PLoS ONE: Transforming Growth Factor β Signaling overvinder Dasatinib Modstand i lungekræft

Abstrakt

Lungekræft er den anden mest almindelige kræftform og den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald. Trods nylige fremskridt i udviklingen af ​​målrettede behandlinger, patienter med fremskreden sygdom forbliver uhelbredelig, mest fordi metastatisk ikke-småcellet karcinom (NSCLC) i sidste ende blive resistente over for tyrosinkinasehæmmere (TKI’er). Kinaseinhibitorer har potentiale for target promiskuitet fordi kinase super familie er den største familie af druggable gener, der binder til et fælles substrat (ATP). Som følge heraf har TKI’er ofte udviklet til et bestemt formål vist sig at virke på andre mål. Drug affinitetskromatografi er blevet anvendt til at vise, at dasatinib interagerer med TGFp type I receptor (TβR-I), en serin-threonin-kinase. For at bestemme den potentielle biologiske relevans af denne forening, vi studerede den kombinerede effekt af dasatinib og TGF om lungekræft-cellelinjer. Vi fandt, at dasatinib behandling alene havde meget ringe effekt; men når NSCLC cellelinjer blev behandlet med en kombination af TGFp og dasatinib, blev apoptose induceret. Kombineret TGFp-1 + dasatinib behandling ikke havde nogen effekt på aktiviteten af ​​Smad2 eller andre ikke-kanoniske TGFp intracellulære mediatorer. Interessant, kombineret TGFp og dasatinib behandling resulterede i en forbigående stigning i p-Smad3 (set efter 3 timer). Hertil kommer, når NSCLC-celler blev behandlet med denne kombination, den pro-apoptotiske protein BIM blev opreguleret. Knockdown af ekspressionen af ​​Smad3 hjælp Smad3 siRNA resulterede også i en nedgang i BIM-protein, hvilket antyder, at TGFp-1 + dasatinib-induceret apoptose medieres af Smad3 regulering af BIM. Dasatinib er kun effektiv til at dræbe EGFR mutant celler, som er vist i kun 10% af NSCLCs. Derfor er den observation, at vildtype-EGFR lungekræft kan manipuleres til at gøre dem følsomme for drab ved dasatinib kunne have stor betydning for at udtænke innovative og potentielt mere effektive behandlingsstrategier for denne sygdom

Henvisning:. Gordian E, Li J, Pevzner Y, Mediavilla-Varela M, Luddy K, Ohaegbulam K, et al. (2014) transformerende vækstfaktor β Signaling overvinder Dasatinib Modstand i lungekræft. PLoS ONE 9 (12): e114131. doi: 10,1371 /journal.pone.0114131

Redaktør: Arun Rishi, Wayne State University, USA

Modtaget: Marts 27, 2014 Accepteret: 3 oktober 2014; Udgivet: 11. december 2014

Copyright: © 2014 gordiske et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health SPORE Grant P50 CA119997-02-S2. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den anden mest almindelige kræftform og tegner sig for omkring 15% af alle kræftdiagnoser. Trods nylige fremskridt i udviklingen af ​​målrettede behandlinger, patienter med fremskreden sygdom forbliver uhelbredelig. På grund af den genetiske mangfoldighed inden for tumorer, celler med aktiverede alternative vækst veje til sidst frem; således at forstå de mekanismer, hvormed forskellige veje er tændes og slukkes er vigtigt i udformningen nye målrettede behandlinger. Selv om nogle kræftformer er oprindeligt meget følsomme over for tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er), modstand efterhånden udvikler sig. For eksempel, et flertal af metastatisk ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter med EGFR-aktiverende mutationer reagerer på behandling med erlotinib; Men alle patienter i sidste ende fremskridt. Derfor er der et presserende behov for alternative terapier for patienter med EGFR-mutationer, der initialt responderer på EGFR TKI’er terapier men til sidst udvikle resistens, samt for patienter, der udviser vildtype EGFR genotype [1]. Denne modstand kan være delvis på grund af den kompleksitet, som kendetegner signalering af disse typer af proteiner samt heterogenitet lunge adenokarcinomer [2]. Dasatinib, en TKI med flere kinase mål, er ved at blive testet for at behandle forskellige maligniteter, hvor disse mål overeksprimeres, herunder kronisk myeloid leukæmi og brystkræft og lungekræft [3], [4], [5]. Kliniske forsøg har testet effekten af ​​dasatinib i NSCLC som et enkelt middel [6], i kombination med for tiden anvendte kemoterapi såsom epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) inhibitor erlotinib [7], og hos patienter, som har udviklet resistens over for erlotinib og gefitinib [8]. Song

et al

vist, at dasatinib inducerer apoptose i en række NSCLC celler, der udviser en mutant EGFR fænotype; dog blev denne effekt ikke observeret i NSCLC-cellelinier med en vildtype EGFR fænotype [9].

