere beskrevet MYC opregulering i human GC og i N-methyl-nitrosourea-behandlede primater [14-19]. Fordi aktivering af SRC, såvel som af andre kinaser, har pleiotropiske virkninger, der afhænger af celletypen og kontekst [20], er det stadig vigtigt at forstå den mulige sammenhæng mellem kinaser og MYC-ekspression i gastrisk carcinogenese og den molekylære mekanisme involveret i deres regulering.

LYN er et andet medlem af SRC-familien af ​​kinaser, og

LYN

gen er placeret på kromosom 8q13. Vores gruppe tidligere rapporteret tilstedeværelsen af ​​gevinster på kromosom 8 (hvor

MYC

gen også placeret) i GC sager fra det nordlige Brasilien [16, 21-23], og i alle GC cellelinjer etableret fra neoplasier i denne population [24, 25]. Derfor kan dette kromosom indeholder vigtige gener involveret i gastrisk carcinogenese. Til vores viden, er der ikke tidligere undersøgelse undersøgte rolle LYN og dens regulering i GC. Imidlertid har LYN overekspression blevet rapporteret i flere kræftformer [26-32]. Desuden blev reguleringen af ​​

LYN

efter DNA-methylering vist ved både kolorektal cancer og Ewings sarkom [33, 34], og

er blevet observeret LYN

methylering i nogle hæmatopoietiske og ikke-hæmatopoietiske cellelinier [35]. DNA-methylering er en molekylær modifikation af DNA, der er tæt forbundet med genfunktioner og celletype-specifik genfunktion [36]. Endvidere kan DNA-methylering være en robust biomarkør, som det er langt mere stabilt end RNA eller protein og er derfor en lovende mål for udviklingen af ​​nye metoder til diagnose og prognose af cancere [36].

CKB er en af ​​to cytosoliske isoformer af kreatinkinase og kan deltage i metaboliske processer, der involverer glycolyse i ikke-muskelceller [37]. I modsætning til normale celler, der primært genererer energi via oxidativ phosphorylering, de fleste cancerceller foretrækker aerobe glycolyse, der er kendt som Warburg virkning [38]. Interessant, synes MYC onkogen at aktivere flere glucose transportvirksomheder og glycolytiske enzymer, og dermed bidrage til Warburg effekten [39]. Vores tidligere proteomisk undersøgelse viste, at flere proteiner involveret i energi produktionsprocesser blev dereguleret i GC prøver og styrket Warburg effekten i denne neoplasi [40]. Rolle CKB i GC stadig dårligt forstået: nogle transkriptom studier rapporterede opregulering af

CKB

i GC prøver [41, 42], mens en anden viste

CKB

nedregulering [43]. Hertil kommer, som for

LYN

gen,

CKB

methylering er tidligere beskrevet i hæmatologisk og faste cancercellelinier, herunder GC cellelinier [44]. Den methylering af

CKB

synes at være relateret til dens reducerede niveau af udtryk; dog yderligere undersøgelser er stadig nødvendigt at forstå reguleringen af ​​

CKB

af epigenetiske modifikationer.

Derfor er vi først havde til formål at evaluere mRNA og protein udtryk for SRC, LYN og CKB i et stort sæt med GC-prøver. Derefter vurderede vi, om disse gener kan reguleres ved DNA-methylering i gastrisk carcinogenese. Derudover undersøgte vi den mulige sammenhæng mellem kinase udtryk eller methylering og kliniske variable samt MYC udtryk og methylering.

Materiale og metoder

Vævsprøver

kinase udtryk og methylering mønstre blev evalueret i 138 par af GC prøver og deres tilsvarende ikke-neoplastiske gastrisk vævsprøver opnået fra patienter, som gennemgik gastrektomi i det nordlige Brasilien. Alle patienterne havde negative historier af udsættelse for enten kemoterapi eller strålebehandling før operationen, og der var ingen samtidig forekomst af andre diagnosticeret cancere. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité af João de Barros Barreto Universitetshospital (Protokol # 316.737). Skriftligt informeret samtykke med godkendelse af den etiske komité blev opnået fra alle patienter forud for prøvetagning.

