PLoS ONE: Defineret Nanoscale Kemi Påvirker Levering af peptido-Toksiner for Cancer Therapy

Abstrakt

Vi præsenterer en

i-silico-til-i-vitro

tilgang til at udvikle veldefinerede, selv-samlet, stiv-kernehus polymere (Polybee) nano-arkitektur til kontrolleret levering af et centralt element i bigift, melittin. En konkurrencedygtig formulering med lipid-indkapslede (Lipobee) stiv kernehus micelle også syntetiseret. I en serie af sekventielle eksperimenter, viser vi, hvordan nanoskala kemi påvirker leveringen af ​​venom toksiner for cancer regression og hjælpe unddrage systemisk disintegrity og cellulær skadelighed. En relativt svagere associering melittin i tilfælde af lipidbaserede nanopartikler sammenlignes med de polymere partikler afsløret af energiminimering og docking studier, der støttes af biofysiske undersøgelser. For første gang, forfatternes eksperiment resultater indikerer, at melittin kan spille en væsentlig rolle i DNA forening-dissociation processer, som kan være en plausibel vej for deres anticancer aktivitet

Henvisning:. Misra SK, Ye M, Kim S, Pan D (2015) Defineret Nanoscale Kemi Påvirker Levering af peptidnucleinsyrer toksiner for Cancer Therapy. PLoS ONE 10 (6): e0125908. doi: 10,1371 /journal.pone.0125908

Academic Redaktør: Mande Holford, The City University of New York-Graduate Center, UNITED STATES

Modtaget: 22 oktober, 2014 Accepteret: 23. marts 2015; Udgivet: 1 juni 2015

Copyright: © 2015 Misra et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af University of Illinois. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Host forsvar peptider (HDPS) er en klasse af evolutionært konserverede stoffer i det medfødte immunforsvar, der er anerkendt som ledende spillere i forsvaret systemet findes blandt alle klasser af livet. De er normalt amphipatisk, har en netto positiv ladning (sædvanligvis 2-9) og er korte i sekvens (10-100 aa); endvidere blev HDPS nylig blevet udforsket for deres anticancer ejendom [1-4]. Denne klasse af peptider har mange egenskaber ideel til anticancer behandling applikationer, såsom i) høj vandopløselighed, ii) et bredt spektrum af cytotoksicitet, og iii) evnen til at overvinde multiresistens, der har udviklet sig i cancerceller behandlet med konventionelle kemoterapi narkotika [5]. Adskillige biofysiske undersøgelser har vist, at små proteiner eller peptider (20-40 aminosyrerester) kan trænge igennem cellemembraner af mikroorganismer. Melittin, et kationisk amfipatisk peptid bestående af 26 aminosyrer (aa) rester, har vist sig at være en potent bestanddel af bigift

Apis mellifera

[6]. Det har vist sig at have en direkte cytotoksisk virkning på en bred vifte af kræft cellelinjer

in vitro

. Det er blevet rapporteret, at melittin inhiberede cellevækst i to ovariecancerceller via induktion af dødsreceptorer og nedregulering af JAK2 /STAT3 [7, 8]. Orlistats toksiske aktivitet ved at forstyrre plasmamembraner efter poredannelse. Kationiske aa rester af melittin interagere direkte med anioniske cellemembraner via elektrostatiske interaktioner og hydrofobe regioner; denne interaktion er ansvarlig for membran permeation og forstyrrelser [6]. En lignende kort protein, med en end-to-end afstand på ~ 3,5 nm, dimensionen perfekt tjener som et enkelt transmembran-spændende alpha-helix. Talrige beregningsmæssige undersøgelser har vist, at melittin danner transmembrane porer fra dets interaktion med lecithin PC-membraner (2 ~ 3 nm i diameter). Dens potente aktivitet har tiltrukket forskere at udnytte melittin til den næste generation anticancer terapeutisk middel. Men det terapeutiske potentiale er ikke blevet opnået fuldt ud i klinikken på grund af deres off-target toksicitet, hurtig nedbrydning og clearance

in vivo

. Melittin er indarbejdet i lipid belagt perfluorcarbon partikler at ophobe sig i flere tumor mål, dramatisk reducere tumorvækst [7].

