PLoS ONE: Diclofenac Hæmmer tumorvækst i en murin model af kræft i bugspytkirtlen ved Modulering af VEGF Niveauer og Arginase Activity

Abstrakt

Baggrund

Diclofenac er et af de ældste anti-inflammatoriske lægemidler i brug. Ud over sin inhibering af cyclooxygenaser (COX), diclofenac inhiberer kraftigt phospholipase

2 (PLA

2), hvilket således giver en bred anti-inflammatorisk virkning. Da inflammation er en vigtig faktor i udviklingen af ​​pancreas tumorer vi undersøgt potentialet af diclofenac til at hæmme tumorvækst i mus podet med PANCO2 celler orthotopisk.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi fandt, at diclofenac behandling (30 mg /kg /legemsvægt i 11 dage) i mus inokuleret med PANC02 celler, reducerede tumorvægten med 60%, hvilket korrelerede med øget apoptose af tumorceller. Da denne effekt ikke blev observeret

in vitro

på dyrkede PANCO2 celler, vi teoretiseret, at diclofenac gavnlig behandling involveret andre mediatorer stede i

vivo

. Faktisk diclofenac drastisk reduceret tumorvaskularisering ved nedregulering VEGF i tumoren og i bughulen væske. Endvidere diclofenac direkte inhiberede vaskulær spiring

ex vivo

. Overraskende, i modsætning til andre COX-2-inhibitorer, diclofenac øget arginase aktivitet /arginase 1 proteinindhold i tumorstroma celler, peritoneale makrofager og hvide blodlegemer med 2,4, 4,8 og 2 gange. Vi foreslår, at den efterfølgende arginin udtømning og fald i NO niveauer, både i serum og bughulen, tilføjer til tumorvækst hæmning af fejlernæring og dårlig vaskulatur udvikling.

Konklusion /Betydning

Det kan konkluderes, diclofenac viser udtalte antitumorale egenskaber i bugspytkirtelkræft model, der kan bidrage til yderligere udvikling behandling. Evnen af ​​diclofenac til at fremkalde arginase aktivitet i tumor stroma, peritoneale makrofager og hvide blodlegemer giver et værktøj til at studere et kontroversielle spørgsmål om pro-og antitumorale virkninger af arginin udtømning

Henvisning:. Mayorek N, Naftali-Shani N, Grunewald M (2010) Diclofenac inhiberer tumorvækst i en murin model af kræft i bugspytkirtlen ved Modulering af VEGF Niveauer og Arginase aktivitet. PLoS ONE 5 (9): e12715. doi: 10,1371 /journal.pone.0012715

Redaktør: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 31 januar 2010; Accepteret: August 6, 2010; Udgivet: 15 September, 2010

Copyright: © 2010 Mayorek et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Hebrew University-Hadassah Medical School (tilskud # 0.463.435). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Inflammation er stærkt relateret til både carcinogenese og til progression af tumorvækst [1]. Epidemiologiske undersøgelser viser, at kronisk inflammation prædisponerer patienter for cancerudvikling og langvarig brug af ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID’er) reducerer risikoen for flere kræftformer [2]

cyclooxygenaser (COX-1 og. – 2) er hastighedsbegrænsende enzymer i produktionen af ​​prostaglandiner (PG’er) fra arachidonsyre.

COX-1-ekspression er generelt konstitutiv, mens COX-2 normalt induceres af stimuli er involveret i inflammatoriske responser. Prostaglandin E2 (PGE2), en primær metabolit af COX-2, har vist sig at fremme celleoverlevelse, proliferation og angiogenese og inhiberer apoptose og antitumor immunrespons, alle processer, der fremmer udviklingen af ​​kræft [3].

Pancreas kræft er en dødelig sygdom med meget begrænsede muligheder for behandling. Kronisk pancreatitis prædisponerer individer for at udvikle pancreas duktalt adenokarcinom [4] og pancreas tumor stroma er kendetegnet ved række inflammatoriske celler [5] foreslå inddragelse af inflammatoriske processer i denne kræft. COX-2 overudtrykkes i ca. 75% af humane carcinomer, herunder dem i bugspytkirtlen. Nylige undersøgelser i transgene mus [6], [7], [8] har vist, at COX-2-overekspression i exokrine pancreas pancreatitis-lignende-tilstand. Starten af ​​canceren hos disse mus blev forhindret ved at opretholde mus på selektive COX-2-inhibitorer, hvilket yderligere understreger den vigtige rolle af inflammation på pancreasudviklingen cancer.