En del af hver dissekerede tumor prøve var formalin-fikseret og paraffin-indstøbt (FFPE). Dele af FFPE væv blev farvet med hæmatoxylin-eosin til histologisk evaluering eller anvendes til immunhistokemi (IHC) analyse. Yderligere portioner hver tumor og parrede ikke neoplastiske vævsprøver var lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil protein og nukleinsyre oprensning.

Alle prøverne blev klassificeret ifølge Lauren [45 ], og tumorerne blev iscenesat ifølge TNM mellemstationer kriterier [46]. Tilstedeværelsen af ​​

Helicobacter pylori

, et klasse I carcinogen, i gastriske prøver blev påvist ved den hurtige ureasetest, og dens virulens faktor cytotoksicitet associerede gen A (CagA-gen) blev påvise ved PCR under anvendelse af DNA oprenset samtidigt med proteiner og mRNA, som tidligere blev varetaget af vores gruppe [47]. Epstein-Barr virus (EBV) blev påvist ved RNA in situ hybridisering [47].

I 49 af disse par af neoplastiske og ikke neoplastiske prøver, vi vurderede MYC immunreaktivitet, mRNA-ekspression og methylering statusdata tidligere udgivet af vores gruppe [18].

protein, mRNA og DNA oprensning

Total protein, mRNA og DNA blev samtidig isoleret fra gastriske vævsprøver ved hjælp af AllPrep DNA /RNA /protein kit ( Qiagen, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Proteinet pellet blev opløst i en buffer indeholdende 7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, USA), og 0,5% hver Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 og 2 (Sigma -Aldrich, USA), som tidligere blev varetaget af vores gruppe [48]. Protein- koncentrationer blev bestemt ved fremgangsmåden ifølge Bradford (Sigma-Aldrich, USA). RNA koncentration og kvalitet blev bestemt ved anvendelse af et NanoDrop spektrofotometer (Kisker, Tyskland) og 1% agarosegeler, hhv. Prøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

Protein immunreaktivitet analyse

Tumor vævssnit (3 eller 4 mm tyk) blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret i en gradueret række af ethanol. Efter varme- epitopgenfinding blev vævssnittene inkuberet med primære monoklonale museantistoffer mod SRC (fortynding 1: 400; klon 28, Life Technologies, USA), LYN (fortynding 1: 400; klon C13F9; Life Technologies, USA) eller CKB (fortynding 1: 250; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA). En universel peroxidase-konjugeret sekundært antistof kit (LSAB System, DakoCytomation, USA) blev anvendt til detektion. Vi brugte 3,30-diamino-benzidin /H

2O

2 (DakoCytomation, Danmark) som kromogen og hæmatoxylin som kontrastfarve. Et protein immunreaktivitet-positiv prøve blev defineret som en, der har 10% eller flere neoplastiske celler, som var positive for proteinet.

Proteinekspression analyse

Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet af vores gruppe [49]. Reduceret protein (25 ug) fra hver prøve blev separeret ved 12,5% homogen SDS-PAGE og elektro-blottet på en PVDF-membran (Hybond-P, GE Healthcare, USA). PVDF-membranen blev blokeret med phosphatbufret saltvand indeholdende 0,1% Tween 20 og 5% fedtfattig mælk og inkuberet natten over ved 4 ° C med den tilsvarende primære antistoffer: anti-SRC (fortynding 1: 1000; klon 28, Life Technologies, USA), anti-LYN (fortynding 1: 1000; klon C13F9; Life Technologies, USA), anti-CKB (fortynding 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA), og anti-ACTB (fortynding 1: 250; Ac -15, Life Technologies, USA). Efter omfattende vask blev et peroxidase-konjugeret sekundært antistof tilsat i 1 time ved stuetemperatur. Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved hjælp af western blotting Luminol reagens, og billederne blev erhvervet ved hjælp af en ImageQuant 350 digitalt billede-system (GE Healthcare, Sverige). ACTB blev anvendt som en loading henvisning kontrol.

mRNA-ekspression analyse

Først RNA blev revers-transkriberet under anvendelse af High-Capacity cDNA Archive Kit ifølge producentens protokol (Life Technologies, USA) . Komplementær DNA blev derefter forstærket af real-time revers transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) ved hjælp af TaqMan sonder købt som Analyser-on-demand Produkter til Gene Expression (Life Technologies, USA) og en 7500 Fast Real-Time PCR-instrument (Life Technologies , USA).