Selvom et par af disse tilgange klart lover forestående succes i prækliniske studier, deres translationel potentiale har ikke været fuldt realiseret. Ingen eller meget lidt information kan findes i litteraturen om deres translationelle anvendelse i humane studier. For at forbedre selektiviteten og reducere toksicitet, vil levering køretøj implementering i mennesker kræver stor omhu. Det er derfor afgørende, at vi fremhæve den grundlæggende kemiske strategi og rationelt nærmer køretøjets konstruktion egnet til translationel brug. En bedre forståelse af samspillet mellem venom toksiner på nanoskala er kritisk, hvilket kan diktere sin overordnede stabilitet, systemisk integritet og cellulære skadelighed. En omhyggeligt struktureret undersøgelse at forstå samspillet mellem melittin med de funktionelle komponenter på skallen og shell-overflade vil drive udformningen af ​​næste generation levering køretøjer. Til det formål har vi vedtaget en in-silico-til-i-vitro tilgang og udviklede en veldefineret nanopartikel system til kontrolleret levering af melittin. Målet med dette arbejde var at give en rationel nanopartikel-baserede design til gift levering via beregningsmæssige undersøgelser og støtte vores teoretiske resultater med fysisk-kemiske og biologiske undersøgelser. Således efter synteser og fysisk-kemiske karakterisering, blev en serie af sekventielle eksperimenter udført for at studere, hvordan nanoskala kemi påvirker leveringen af ​​venom toksiner for cancer regression og hjælpe unddrage systemisk disintegrity og cellulær skadelighed (figur 1).

(a) Skematisk af administrative protokol for Lipobee og Polybee; (B) Indledende docking billeder af PS

67-

b

-PAA

27 og melittin systemer viser, hvordan strukturer af melittin er bundet til en enkelt amfifile polymerer og (c) viser docking struktur melittin og lecithin PC. PS

67-

b

-PAA

27 og lecithin er afbildet af hvide linjer med eksplicitte iltatomer afbildet i rødt. Den melittin peptid er vist i en grøn kæde link stil med iltatomer afbildet som rød og kvælstof afbildet som blå.

I silico

undersøgelser afslørede højere stabilitet reaktion melittin mod amfifile blokpolymerer sammenlignet med lipidmolekyler. Eksperimentel undersøgelse bekræftede bedre stabilitet af polymer systemet over lipid forsamling. At indføre micellær stabilitet, blev indført et koncept af stift kerne [9]. Undersøgelser, ændring i hydratiseret størrelse og inerthed over for serumproteiner afslørede højere stabilitet af stive kernepartikler. Forsøg med melittin udvaskning i nærvær af serumkoncentrationen afslørede højere stabilitet af en melittin-polymersystem (Polybee) sammenlignet med en melittin-lipid (Lipobee) system. En in silico undersøgelse om melittin-DNA interaktion blev udført og kontrolleret af eksperimentelle data. Det konstateredes, at fri melittin kunne bringe signifikant ændring i inter-helix hydrogenbinding til potentielt påvirke mekanismer cellevækst. Melittin i sin beskyttede form som Polybee og Lipobee var inaktive. Væsentlige ændringer i den hydratiserede størrelse Polybee og Lipobee efter inkubation med natriumdodecylsulfat blev observeret, men ikke en lavere pH. Dette pegede på den anioniske membran interaktion som den ansvarlige faktor inde i cytoplasmaet som en plausibel mekanisme melittin frigivelse. Brystkræft celler af en anden østrogen-receptor status blev brugt som model

in vitro

kræftformer for vækst hæmninger studier. Uanset cellelinje blev Polybees fundet at være bedre anti-cancer-formuleringer i forhold til Lipobee og gratis melittin kontrol.

Resultater og Diskussion

At designe en mere sikker samt effektiv levering systemet, vi forfulgte en stiv kerne nanosystem der potentielt kan bevare deres integritet i blodcirkulationen efter systemisk administration [10a-c]. På nanoskala niveau, stive kerne micellar (RCM) systemer kan enten stabiliseres ved amfifile PS

67-

b

-PAA

27 (polystyren-b-polyacrylsyre) (PRCM) eller ved phospholipider (lecithin PC) (LRCM) indkapsling (figur 1A). Vi forventer, at dette system vil give model arkitekturer, da hovedparten af ​​nanomedicin platforme er domineret af lipid og polymere systemer. Endvidere kan denne strategi også udvides til en serie af peptid-toksiner af forskellige naturlige kilder, kemi og størrelser.