transformerende vækstfaktor β (TGFp) er et cytokin involveret i talrige cellulære processer, herunder vækst, proliferation, adhæsion , migration, og apoptose. Desuden har tab af respons til TGFp-1 blevet korreleret med tumorigenicitet i mange forskellige typer cancer [10]. TGFp signaltransduktion begynder med ligandbinding til TGFp type II receptor (TβR-II) efterfulgt af rekruttering af type I-receptoren (TβR-I) og dannelse af en hetero-oligomert kompleks af TGFp-1, TβR-II, og TβR -I [11]. Efter kompleksdannelse, den konstitutivt autophosphoryleret TβR-II phosphorylerer TβR-I, indlede en phosphorylering kaskade af downstream cytoplasmatiske substrater, herunder Smad proteiner, med efterfølgende aktivering af målgener [10]. Den krydstale mellem TGF-vejen og mange andre signaltransduktionsveje resulterer i modificering af den oprindelige TGF-signal gennem ikke-kanoniske veje og bruges til at forklare de mange virkninger af TGF [12], [13], [14]. I normale epitelceller, TGFp inhiberer celleproliferation og inducerer apoptose, ville dermed være til tumorsuppressor; men i mange cancertyper, TGFP fungerer som en tumor promotor (celle invasion, metastase, immune regulering, og mikromiljø modifikation) [15].

Drug affinitetskromatografiharpikser eksperimenter viste, at dasatinib, oprindeligt udviklet som en SRC-hæmmer [16], interagerer med over 40 kinaser, inklusive tyrosinkinaser, receptortyrosinkinaser, serin /threonin-kinaser, og MAP-kinaser. En af serin /threonin-kinaser, der blev identificeret ved hjælp af denne fremgangsmåde var den TGFp type I receptor (TβR-I) [17]. For at bestemme den potentielle biologiske relevans af denne forening, vi studerede den kombinerede effekt af dasatinib og TGF på NSCLC-cellelinjer. Vi fandt, at dasatinib behandling alene havde meget ringe effekt; men når NSCLC cellelinjer blev behandlet med en kombination af TGFp og dasatinib, blev apoptose induceret. Dasatinib er kun effektiv til at dræbe EGFR mutant celler [9], som tegner sig for 10% af NSCLCs; derfor, at den observation, at lungekræft kan manipuleres gøre dem følsomme for drab ved dasatinib kunne have stor betydning for udformningen innovative og potentielt mere effektive behandlingsstrategier for denne sygdom.

Materialer og metoder

cellekultur

den humane lunge adenocarcinom NCI H292 og A549-cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i RPMI-1640 medium (Thermo Scientific, Waltham, MA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Inc., Lawrenceville, GA), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 1 mM glutamin. De cellelinjer blev opretholdt i et fugtigt inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2.

Antistoffer og forbindelser

Polyklonale anti-Shc1 antistof blev opnået fra Thermo Scientific Pierce (Rockford , IL), og polyklonalt anti-MADH7 (Smad7) antistof blev købt hos Abcam Inc. (Cambridge, MA). Anti-HDAC2 blev erhvervet fra Millipore (Billerica, MA). Følgende antistoffer blev købt hos Cell Signaling Technology (Danvers, MA): anti-pSma2 (linker og COOH specifik phosphorylering), anti-Smad2, anti-pSmad3, anti-Smad3, anti-Pakt, anti-pERK, anti-BIM, anti-PARP, og anti-GAPDH. Rekombinant human TGFp-1-protein blev indkøbt fra R disse blev rangeret efter de egenskaber, der inkluderede hydrofobicitet, eksponering opløsningsmiddel og hydrogenbinding potentiale. Indledende Glide [32], [33] SP (standard præcision) efterfulgt af XP (ekstra præcision) docking af de fire forbindelser blev udført til top 3 bindingssteder. Baseret på denne indledende docking blev site 1 valgt som mere sandsynligt bindingssted. Site 1, som korrelerer til lommen hvor dorsomorphin blev beskrevet, blev også rangeret højest af SiteMap.