GAPDH

gen blev valgt som en intern kontrol for RNA input og omvendt transskription effektivitet. Alle RT-qPCRs blev udført i tre eksemplarer for både target gener (

SRC

: Hs01082246_m1;

LYN

: Hs00176719_m1;

CKB

: Hs00176484_m1) og den interne kontrol (

GAPDH

:. NM_002046.3)

Den relative kvantificering af genekspression blev beregnet i henhold til Livak og Schmittgen [50]. Den tilsvarende kontrolprøve blev betegnet som en kalibrator fra hver tumor.

DNA methyleringsanalyse

mønster for methylering og hyppigheden af ​​kinase gener blev evalueret ved methylering-specifik PCR (MSP) [51]. EZ DNA-methylering-Lightning ™ Kit (Zymo Research, USA) blev anvendt til at modificere gDNA ved bisulfitbehandling, omdannelse umethylerede cytosiner i uraciler og forlader methylerede cytosiner uændret. Specifikke primere for de genpromotorer er beskrevet i tabel 1.

PCR-reaktioner blev udført ved anvendelse af 0,1 pmol /L dNTP’er, 2 mmol /l MgCl

2, 0,5 pmol primere, 1,25 U Taq DNA-polymerase og 100 ng bisulfit modificerede DNA. Efter indledende denaturering i 5 minutter ved 94 ° C blev 40 cykler ved 94 ° C i 45 s, annealing temperatur (tabel 1) i 45 s og 72 ° C i 30 s udført, efterfulgt af en endelig forlængelse på 5 min ved 72 ° C. PCR-produkterne blev direkte fyldt på 3% agarosegeler og elektroforeret. Gelen blev farvet med SYBR

® Safe DNA Gel Stain (Life Technologies, USA) og direkte visualiseret under UV-belysning. Som en positiv kontrol for alle MSP-reaktioner, en gDNA prøve var helt methyleret ved hjælp CpG-methylase (SSSI, New England Biolabs, USA) ifølge producentens anvisninger. Endvidere blev primere til påvisning af vildtype-sekvensen anvendt til at overvåge den fuldstændige omdannelse af DNA opnået i bisulfitreaktionen

Prøverne blev stratificeret som følger:. 1) en prøve blev defineret som hypomethylated når en positiv forstærkning produktet blev detekteret kun i PCR med specifikke primere til ikke-methylerede sekvenser; 2) en prøve blev defineret som hypermethyleret når positiv forstærkning blev kun detekteret i PCR med specifikke primere for methylerede sekvenser; 3) en prøve blev defineret som delvis methyleret når positiv forstærkning blev påvist i PCR med de to primersæt.

Primerne ‘specificitet og MSP resultater blev bekræftet ved anvendelse af et bisulfit sekventering PCR (BSP) tilgang [52] . BSP blev også anvendt til at evaluere den procentdel af methylering. Primerne og anneling temperaturer på BSP er beskrevet i tabel 1. Efter amplifikation blev fragmenterne oprenset ved anvendelse af NucleoSpin Gel og PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel, Tyskland), ligeret i pGEM T-easy-vektor (Promega, Tyskland) og klonet ind kompetent

E

.

coli

JM109 celler. Efter inkubationstiden blev hvide kolonier udvalgt til PCR med M13 fremad (5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ‘) og M13 revers (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3’) primere [53]. Efter indledende denaturering i 3 min ved 94 ° C, PCR-amplifikation bestod af 35 cykler ved 94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 90 s blev udført, efterfulgt af en endelig forlængelse for 5 min ved 72 ° C. PCR-produkterne blev visualiseret i agarosegel. Seks kloner blev udvalgt til oprensning og sekventeret i en ABI310 automatisk sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle sekvenser blev på linie med BioEdit v7.0.5 [54], og methylering analyser blev udført med BiQ Analyzer software [55]. Procentdelen af ​​methylering for hver prøve blev beregnet ved at dividere antallet af methylerede CpG’er med det samlede antal CpG’er sekventeret (CpG’er i alle seks kloner).