For at undersøge de vigtigste interaktioner i melittin- PS

67-

b

-PAA

27 polymer og melittin-lecithin PC lipid-systemer, molekylær docking simuleringer blev udført og analyseret (figur 1B og 1C). Alle molekyler blev minimeret (Sybyl-X 2.0) [11] før docking med MOE 2013,08. For at undersøge de vigtigste interaktioner i melittin- PS

67-

b

-PAA

27 polymer og melittin-lecithin PC lipid-system, MOE-Dock [12] blev ansat til at dokke minimeret melittin til både PS

67-

b

-PAA

27 polymer og lecithin PC lipid-systemer. De fem bedste docking poserer med højeste S score (laveste docking energi) blev lagret, og opført i tabelform. Overlapninger af de fem bedste docking udgør i begge systemer viste i figur 2. Fra figur 2, kan det konstateres, at i melittin- PS

67-

b

-PAA

27 polymer docking struktur de fem docking rejser er i stor mangfoldighed, hvilket resulterer i store forskel i docking score mellem pose 1 og udgør 5 (14,5 kcal /mol). Men i melittin-lecithin PC lipid docking struktur, kan fem docking rejser overlejre meget bedre, hvilket resulterede i en lille docking score forskel mellem pose1 og udgør 5 (1 kcal /mol). Kropsbygning forskelle docking udgør af melittin til PS

67-

b

-PAA

27 polymer og lecithin PC lipid var forårsaget af de forskellige elektriske felter og steriske felter for disse to systemer.

Super-indførelsen af ​​de fem bedste docking udgør af melittin med lecithin PC og PS

67-

b

-PAA

27 polymer: (a) Docking positurer af melittin til PS

67-

b

-PAA

27 polymer; (B) docking udgør af melittin til lecithin PC. Det bedste scoret positur er i de grønne knyttet kæder med følgende mindre vedhæftede filer, der er anført i rækkefølge efter deres score som angivet af deres farve: Magenta, 2.; gul, 3rd; hvid, 4., og cyan, 5..

Fig 1A viser docking strukturer af bedste rejser på melittin til PS

67-

b

-PAA

27 polymer (fig 1B) og lecithin PC lipidsystemet (fig 1C). I fig 1B, kan det ses, at melittin-peptid forbliver tæt og paralleller godt med den hydrofile ende og en del af hydrofob sektion af polymeren. De hydrofile acrylsyre-rester af den dannede polymer kritiske hydrogenbinding interaktioner med amino- og hydroxylgrupper af aa-rester. Hydrofob phenyldel nær den hydrofile terminalen af ​​den dannede polymer hydrofobe interaktioner med sidekæder af aa rester af melittin. Gly1 at Ile17 ligge i den hydrofile ende henviser Ser18 til Gln26 ligger i den hydrofobe ende af polymeren. I detaljer aminogrupperne i rygraden i Gly1, Gly3, ALA4, Val5, Leu6, Gly12, Ala15 og Ile17, oxygenet både i sidekæden og rygraden i Thr11 dannet hydrogenbinding interaktioner med oxygen af ​​carboxylsyre af polymeren. Sidekæderne af Leu17, Trp19, Lys21, Arg24 og Gln26 danner hydrofobe interaktioner med phenyl- og carbonatomer i polymerens rygrad. For at sammenligne de vigtigste vekselvirkninger af docking poserer med lecithin PC-peptid-model, vi forankret i melittin peptid til lipid lecithin PC (Fig 1C). Selvom melittin viste sig at være godt sammenflettet med lipidet, dette peptid-lipid docking struktur var meget løste. Afstanden mellem de to molekyler blev ikke tæt nok; derfor ikke mange hydrogenbinding interaktioner og hydrofobe interaktioner eksistere som observeret for peptid-polymer-kompleks. De eneste interaktioner identificerede var aminogrupper i Arg22 og Arg24 danner brint bond interaktioner med ilt i keto og phosphonogrupper i lecithin PC lipid. De sidekæder af ALA4, Leu13 og Ile17 dannede hydrofobe interaktioner med alkylgruppen i lipid.