Efterfølgende docking undersøgelser blev udført ved hjælp Induceret Fit Docking (IFD) [32], [34] workflow i Maestro. IFD workflow regnskab for receptor fleksibilitet ved stikprøver orienteringer af webstedet kæder inden for bindende region ved dokning af liganden. Flere ligand konformationer er forankret på en sådan måde og scoret med Glide. Hver ligand blev forankret i site 1 afgrænset af liganden bedste scoring udgøre fra den oprindelige SP docking ind site 1. For hver ligand IFD scorede og rapporterede flere (-50) protein-ligand konformationer fra hvilket gennemsnitsværdien IFD score blev beregnet.

Proliferation /Cytotoxiticy

A549-celler blev podet i plader med 96 brønde ved 5 x 10

3 celler per brønd i tre eksemplarer. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med de angivne koncentrationer af TGFp-1, dasatinib eller TGFp + dasatinib tilsammen. Efter en 48-timers inkubation blev proliferation /cytotoksicitet målt ved tilsætning af CellTiter 96 One Solution (Promega Corporation, Madison, WI). Efter tilsætning blev cellerne efterladt til inkubering i 1 time, og absorbansen blev målt ved 490 nm i en Biotek EL808-mikropladelæser (BioTek Instruments Inc, Winooski, VT). Behandlede prøver blev normaliseret til ubehandlede kontroller, og resultaterne er angivet i procent.

Western blotting

Whole-celleprotein ekstraktion blev udført ved ophugning af cellerne i kold 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS), efterfulgt af lydbehandling og lyse i 1X CHAPS buffer (Cell Signaling Technology). For at bestemme den subcellulære lokalisering af Smads proteiner blev celler fraktioneret i nukleare og cytoplasmiske komponenter som tidligere beskrevet [35]. Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af Bradford assay (Bio-Rad, Hercules, CA). Proteinlysater blev opløst ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), overført til polyvinylidenfluoridmembran (Millipore Corporation, Billerica, MA), blokeret i 1 time i 1X TBST indeholdende 5% fedtfri mælk og inkuberet natten over i tilsvarende primært antistof ved 4 ° C. Blots var færdige ved inkubation med peberrodsperoxidase-mærket sekundært antistof og udviklet ved hjælp af Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA).

Caspase assay

A549 celler podet i plader med 96 brønde ved 5 x 10

3 celler pr. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med de angivne koncentrationer af TGFp-1, dasatinib eller TGFp + dasatinib kombineret, og Cell Player 96 brønde kinetisk caspase 3/7 reagens blev tilsat samtidigt (Essen Bioscience). Behandlinger blev udført tre gange. Inkubation blev udført i et fugtigt inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2 med IncuCyte levende celler imaging system (Essen Bioscience), hvilket tillod os at fange et billede fra hver brønd gennem et x 20 objektiv og GFP filter terning med intervaller 2-timers til 48 timer. Den første og sidste billeder af hvert billede sæt blev udtrukket til analyse med Definiens Developer version 1.5 (Definiens Inc., München, Tyskland), og caspase 3/7-positive celler blev identificeret og opdelt af en autothreshold segmentering algoritme. Denne segmentering blev yderligere forfinet af objekt størrelse, og til sidst antallet af caspase 3/7 celler blev optalt. Værdier er repræsenteret som det gennemsnitlige antal af caspase 3/7-positive celler fra tre uafhængige forsøg.

Cellecyklusanalyse

A549-celler blev podet ved 3 × 10

5 celler per brønd i 6-brønds dyrkningsplader. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med 5 ng /ml TGFp-1, 100 nM dasatinib eller vehikel (DMSO). Efter behandling blev flydende celler opsamlet og senere kombineres med adhærente celler høstet ved trypsinisering. Cellerne blev resuspenderet i 1X PBS, fikseret i 2 ml iskold 70% ethanol og inkuberet i 2 timer ved -20 ° C. Cellepellets blev opsamlet ved centrifugering (5.000 rpm i 5 minutter) og resuspenderet i 400 pi propidiumiodid (0,6 mM), Triton X-100 (0,1% v /v), og RNAse A (0,2 mg /ml). Efter 30 minutters inkubation ved 37 ° C blev cellerne analyseret for DNA-indhold ved anvendelse af et FACS Calibur (BD Bioscience, San Jose, CA), og data blev analyseret under anvendelse ModFit LT V3.3.11 software (Verity Software House, Topsham, ME).