Statistiske analyser

Dataene er vist som frekvensen, median og interkvartile område (IQR). Shapiro-Wilk testen blev anvendt til at vurdere fordelingen af ​​alderen, mRNA, protein ekspression og procentdelen af ​​methylering data og bestemme den passende efterfølgende test til statistiske sammenligninger. Mann-Whitney-test blev anvendt til at undersøge mulige sammenhænge mellem kinase mRNA eller proteinekspression og kategoriske variabler, såsom immunreaktivitet, methylering mønster og klinisk-patologiske træk. Mann-Whitney-test blev anvendt til at undersøge mulige sammenhænge mellem procentdelen af ​​methylering og immunoreaktivitet og klinisk-patologiske træk. Wilcoxon test blev brugt til at sammenligne den procentdel af methylering mellem par af neoplastiske og ikke neoplastiske prøver. En forening mellem kategoriske variable blev analyseret ved hjælp af Chi-squared (χ

2) test. En Spearman korrelation test blev anvendt til vurdering af den eventuelle sammenhæng mellem mRNA og proteinekspression, samt promotor-methylering. En p-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant. Bonferroni tilpasning af p-værdien blev påført, når multiple sammenligninger blev udført, med alfa niveau divideres med antallet af sammenligninger.

Resultater Salg

Kinase ekspression i gastriske tumorer

ikke-atypiske gastriske celler ikke til stede SRC eller LYN immunreaktivitet (fig 1A og 1C). Imidlertid blev SRC immunoreaktivitet observeret i dysplastiske celler. Cellemembranen og cytoplasmatisk immunoreaktivitet for SRC og LYN blev detekteret i neoplastiske celler (Fig 1B og 1D), og Lyn præsenterede også nukleinsyre immunoreaktivitet. CKB immunreaktivitet blev påvist i cytoplasmaet eller i cellemembranen i ikke neoplastiske gastriske celler (Fig 1E). I modsætning hertil GC celler ikke til stede CKB immunoreaktivitet (Fig 1F)

A) maveslimhinden uden SRC immunoreaktivitet.; B) diffuse type mavekræft præsenterende celle membran og cytoplasmatisk immunoreaktivitet af SRC; C) ikke-neoplastisk gastrisk væv uden LYN immunoreaktivitet; D) tarm-typen mavekræft præsentere LYN immunreaktivitet; E) ikke-neoplastiske maveslimhinden viser svag cytoplasmatisk CKB farvning i kirtelceller; F) diffuse gastriske cancerceller uden CKB immunreaktivitet.

SRC, LYN og CKB immunreaktivitet blev påvist i 72 (52,2%), 66 (47,8%) og 0 (0%) af tumoren prøver. SRC og LYN immunreaktivitet var forbundet med højere mRNA og protein niveauer i GC-prøver (p 0.001, for alle sammenligninger; Mann-Whitney-test, fig 2A, 2C, 2E og 2G). Protein- og mRNA niveauer af SRC blev forøget mindst 1,5 gange (mindst en 50% stigning i ekspression) i 67 (48,6%) og 80 (58%), henholdsvis GC-prøver i forhold til deres matchede ikke-neoplastisk gastrisk prøver (fig 2B, 2D og 2K). Desuden blev proteinet og mRNA-niveauer af LYN forøget mindst 1,5 gange i 36 (26,1%) og 72 (52,2%) GC-prøver, (fig 2F, 2H og 2K). Omvendt blev nedregulering af CKB-protein og mRNA (mindst 50% reduktion af ekspression) påvist i 104 (75,4%) og 49 (35,5%) GC-prøver, (fig 2I, 2J og 2K). blev observeret en stærk og direkte sammenhæng mellem mRNA og protein udtryk for SRC (p 0,001, ρ = 0,856, Spearman korrelation test), LYN (p 0,001, ρ = 0,762) og CKB (p 0,001, ρ = 0,819)