For yderligere at undersøge sekvens og størrelse afhængighed af peptider til Polybee og Lipobee luftfartsselskaber, vi valgte flere melittin peptidiske fragmenter til beregningsmæssige modellering undersøgelser (S1 Fig). Vi valgte (1) til højre 17-rester peptid, (2) venstre 9-rester peptid, og (3) midterste 16-rester peptid til dock til PS

67-

b

-PAA

27 polymer og lecithin PC lipidsystemet hhv. I docking struktur højre 17-rester peptid med PS

67-

b

-PAA

27 polymer, aminogrupper rygraden i THR1, siden kæden af ​​Lys 12, Arg13 og Arg15 , ilt carbonylgruppen i Lys 12, Gln17 og sidekæde af hydroxylgruppen i THR1, Thr2 og Ser10 dannet hydrogenbinding interaktioner med oxygen af ​​carboxylsyre af polymeren. I lecithin PC lipid docking struktur, aminogrupperne i rygraden i Lys14 og sidekæde af Arg13, og sidekæde af hydroxylgruppen i THR1 dannet hydrogenbinding interaktioner med oxygen i phosphonogrupper i lecithin PC lipid. I docking struktur venstre 9-rester peptid med PS

67-

b

-PAA

27 polymer, aminogrupper rygraden i Gly1, Ile2, ALA4 og Leu9, ilt carbonylgruppe af Val8 dannet hydrogenbinding interaktioner med oxygen af ​​carboxylsyre af polymeren. I lecithin PC lipid docking struktur, aminogrupperne i rygraden i Gly1, Ile2 og oxygenet af carbonylgruppen i Ile2 dannet hydrogenbinding interaktioner med oxygen i phosphonogrupper i lecithin PC lipid. I docking struktur af den midterste 16-rester peptid med PS

67-

b

-PAA

27 polymer, aminogrupperne i rygraden i Thr5, Gly7, Lys16, sidekæden af Trp14, ilt carbonylgruppe af Gly7 og sidekæde af hydroxylgruppen i Ser13 dannet hydrogenbinding interaktioner med oxygen af ​​carboxylsyre af polymeren. I lecithin PC lipid docking struktur, aminogrupperne i rygraden i Leu1, Lys2, Val3, Thr5 og sidekæden af ​​hydroxylgruppen i Thr5 dannet hydrogenbinding interaktioner med oxygen i phosphonogrupper i lecithin PC lipid.

analysen af ​​docking indebærer, kan klart forklare, hvorfor peptid-polymerstruktur er mere stabil end peptid-lipid struktur (tabel 1). Vi bemærkede, at tværtimod til docking rejser og interaktioner analyse, docking energi i lecithin PC lipid-system er lavere end PS

67-

b

-PAA

27 polymer system. Dette kan skyldes forskelle i gennemsnitligt entropi tab /gevinst på grund af den konformationel fleksibilitet og desolvation energi hvert atom snarere end for maksimal energi af H-binding mellem PS

67-

b

-PAA

27 polymer og lecithin PC lipid hvis størrelser er meget forskellige. I PS

67-

b

-PAA

27 polymer system, vil den hydrofile acrylsyre og hydrofobe styren enhed forholdet påvirker hydrogenbinding og hydrofobe interaktioner mellem melittin og polymersystemer, mens enheden længde ikke ændre disse interaktioner meget. S2 Tabel viser de snesevis af docking resultater af tre melittin fragmenter til polybee og lipobee. Som det ses, jo længere peptidsekvenserne, jo bedre opnåedes docking scores. Docking scoringer var bedre for peptid med PS

67-

b

-PAA

27 polymer end med lethicin PC lipid fordi mere brint bond interaktioner er involveret i en PS

67-

b

-PAA

27 polymer system.