siRNA eksperimenter

ON TARGETplus SMART pool siRNA mod

Shc1

,

Smad3

, og negativ kontrol blev købt fra Dharmacon (Thermo Scientific) . Hver pulje blev rekonstitueret i 1X siRNA puffer (Dharmacon) og fortyndet i DEPC-behandlet vand til en slutkoncentration på 20 uM. Forbigående transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Grand Island, NY). Kort beskrevet blev celler podet i plader med 6 brønde og transficeret efter 24 timer ved 60-70% konfluens. Den lipofectamin RNAiMAX, OptiMEM (Invitrogen), og 200 pmol siRNA blanding blev inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur og tilsat til cellerne inkuberet i serumfrie medier. Efter inkubation ved 37 ° C i 4 timer blev mediet fjernet. Celler blev derefter vasket en gang i 1 x PBS, og forbindelse holdige medier blev tilsat til cellerne. Celler blev høstet 48 timer efter transfektion for protein udvinding forberedelse.

Resultater

TβR-I docking studier

Forsøg med lægemiddel affinitetschromatografi til at identificere molekyler, som interagerer direkte med dasatinib har identificeret over 40 kinaser, inklusive tyrosinkinaser, receptortyrosinkinaser, serin /threonin-kinaser, og MAP-kinaser. En af serin /threoninkinaser er identificeret ved hjælp af denne fremgangsmåde er TβR-I [17]. TβR-I har en cystein-rige N-terminale domæne er involveret i ligandbinding, en enkelt transmembrant helix, en regulatorisk cytoplasmatisk juxtamembran region og en C-terminal serinthreoninkinasedomæne [36]. For at undersøge bindingen af ​​dasatinib til TβR-I, udførte vi docking undersøgt med de tidligere rapporterede krystalstrukturen af ​​TβR-I cytoplasmatiske domæne [18]. Som beskrevet i Materialer og Metoder, stedet betegnet site 1 blev valgt som mere sandsynligt bindingssted. I vores undersøgelser har vi sammenlignet bindingen af ​​dasatinib, bosutinib (strukturelt relateret til dasatinib), LY-364.947 (TβR-I kinase kommercielt tilgængelig inhibitor [37]), og dorsomorphin (oprindeligt brugt i TβR-I krystallisering undersøgelser). Hver ligand var forankret i stedet en defineret af liganden bedste scoring udgøre fra den oprindelige standard præcision docking i stedet 1. For hver ligand, Induceret Fit Docking (IFD) blev scoret, med flere (-50) protein-ligand konformationer rapporteret, hvorfra den gennemsnitlige IFD score blev beregnet (fig. 1C). Vores docking Resultaterne af de fire ligander af interesse viste, at dasatinib scorede højest. IFD protokol rapporterede, at TβR-I -dasatinib dannet den bedste scoring kompleks (IFD score på ca. -14.742 kcal /mol) samt scoret bedre i gennemsnit (IFD score på ca. -14.694 kcal /mol) i løbet alle rapporterede komplekser. Den bedste TβR-I-dorsomorphin Komplekset havde en IFD score på omkring -14.519 kcal /mol med gennemsnittet af -14.469 kcal /mol. Bosutinib og LY-364.947 udførte de fattigste, med de bedste protein-ligand komplekser scorer på ca. -14.353 kcal /mol og -14.154 kcal /mol henholdsvis og gennemsnit -14.313 kcal /mol og -14.119 kcal /mol. Analyse af toppen positur produceret af fleksible docking modellen viser, at bosutinib interaktion med bindingsstedet omfatter fire hydrogenbindinger med rester Pro-439, Thr-378, Asn-341 og Tyr-219 i afstande på 2,4, 2,18, 2,37 og 2,25 Å og med respektive vinkler på 120,7, 144,8, 154,1 og 151,6 grader (fig. 1A). Omvendt dasatinib danner tre hydrogenbindinger med Arg-218, Asn-341 og His-284 i afstande på 1,97, 2,00 og 2,32 Å og vinkler på 145,9, 150,3 og 139,7 grader (fig. 1B).

ligand interaktion diagram af (A) bosutinib og (B) dasatinib forankret i TβR-1. Ligand er repræsenteret i sort. Hydrogenbindinger er mærket med tal ved siden af ​​obligationen. Afstande og vinkler på hver hydrogenbinding som mærkede i diagrammet er givet i tabeller i hver figur. (C) site 1 IFD resultater. Gennemsnitlig (sort) og bedste (hvid) IFD scoringer af de fire forbindelser forankret i stedet 1 baseret på -50 rapporterede rejser for hver forbindelse. IFDScore ganges med -1 for klarhed præsentation.