A) associering mellem SRC immunreaktivitet og dets proteinekspression.; B) SRC proteinekspression; C) associering mellem SRC immunoreaktivitet og dets mRNA udtryk; D)

SRC

mRNA-ekspression. E) associering mellem LYN immunreaktivitet og dets proteinekspression; F) LYN proteinekspression; G) associering mellem LYN immunoreaktivitet og dets mRNA udtryk; H)

LYN

mRNA udtryk; I) CKB proteinekspression; J)

CKB

mRNA udtryk; K) repræsentativt billede af Western blot, i hvert TNM af hver prøve er show. Protein og mRNA-ekspression blev bestemt ved Western-blot og RT-qPCR analyse hhv. I alle graferne blev ekspressionen i gastriske tumorer normaliseret ved matchede ikke-neoplastisk gastrisk væv. * Signifikant forskel mellem grupper ved Mann-Whitney (p 0,05). IHC +: sager udgør protein immunoreaktivitet; IHC-: sager uden protein immunoreaktivitet; . NM: normal slimhinde prøve

immunoreaktiviteten af ​​SRC var forbundet med immunoreaktivitet af LYN (p 0,001, χ

2 test), med 52 (37,7%) af de GC prøver præsentere immunoreaktivitet for begge proteiner. Derudover blev der observeret en direkte sammenhæng mellem SRC og LYN protein (p 0,001, ρ = 0,556) og mRNA (p 0,001, ρ = 0,779) ekspression. Niveauerne af CKB protein og mRNA-ekspression blev omvendt korreleret med SRC (p 0,001, ρ = -0,734, p 0,001, ρ = -0,806, henholdsvis) og LYN (p 0,001, ρ = -0,643; p . 0.001, ρ = -0,703, henholdsvis)

tabel 2 viser resultaterne for SRC, LYN og CKB udtryk og de klinisk-patologiske karakteristika. De tumorer i patienter med sent indsættende GC præsenteret signifikant højere SRC og LYN protein (ved IHC og western blotting) og mRNA (ved RT-qPCR) ekspression, samt reduceret CKB-proteinekspression ved western blotting, sammenlignet med tidlig debut CG prøver (p 0,05 for alle sammenligninger; tabel 2). Øget protein og mRNA-ekspression af SRC og Lyn og reduceret CKB ekspression var forbundet med fremskredent stadium, dybere tumorinvasion, og tilstedeværelsen af ​​lymfeknude og fjerne metastaser (p 0,05 for alle sammenligninger; tabel 2)

der sås en gradvis signifikant stigning i SRC-protein (ved western blotting) og mRNA-ekspression svarende til tumoren fase (p 0,008, for de fleste af de sammenligninger, Mann-Whitney-test efterfulgt af Bonferroni-metode, fig 3A og 3B). I modsætning hertil blev et gradvist signifikant fald i CKB-protein og mRNA-ekspression observeret svarende til tumoren fase (p 0,008, for de fleste af de sammenligninger, Fig 3G og 3H). Med hensyn til LYN udtryk, vi ikke oplever en betydelig forskel mellem trin I og II eller mellem trin III og IV. Dog fase I og II var signifikant forskellige fra trin III og IV (p 0,008, for disse sammenligninger, Fig 3D og 3E)

A) SRC proteinekspression.; B)

SRC

mRNA udtryk; C) Procentdel af

SRC

methylering; D) LYN proteinekspression; E)

LYN

mRNA udtryk; F) Procentdel af

LYN

methylering; G) CKB proteinekspression; H)

CKB

mRNA udtryk; I) Procentdel af

CKB

methylering. Protein og mRNA-ekspression blev bestemt ved Western-blot og RT-qPCR analyse hhv. I disse udtryk analyser blev ekspressionen i gastriske tumorer normaliseret ved matchede ikke-neoplastisk gastrisk væv. DNA-methylering blev bestemt ved bisulfit sekventering PCR. * Signifikant forskel mellem grupper ved Mann-Whitney-test efterfulgt af Bonferroni-metode til multipel sammenligning analyse (p 0,008); ** Signifikant forskel mellem grupper ved Mann-Whitney-test efterfulgt af Bonferroni-metode til multipel sammenligning analyse (p 0,001);

+ forskel mellem grupperne, men ikke statistisk signifikant efter Bonferroni tilpasning (p 0,05).