en post-præparativ one-pot indsættelse metode blev anvendt til stabil indfangning af melittin og en generation af lipideret stive kerne micellar melittin (Lipobees) fra lipiderede stive kerne miceller (LRCMs). Tilsvarende polymeriseret stive kerne micellær melittin (Polybees) blev fremstillet ud fra polymeriserede stive kerne miceller (PRCMs). En typisk udarbejdelse af LRCMs og PRCMs involverede et præparat af ‘stiv kerne “af polyoxyethylene20 cetyl ether (Pece) efterfulgt af stabil belægning med lecithin PC eller PS

67-

b

-PAA

27 [ ,,,0],13]. Stabiliteten af ​​micellerne blev opnået ved hærdning af kernen ved 4 ° C (pece Smp: 32 ° C). RCMS blev derefter underkastet post-præparativ inkubation af melittin i vandig suspension i 30 minutter ved omgivelsestemperatur med mild vortexbehandling. Den hydrodynamiske diameter, morfologi, lagdelte arrangementer; topografi, elektroforetisk potentiale, og partikelstabilitet blev etableret under anvendelse af forskellige fysisk-kemiske eksperimenter. For at finde ud af lastning af melittin i LRCM og PRCM blev UV-absorbans spektroskopi udført. Det blev set, at signaturen absorbans for melittin ved 290 nm faldt ned i tilfælde af Lipobee og Polybee, sandsynligvis på grund af overfladen internalisering af melittin i LRCM og PRCM med post-interaktion metode.

LRCM havde en gennemsnitlig hydrodynamisk partikelstørrelse på 23 ± 2 nm, som voksede til 83 ± 3 nm i Lipobee primært på grund af overfladen interaktion melittin med RCM (figur 3). Ligeledes viste PRCM en gennemsnitlig hydrodynamisk diameter på 25 ± 5 som steg til 40 ± 8 nm i Polybee (figur 3). Stabiliteten af ​​disse PRCM partikler på tværs af forskellige tidspunkter ved stuetemperatur og pH 7,4 blev målt ved anvendelse DLS målinger, der viste et nominelle ændring i størrelsen af ​​PRCM og Polybee på mindre end 10%. Ligeledes havde LRCM størrelse ikke skifte til nogen signifikant niveau, mens Lipobee viste størrelse ændringer i ~ 40%, understreger den betydelige ustabilitet Lipobees sammenligne med den høje stabilitet Polybee. Stabilitet af carrier køretøjer har altid været stor bekymring for succesen med nano-levering protokoller. Derfor Polybee lover den sandsynlige bedre melittin levering svar sammenligne med Lipobee partikler under

in vitro

in vivo

bruger. Overfladen ladningstæthed for PRCMs var -12 ± 1 mV, som faldt ned til -6 ± 1 mV i Polybee efter inkubation med bi toksiner

syntese og karakterisering af stive kerne miceller og melittin indlæst partikler:. ( a) Syntese af PRCM og Polybee nanopartikler; (B) repræsentative TEM billeder af Polybee; (C) repræsentative AFM billeder af Polybee; (D) Syntese af LRCM og Lipobee nanopartikler; (E) repræsentative TEM billeder af Lipobee; (C) repræsentative AFM billeder af Lipobee; (F) UV-vis spektroskopi af melittin, LRCM, PRCM, Lipobee og Polybee; (G) fordelingen hydrodynamiske diameter (antal gennemsnit, nm). TEM prøver (20 pi) blev fremstillet på Formvar-coated carbon gitre og negativt farvet med uranylacetat og vakuumtørret før udførelse af mikroskopi. Prøver (20 ul) blev dråbe støbt på frisk spaltede glimmer ark og lufttørret i 24 før udførelse af aflytning modus AFM

På den anden side, zetapotentiale LRCMs viste en nominel ændring i. zeta potentiale, når konverteret til Lipobee. Dette betyder effektivitet gør coulombiske interaktioner af peptidet med den ydre corona af blokpolymerer bestående af poly (acrylsyre) rester. Vandfri tilstand morfologi Lipobee og Polybee partikler blev opnået ved 25 ± 5 nm størrelse i forhold til 22 ± 6 nm for LRCM og PRCM som studerede ved transmission (TEM, fig 3F). De repræsentative atomic force mikroskopi (AFM) billeder blev erhvervet fra drop støbte prøver på glimmer ark til at studere morfologi mønster af disse RCM partikler. Gennemsnitlige højdeværdier (H

av) af et repræsentativt udsnit var 25 ± 5 nm (figur 3G). Fysisk-kemiske beskrivelser af Polybees og Lipobees tyder på en potentiel over-kant for Polybees end Lipobees i formuleringen stabilitet og andre forudsætninger for at gøre dem bedre midler til systemisk anvendelse (tabel 2).