Dasatinib påvirker respons på TGF-1 i NSCLC cellelinjer

For at bestemme den potentielle biologiske relevans af sammenhængen mellem dasatinib og TβR-i, A549 lungekræft celler dyrket i komplette medier indeholdende TGFp-1 blev inkuberet i nærvær eller fravær af forskellige koncentrationer af dasatinib som tidligere beskrevet [9]. Enkelt behandling med TGFp-1 eller dasatinib inhiberede celleproliferation (45% og 34%, henholdsvis;. Figur 2A, asterisker). Interessant denne inhibering af proliferation øges, når celler blev behandlet med en kombination af TGFp-1 og dasatinib (75% inhibering;. Figur 2A, dobbelt asterisk). Stigningen i inhibering af proliferation var afhængigt af dasatinib dosis. Lignende resultater blev opnået, når cellelevedygtighed blev anvendt til at bestemme antallet af celler (S1 figur). For yderligere at forstå den observerede inhibering i celleproliferation, undersøgte vi virkningen af ​​denne kombinerede behandling på cellecyklusprogression. Efter 48 timers behandling med TGFp-1 og dasatinib, stigningen i celler i G1 var ikke signifikant forskellig fra når cellerne blev behandlet med TGFp-1 alene (fig. 2B, optrukket linje). Ligeledes med den dobbelte behandling, var der en stigning i antallet af celler i G2 /M efter TGFp-1 behandling, men stigningen i celler var ikke forskellig fra når celler blev behandlet med dasatinib alene (fig. 2B, stiplet linie) . Derfor kan reduktionen i celleantal efter TGFp-dasatinib kombinationsbehandling ikke forklares med ændringer i cellecyklus.

(A) A549-celler blev behandlet med DMSO, forskellige koncentrationer af TGFp-1 (0-10 ng /ml; hvide søjler), forskellige koncentrationer af dasatinib (0-400 nM; sorte søjler), eller en kombination af TGFp-1 og dasatinib (stiplet søjler) i 48 timer. Behandling af celler med begge midler resulterede i øget inhibering (**), sammenlignet med når celler blev behandlet med enten middel alene (*). (B) A549-celler blev behandlet med DMSO, 5 ng /ml TGFp-1, 100 nM dasatinib, eller en kombination af 5 ng /ml TGFp-1 og 100 nM dasatinib i 48 timer. Efter 48 timer blev propidiumiodid farvede celler analyseres for at bestemme cellecyklusfordeling og analyseret som beskrevet i Materialer og Metoder.

Øget apoptose i celler behandlet med TGFp i kombination med dasatinib

TGFp er blevet impliceret i pro-apoptotiske responser samt anti-apoptotiske responser [38]; Derfor undersøgte vi, om hæmning af spredning ses efter kombineret TGF + dasatinib i A549 celler var resultatet af apoptotisk celledød. Apoptose blev målt ved poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltning efter behandling med TGFp-dasatinib kombination. Dasatinib eller TGFp-1 alene ikke inducere apoptose som målt ved PARP spaltning (fig. 3A). Dette er i overensstemmelse med, hvad der er blevet rapporteret før, hvor behandling af A549 celler med dasatinib ikke resulterede i apoptose [4]. I modsætning hertil kombinationen af ​​TGFp + dasatinib resulterede i apoptose, specifikt at co-behandling med dasatinib, som inkubation med en EGFR-inhibitor (erlotinib) eller et andet SRC inhibitor (AZD0530) resulterede ikke i PARP-spaltning (fig. 3A). At vurdere, om

de novo

proteinsyntese er påkrævet for TGFp + dasatinib-induceret apoptose, A549-celler blev forbehandlet med 10 pg /ml cycloheximid i 1 time efterfulgt af TGFp-1 behandling med eller uden dasatinib. Som vist i fig. 3B, tilsætning af cycloheximid hæmmede ikke stigningen i apoptose, hvilket tyder på, at

de novo

proteinsyntese er ikke påkrævet. Vi undersøgte effekten af ​​kombinationsbehandlingen i 15 NSCLC cellelinjer (13 EGFR WT og 2 EGFR MU) og fundet øget PARP-spaltning i 5 af dem, når de behandles med kombinationen TGFp + dasatinib behandling (S2 figur).