-genet mønstre for methylering i gastriske prøver

Tabel 3 viser methyleringsmønsteret af de undersøgte proteinkinaser i neoplastiske og ikke neoplastiske gastriske prøver ved MSP. Ca. 60% og 30% af de GC-prøver præsenteret positive amplifikation med kun det methylerede primersæt (hypomethylated prøver) for

SRC

og

LYN

gener, (fig 4A og 4B). Hypomethylering af disse gener blev ikke observeret i nogen ikke-neoplastisk prøve. Derfor hyppigheden af ​​

SRC

og

LYN

hypometylering var signifikant højere i GC end i ikke-neoplastiske gastriske prøver (p 0,001 for alle sammenligninger, efterfulgt χ

2 test af Bonferroni-metode)

A)

SRC

promotor methylering analyse, hvor prøverne 1 og 2 præsenterede hypomethylated promotor, prøve 3 præsenterede delvis methylering og prøve 4 præsenteret hypermethyleret promotor.; B)

LYN

promotor methylering analyse, hvor prøverne 1 præsenterede hypomethylated promotor, prøve 2 præsenterede delvis methylering og prøverne 3 og 4 præsenterede hypermethyleret promotor; C)

CKB

promotor methylering analyse, hvor prøve 1 og 2 præsenterede hypermethyleret promotor og prøve 3 og 4 præsenteres hypomethylated promotor. C-: blank; C +: positiv kontrol, gDNA prøve fuldstændigt methyleret; U: PCR med umethyleret primersæt; M: PCR med methyleret primer sæt; MW: molekylvægtmarkør; bp:. basepar

BSP analyse bekræftede MSP analyse. Af BSP, 82 (59,4%) af neoplastiske prøver og 0 (0%) af ikke neoplastiske prøver præsenteret en klonet sekvens uden CpG-methylering i

SRC

promotor. Desuden 4 (2,89%) og 1 (0,72%) af neoplastiske og ikke neoplastiske prøver præsenteret en klonet sekvens uden CpG-methylering i

LYN

promotor hhv. Ved BSP, andelen af ​​

SRC

[0,135 (0,31)

versus

0,563 (0,23); p 0,001] og

LYN

[0,238 (0,40)

versus

0,7063 (0,26); p 0,001] methylering var lavere i neoplastiske prøver end i ikke-neoplastiske prøver (Fig 5A og 5B)

A)

SRC

methylering i gastriske tumorer og ikke-tumorprøver.; B)

LYN

methylering i gastriske tumorer og ikke-tumorprøver; C)

CKB

methylering i gastriske tumorer og ikke-tumorprøver; D) Sammenhæng mellem andelen af ​​

SRC

methylering i gastriske tumorer og parret ikke-tumor prøver; E) Sammenhæng mellem andelen af ​​

LYN

methylering i gastriske tumorer og parret ikke-tumor prøver; F) Sammenhæng mellem andelen af ​​

CKB

methylering i gastriske tumorer og parret ikke-tumor prøver. * Signifikant forskel mellem grupper ved Mann-Whitney-test (p 0,05).

SRC

og

LYN

methylering mønstre af neoplastiske og ikke- neoplastiske prøver mens fundet at være forbundet (p 0,001, for begge analyser χ

2 test). Vi observerede, 70/81 (86,4%) af tumorer med hypomethylated

SRC

præsenterede delvis methylering af dette gen i de overensstemmende ikke-neoplastisk prøve. Desuden fandt vi, at 37/41 (90.24%) af tumorer med hypomethylated

LYN

præsenteret delvis methylering af dette gen i de overensstemmende ikke-neoplastisk prøve.