For at verificere kræft celle regression affinitet af disse formuleringer, blev cytotoksicitetsassays udført. Som et modelsystem til

in vitro

cancer kultur, vi valgte østrogen positive (MCF-7) og østrogen negativ brystcancerceller (MD-MB231) for at evaluere den funktionelle terapeutiske potentiale af Polybees og Lipobees. MCF-7 og MD-MB231 cellelinjer repræsenterer den tidlige fase og invasive menneskelige brystkræft cellelinier hhv. Uafhængigt af den cellelinje, udviste Polybee signifikant højere effektivitet sammenlignet med Lipobee og melittin som det fremgår af MTT-assays (figur 4). Ved 48h inkubation punkt, i MD-MB231-celler, IC50 værdi for Polybee er fundet ved ca. 40 ± 4 nM sammenlignet med ca. 70 ± 7 nM i tilfælde af Lipobee og ca. 110 ± 10 M til gratis melittin; desuden i MCF-7, blev IC50 værdi for Polybee fundet at være ca. 80 ± 8 nM sammenlignet med ca. 100 ± 10 nM i tilfældet med Lipobee og 105 ± 10 nM for fri melittin. I mellemtiden, LRCM og PRCM viste IC50 1000 nM uanset cellelinien, (Fig 4G). For celler behandlet med gratis melittin (100 nM), cellevækst tæthed og morfologiske ændringer var tegn på celledød, mens LRCM og PRCM ikke ændrede i nævneværdig grad (figur 4).

Repræsentative lyse felt billeder af cellevækst densitet og cancer cellemorfologi variation for MCF-7 (ac) og MD-MB231 (df) efter 48 h inkubation behandlet med melittin, LRCM og Lipobee, (g) IC50-værdier for forskellige formuleringer i tabelform; biostatistiske analyse på IC50-værdierne for Polybee respekt til melittin repræsenterer *** for p-værdi 0,001 og ** for p værdi 0,005 efter ONE ANOVA med Bonferroni indlæg test og (hi) levedygtighed% celle variationer med forskellig formulering i MD-MB231 og (jk) MCF-7 celler for (hj) polymer og (ik) lipid formuleringer.

de CH50 værdier for alle anvendte formuleringer blev fundet at være 6 ± 1 ved PRCM, LRCM, Polybee, Lipobee og melittin og 8 ± 1 og 3 ± 1 ved reference 1 og reference 2, henholdsvis (figur 5A). Selv

in vitro

eksperimenter etablerede Polybee og Lipobee som potente anti-cancer-formuleringer, deres formodede adfærd for

in vivo

applikationer stadig forblev uklart.

In vivo

succes sådanne formuleringer meget meget afhænger af to vigtige faktorer i) neutralitet mod blod supplerer og ii) bæredygtig overførselsteknikker nyttelast gennem systemiske kredsløb. Vores beregningsmæssige undersøgelser er vejledende for stærkere, strammere interaktion af melittin med de amfifile polymer kæder i direkte sammenligning med lipid, hvilket gør Polybees; dermed melittin med sin stive kerne og polymere skal er en bedre kandidat til

in vivo

ansøgning. For at bekræfte denne observation eksperimentelt, vi udforsket komplementaktivering og melittin sustaining evnen af ​​disse formuleringer i blodserum. Som supplement dette system vil en gruppe af proteiner aktiverer føre målcellelysis og lette fagocytose gennem opsonisering ved udsættelse for faste fremmede materialer i kredsløbssygdomme systemisk fluid. Den CH50 assay, der screener aktiveringen af ​​klassiske komplementære veje fundet at være følsomme over reduktionen, fravær og /eller inaktivitet af enhver komponent i vejen. Den supplerende CH50 analysen er baseret på lyse af sensibilized får erythrocytter i overværelse af Ca

2+ og Mg

2+. Når sensibilized fåre-erythrocytter inkuberes med testserum af forskellige behandlinger, er forskellige niveauer af hæmolyse opnået. CH50 komplementaktivering assay blev udført for alle de anvendte formuleringer her og fundet at være meget inert i aktivering af komplementære proteiner, der viser ingen signifikant ændring i CH50 værdier sammenlign normale komplementære niveau plasma (Reference 1, dvs. 8 ± 1).