(A) A549-celler blev behandlet med 100 nM af dasatinib, 1000 nM AZD0530 eller erlotinib med eller uden 5 ng /ml TGFp-1 i 48 timer. (B) A549-celler blev forbehandlet med 10 ug /ml cycloheximid (CHX) i 1 time, efterfulgt af TGFp-1 plus eller minus dasatinib. Efter inkubation blev cellerne høstet, lyseret, og PARP-spaltning detekteret ved Western blot-analyse. (C) A549-celler blev podet i plader med 96 brønde ved 5 x 10

3 per brønd.

C

alen blev behandlet, og Cell Player 96-Well Kinetic Caspase 3/7 Reagens blev tilsat samtidigt. Behandlinger blev udført tre gange. Værdier er vist som det gennemsnitlige antal caspase 3/7 positive celler fra 3 uafhængige eksperimenter.

For at bekræfte TGFp + dasatinib-induceret apoptose, en caspase-3/7-assay (Incucyte) blev anvendt til samtidig celledød og caspase 3/7 aktivitet. Som vist i fig. 3C TGFp + dasatinib kombination behandling resulterede i en signifikant stigning (92%) i antallet af celler, som undergår apoptose sammenlignet med enten behandling alene (22% og 19%, henholdsvis). Derudover TGFp-dasatinib kombination resulterede i tab af mitokondrie elektriske spænding og frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier (data ikke vist), hvilket antyder, at den observerede apoptose er resultatet af aktiveringen af ​​intrinsic (mitochondrial) apoptotiske veje.

TGFp-1-dasatinib virkning på aktiviteten af ​​TGFp intracellulære mediatorer Salg

TGFp er blevet vist at stimulere flere intracellulære signalveje, herunder Smad pathway (kanonisk pathway) og andre intracellulære mediatorer, herunder p38 mitogen-aktiveret protein kinase (MAPK), AKT, og ERK (ikke-kanoniske veje) [39]. Derfor vi næste undersøgt, om TGF-dasatinib behandling aktiveret disse veje ved hjælp af antistoffer, der registrerer det phosphorylerede (aktiveret) form af de mediatorer af både de kanoniske og ikke-kanoniske veje. Som vist i fig. 4, udtryk for aktiveret Smad2 eller Smad3 blev ikke observeret i hele celleekstrakter af enten ubehandlede eller dasatinib-behandlede celler, men blev observeret efter TGFp-1 behandling eller efter behandling med TGFp + dasatinib. Interessant, niveauer af phosphoryleret Smad3 efter behandling med TGFp-dasatinib er højere end niveauet med TGFp-1 behandling alene. Stigningen i p-Smad3 set efter 1 times TGFp-dasatinib kombinationsbehandling i Smad3 aktivering er forbigående, da det ikke kan ses 48 timer efter behandling (data ikke vist). Dette er i modsætning til Smad2 phosphorylering, som kan ses så tidligt som 5 minutter og forbliver phosphoryleret før 48 timer. Dette kan skyldes den betydeligt kortere halveringstid Smad3 (4,7 timer) sammenlignet med Smad2 (12,5 timer) [40]. Forbehandling med TβR-I-inhibitor LY364947, blokke Smad2 phosphorylering i nærvær eller fravær af dasatinib (fig. 4B). Som forventet er SRC fosforylering hæmmes ved tilstedeværelse af dasatinib, og inkubation med TGFp-1 påvirker ikke denne hæmning.

A549 NSCLC celler blev behandlet med DMSO, 5 ng /mL TGFp-1, 100 nM dasatinib eller en kombination af 5 ng /ml TGFp-1 og 100 nM dasatinib for forskellige mængder af tid (1 time til påvisning af pSmad2 og pSmad3, og 48 timer til påvisning af pSrc). Efter inkubation blev hele cellelysater samlet og underkastet Western blotting med de angivne antistoffer.