SRC

og

LYN

delvis methylering i ikke-neoplastiske prøver blev observeret hyppigere hos personer, der frembyder tumorprøver med hypometylering af dette gen sammenlignet med tumorer med delvis methylering (p 0,001, for både analyser) eller hypermethylering (p 0,001, for begge analyser). Desuden delvist denatureret

LYN

i ikke-neoplastiske prøver blev også oftere påvist i individer præsentere tumor prøver med delvis methylering af dette gen sammenlignet med tumorer med hypermethylering (p = 0,004). Ved BSP, vi også observeret, at andelen af ​​

SRC

(p 0,001, ρ = 0,6902, Fig 5D) og

LYN

(p 0,001, ρ = 0,739; Fig 5E ) methylering af neoplastiske og ikke neoplastiske prøver blev korreleret.

CKB

delvise og hypometylering blev observeret i både neoplastiske og ikke neoplastiske prøver. Men 48 (39%) af GC-prøver præsenteret

CKB

hypermethylering (Fig 4C), som ikke var detektere i de ikke-neoplastiske prøver. Desuden hyppigheden af ​​

CKB

-hypermethylated prøver var signifikant højere i neoplastisk sammenlignet med ikke-neoplastiske gastriske prøver (p 0,001), og

CKB

delvis methylering var også signifikant hyppigere hos GC end i ikke neoplastiske prøver (p 0,001). Ved BSP, andelen af ​​

CKB

methylering var højere i neoplastiske prøver end i ikke-neoplastiske prøver [0,511 (0,42)

versus

0,133 (0,12); p 0,001; Fig 5C]. Klonede sekvenser uden CpG methylering blev påvist i 4 (2,89%) og 0 (0%) af neoplastiske og ikke-neoplastiske prøver henholdsvis.

CKB

methylering mønster af neoplastiske og ikke -neoplastic prøver syntes at være forbundet (p = 0,014, ved χ

2 test). En 2×2 analyse ved hjælp af χ

2 test viste, at par, hvor tumor prøver præsenteres hypermethyleret

CKB

de matchede ikke-neoplastiske prøver præsenteret hypometylering af dette gen var hyppigere end par af tumorer med hypermethylering og matchede ikke-neoplastiske prøver med delvis methylering (p = 0,0381), men dette fund nåede ikke statistisk signifikans, hvis justeringen Bonferroni blev anvendt (justeret α = 0.05 /3 = 0,0167). ved BSP, observerede vi imidlertid, at andelen af ​​

CKB

methylering af neoplastiske og ikke neoplastiske prøver blev omvendt korreleret (p 0,001, ρ = -0,375, Fig 5F).

Der blev observeret en direkte sammenhæng mellem den

SRC

og

LYN

methylering mønstre i ikke-neoplastiske prøver (p 0,001, ρ = 0,627). Desuden blev en omvendt korrelation påvist mellem

SRC

og

CKB

(p 0,001, ρ = -0,467) og

LYN

og

CKB

(p 0,001, ρ = -0,359) methylering. Men i GC prøver blev en direkte sammenhæng observeret blandt den procentdel af de tre undersøgte kinaser methylering:

SRC

og

LYN

(p 0,001, ρ = 0,840);

SRC

og

CKB

(p 0,001, ρ = 0,684);

LYN

og

CKB

(p 0,001, ρ = 0,663).

Methylering regulering af kinaser

For at belyse den epigenetisk regulering af de undersøgte gener, vi evaluerede den mulige sammenhæng mellem promotoren methylering og protein immunoreaktivitet og mRNA og proteinekspression (ved western blotting)

vi observerede, at både mRNA og protein ekspression af SRC (p. 0,001, ρ = -0,834; p 0,001, ρ = -0,718, henholdsvis fig 6A og 6B) og LYN (p 0,001, ρ = -0,792, p 0,001, ρ = -0,654, henholdsvis fig 6D og 6E) blev omvendt korreleret med procentdelen af ​​promotor-methylering. Desuden tumorer med SRC [0,062 (0,08)

versus

0,375 (0,33); p 0,001; Mann-Whitney-test; 0,001; Yang et al. Li et al.