(a) Som supplement til aktivering og (b) melittin nedsivningsmønstret for Lipobee og Polybees. Gratis melittin blev LRCM og PRCM anvendt som kontrol; (C) optisk mikroskopi billeder af blodudstrygninger ubehandlede (i) og behandlet med melittin (1:10) (ii), LRCM (1:10) (iii), Lipobee (1:10) (iv), PRCM (1: 10) (v) og polybee (1:10) (vi) henholdsvis (med 20x forstørrelse). Melittin- og Lipobee-behandlet gris blod i alvorligt klumpet, morfologisk forvrænget tilstand er vist i (ii) og (iv). Mellemværker i (ii) og (iv) viser røde blodlegemer morfologi at fremhæve andre lignende morfologiske mønstre hele prøven.

CH50-værdier for alle anvendte formuleringer blev fundet at være 6 ± 1 ved PRCM , LRCM, Polybee, Lipobee og melittin og 8 ± 1 og 3 ± 1 ved reference 1 og reference 2, hhv. Det indikerer, at formulering PRCM, LRCM, Polybee, Lipobee og melittin inducerede ikke nogen supplement til enhver signifikant niveau. Det understøtter muligheden for at benytte disse formuleringer

in vivo

uden risiko for at fremkalde immunrespons.

For yderligere at vurdere fordelene ved at bruge Polybee løbet Lipobee til systemisk levering, melittin udvaskning karakteristisk for disse formuleringer var evalueret og estimeret ved at udføre en MTT assay på MD-MB231-celler. Udludede melittin opnået efter inkubering Polybee og Lipobee med 10% føtalt bovint serum (FBS) i DMEM-buffer blev anvendt ved fortyndinger 1, 2, 4, 8 og 16 for MTT-assays. En kendt melittin koncentration blev anvendt som en positiv kontrol i området fra 20-1.25 uM. MTT-assays udviste en høj mængde melittin udvaskes fra Lipobee forårsager en høj procentdel af celledød ved hver fortynding sammenlignet med celler behandlet med melittin udvaskes fra Polybee hvilket giver en meget signifikant bio-statistiske signifikans (p 0,001) ved fortyndingsfaktor 1. på den anden side, med den samme fortynding, melittin udvaskes fra Polybee, hvilket resulterer i et betydeligt fald i celle population død uden nogen væsentlige ændringer i cellernes levedygtighed (fig 5B). Disse resultater viste, at under systemisk administration af Lipobee, kan en stor mængde af melittin udludes i kredsløbet fluid inden de når kræftcellerne derved forårsager et betydeligt tab i anti-cancer effektivitet.

Polybee nanopartikler har også udvist bemærkelsesværdig vigør når blandes med svineblod. A ‘blod smøre “præparat blev gjort for at identificere eventuelle morfologiske variationer i lymfocytter og blod sammenklumpning overvåges af en klinisk optisk mikroskopi teknik (konventionel lysmikroskopi) under en høj effekt felt (Fig 5C). Ingen overfladiske trampende eller morfologiske omskiftelser i blodceller blev observeret i frisk svineblod behandlet med PRCM, LRCM og Polybee (blod: NP = 10: 1). Men svineblod behandlet med gratis melittin og Lipobee udstillet betydelig sammenklumpning og morfologiske ændringer (figur 5C, ii og iv). For at forstå den plausibel mekanisme melittin frigørelse fra Lipobee og Polybee

in vitro

, yderligere undersøgelser blev gennemført. Frigivelse af terapeutiske midler fra nanopartikler er blevet rapporteret som pH responsiv og /eller interaktive med anionisk lag af endosomale rum i cellulære systemer. Disse faktorer kan undersøge reaktionsevne brugte nanopartikler for at nå en mekanisme sandsynlig udgivelse. Vi brugte denne strategi til at indsnævre vores udvalg af fordelagtige veje for melittin frigørelse fra Lipobee og Polybee nanoformulations. Lipobee og Polybee blev fremstillet som tidligere beskrevet efterfulgt af inkubation ved pH 4,6 og i nærværelse af natriumdodecylsulfat (SDS, 1 mM) i 2 timer. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev en hydrodynamisk diameter erhvervet til forskellige formuleringer ved anvendelse af dynamisk lysspredning. Størrelser på 0 timer blev anset som kontrol til forsøgene (S2 Fig).