Lokalisering og aktivitet af Smads proteiner er afhængige af phosphorylering status i COOH og linker-regioner [41]. For at bestemme hvorvidt stigningen i apoptose observeret med kombinationsbehandlingen skyldes ændringer i placeringen af ​​Smads, undersøgte vi virkningen af ​​den kombinerede TGFp-dasatinib behandling på lokalisering af de aktive Smads. Efter 48 timers TGFp-1 eller kombinationsbehandling af TGFp-dasatinib, celleekstrakter blev fraktioneret og de phosphorylerede Smads blev undersøgt i hver fraktion. Som vist i fig. 5A Smad2 phosphoryleret i carboxyterminale ender (p-Smad2 COOH) forøger overvejende kernen. Den Smad2 phosphoryleret i linker-regionen (p-Smad2 Linker) øger også efter behandling med TGFp-1, men en større mængde forbliver i cytoplasmaet. Interessant er mængden af ​​phosphoryleret Smad3 efter TGFp-1 behandling akkumuleres også i kernen, uafhængig af dasatinib behandling (fig. 5B).

A549-celler blev behandlet med DMSO, 5 ng /ml TGFp-1, 100 nM dasatinib, eller en kombination af 5 ng /ml TGFp-1 og 100 nM dasatinib i 48 timer. Efter behandling blev cellelysater indsamlet og de nukleare og cytoplasmiske fraktioner blev adskilt som tidligere beskrevet [35]. Efter fraktionering blev lysater udsat for Western blotting med de angivne antistoffer.

Behandling med kombination TGF-dasatinib ikke havde en signifikant effekt på den ikke-kanoniske TGFp pathway intracellulære mediatorer ERK, AKT, eller p38 (S3 figur). Desuden har behandling med TGFp-1 ikke resultere i en stigning i Shc aktivering i A549-celler, som tidligere er rapporteret for andre celletyper [42], [43] og knockdown af ekspressionen af ​​ShcA hjælp ShcA siRNA ikke havde en effekt i apoptose i ShcA-negative A549-celler (data ikke vist), hvilket antyder, at denne vej ikke er involveret i apoptose observeret med TGFp-dasatinib behandling.

TGFp-1-dasatinib apoptose medieret af Smad3- induceret BIM

Smad3 er blevet rapporteret til at sensibilisere cellerne til de apoptotiske virkninger af TGFp [40], og en af ​​de foreslåede mekanismer er induktionen af ​​ekspressionen af ​​pro-apoptotisk protein BIM (Bcl-2- interagerende mediator af celledød) [44]. Som vist i fig. 6A, 24 timer efter kombinationsbehandling, observerede vi en stigning i BIM-protein ekspression af den højmolekylære isoform og den nedre molekylære og mere cytotoksisk BIM. Det er for nylig blevet rapporteret, at en BIM sletning polymorfier (hvilket resulterer i en BIM isoform uden BH3-domænet), er involveret i resistens over for tyrosinkinaseinhibitorer i flere cancertyper [45], [46]. Screening af alle 15 cellelinjer under anvendelse af primere, der er beskrevet i litteraturen [45] var vi ikke i stand til at detektere BIM isoformen i nogen af ​​vores cellelinier (S5 figur). Imidlertid knockdown af ekspressionen af ​​Smad3 hjælp Smad3 siRNA resulterede i et fald i mængden af ​​BIM efter kombinationsbehandling, hvilket indikerer, at Smad3 ekspression er nødvendig for forøget ekspression af BIM (fig. 6B). Det er blevet rapporteret, at ekspression af Smad7 forhindrer apoptose ved at inhibere ekspressionen af ​​BIM [47]. Som det kan ses i fig. 6A med TGFp-dasatinib behandling, som resulterede i PARP-spaltning, vi observeret reduceret ekspression af Smad7. Dette fald i Smad7 foreslår en mekanisme til at holde TGFp pathway aktive. Vore data tyder på, at kombinationen behandling af TGFp og dasatinib inducerer apoptose ved at øge TGFp aktivering af BIM og nedregulering af TGFp pathway inhibitoriske signaler, såsom Smad7.

(A) A549-celler blev behandlet med DMSO, 5 ng /ml TGFp-1, 100 nM dasatinib, eller en kombination af 5 ng /ml TGFp-1 og 100 nM dasatinib i 48 timer. Efter behandling blev helcellelysater opsamlet og underkastet Western blotting med de angivne antistoffer. (B) siRNA mod Smad3, og negativ kontrol blev transficeret ind A549-celler. Efter 4 timers inkubation blev cellerne vasket og medier indeholdende forbindelser blev tilsat til hver brønd. Celler blev høstet 48 timer efter transfektion for protein udvinding forberedelse og Western blotting-analyse.