DLS resultater viser klart variationen i størrelsen af ​​Lipobee og Polybee kun i nærvær af SDS (5 mM) uden nogen signifikant virkning ved en lavere pH (S2 fig). Det understøtter den plausible forekomst af anioniske interaktion i en endosomale rum ansvarlig for melittin frigørelse fra Polybee og Lipobee. Derudover forekom en højere ændring i størrelsen af ​​Lipobee ved inkubering med SDS ensbetydende en højere lipid-overfladeaktive interaktion.

peptid-polynucleotid interaktioner er altid vakt interesse hos medicinske kemikere. Det er af særlig interesse for dechifrere melittin DNA interaktioner og forstå deres rolle i dissociation fra DNA sekundære struktur. Gelelektroforese blev udført for at muliggøre observation af ændringer i elektroforetiske mobilitet mønstre af pBR322 inkuberet med forskellige formuleringer i nærværelse (melittin, Polybee og Lipobee), og i mangel af melittin (LRCM og PRCM) samt forskellige koncentrationer af frit melittin ( 50-0,0005 uM).

det blev konstateret, at kun fri melittin var i stand til at dissociere plasmid-DNA. Til gengæld blev tabet af elektroforese båndet opnås enten ved at forsinke DNA migration eller ved at udvise det indlejrede EtBr (Ethidiumbromid) på grund af store fordybning binding af melittin i DNA-duplex. Formuleringer med beskyttet melittin i nogen af ​​tilfældene, Lipobee og Polybee, ikke påvirker DNA-båndene i væsentligt omfang (S3A Fig).

En yderligere gelelektroforese Undersøgelsen viste, at ~ 0.05 pM gratis melittin var tilstrækkelig til at starte dissociationen af ​​et DNA-sekundær struktur (S3B fig). Samspillet mellem melittin med DNA i fri form betyde, at en frigørelse fra Lipobee og Polybee kan målrette genomisk DNA, hvilket kan forlænge til niveauet hindre transskriptionsprocessen. Dog kan ingen interaktion finde sted, hvis melittin stabilt er indarbejdet. Her ingen signifikant effekt fra LRCM og PRCM på DNA mobilitet viste, at disse partikler ikke har en aktiv rolle at spille i DNA interaktion og melittin er den eneste komponent i Polybee og Lipobee til at deltage i interaktion med DNA duplex.

Proteiner er vigtige bestanddele af blodserum og imødegå belastningen køretøj og pharmacoactive agenter leverer samtidig gennem systemiske oplag. Enhver obstruktion i normal adfærd af sådanne blod serumproteiner kan føre til skadelige konsekvenser for emnet. Som et modelsystem for undersøgelse valgte vi kalvefosterserum at etablere virkninger af fri melittin og dens nanoformulations, Lipobee og Polybees på normale spektroskopiske egenskaber. UV-absorbans undersøgelse blev udført på 50 uM melittin inkuberet (fri eller nanoformulation form) 10% FBS opløsning. Ingen hypso- eller bathochromic skift i UV-absorbans mønster blev bemærket fra FBS løsning, men absorbansen blev forøget efter inkubation med gratis melittin. Et fald i absorbans blev set i tilfælde af Lipobee, som nåede et niveau svarende til ubehandlede FBS i forhold til Polybee (S3C Fig). Denne observation kan forklares på grund af den ekstra absorbans fra tilføjede formuleringer, der betyder ingen specifik interaktion af melittin i fri eller nanoformulation formular med serumproteiner.

Den skæbne frigivet melittin kan rationaliseres i forhold til dens interaktion med genomisk