Humane forsøg for at forhindre tyktarmskræft blev for nylig gennemført under anvendelse af COX 2 hæmmere. Trods opmuntrende resultater i forebyggelse tyktarmskræft og reduktion i forekomsten af ​​kolon adenomer, NSAID og selektive COX-2-hæmmere kan forårsage alvorlige hjerte-kar og mave bivirkninger og er derfor ikke rutinemæssigt anbefales til disse sygdomme [9], [10].

Diclofenac, en af ​​de ældste NSAID har været i brug siden 1976. Diclofenac hæmmer cyclooxygenaser ikke-selektivt. Undersøgelser hos mennesker viste, at den reducerer 94% af COX-2 og 49% af COX-1-aktivitet [11]. In vitro det inhiberer kraftigt phospholipase A2 (PLA2) [12], enzymet, der frigiver arachidonsyre og lysophospholipid at generere en familie af pro-inflammatoriske eicosanoider (herunder PGE2) og blodpladeaktiverende faktor. Yderligere tyder på, at diclofenac også hæmmer PLA2 i

vivo

. PLA2 menes at spille en central rolle i de første trin i den inflammatoriske kaskade, der fører til akut pancreatitis [12]. Den indledende undersøgelse [13], efterfulgt af flere andre grupper, har vist, at diclofenac kan markant nedsætte hastigheden af ​​akut pancreatitis forårsaget af endoskopisk retrograd cholangiopancreatography.

I lyset af diclofenac evne til at hæmme kraftigt både COX-2 og PLA2 vi har udforsket sit potentiale anticancer i en musemodel af pancreascancer. Her rapporterer vi, at diclofenac behandling forårsager et fald i tumorstørrelse 60%. Dette skyldes øget apoptose af tumorceller. Vi leverer dokumentation for, at denne virkning er indirekte og opererer gennem mindst to mekanismer. Første, diclofenac giver en signifikant antiangiogenisk virkning, hvilket fremgår af en kraftig reduktion i vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) tumor indhold, nedsat mikrovaskulær densitet og morfologiske ændringer i tumor blodkar. Sekund, diclofenac behandling bemærkelsesværdigt forøger arginase aktivitet i tumor stromaceller, peritoneale makrofager og hvide blodlegemer. Dette er et uventet fund siden COX-2-hæmmere viste sig at reducere tumor vækst gennem arginase hæmning [14], [15] Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, som peger på antitumorale [16] og antiangiogen effekt [17] af arginin udtynding og støtte den temmelig kontroversielle tilgang af anticancer behandling ved at øge arginase aktivitet [18], [19].

Metoder

Etik erklæring

Eksperimentelle dyreforsøg blev godkendt af Etisk udvalg af Hebrew University, der fungerer under overvågning af AAALAC International.

Dyr og PANCO2 cellelinje

Female CB6F1 mus (9-10 uger gamle) og mandlige Sprague-Dawley rotter (200 g) var fra Harlan, Israel. Kvindelige CX3CR1

GFP /+ mus [20] blev generøst tilvejebragt af S. Jung (Rehovot, Israel). I disse mus et GFP reporter drives af CX3CR1 promotoren. Aktivitet af denne kemokinreceptor promotor er begrænset til mononukleare myeloide celler, herunder alle cirkulerende CD116

+ monocytter, og er i det væsentlige fraværende fra celler af lymfoid oprindelse. Alle eksperimenter undtagen eksperimentet vist i fig S3 blev udført under anvendelse CB6F1 mus.

PANC02 celler var en generøs gave fra M Dauer (München, Tyskland). Celler blev opretholdt i RPMI med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.

ortotopisk-syngene model af pancreascancer

Mus blev bedøvet med en blanding af ketamin-xylazin. Bugspytkirtlen blev injiceret med 4 × 10

5 (CB6F1 mus) eller 6 × 10

5 (CX3CR1

GFP /+ mus) PANC02 celler i 30 pi phosphatpufret saltvand (PBS). Mus blev fjernet fra et eksperiment, hvis en peritoneal lækage var mistænkt. Skinopererede mus gennemgik den samme fremgangsmåde og blev injiceret med 30 pi PBS. Mus blev opdelt i grupper på 6 til 8 dyr pr gruppe. Den behandlede gruppe fik 30 mg /kg legemsvægt diclofenac i drikkevand begyndende fra dag 3 efter podning. Doseringen blev beregnet på grundlag af skøn, at en mus drikkevarer omkring 3 ml vand om dagen. Mus blev aflivet 14 dage efter inokulering med mindre andet er angivet.

Blood for hvide blodlegemer (WBC) fremstilling, koncentration VEGF og nitrogenoxid (NO) blev taget fra hjertet. Bughulen blev skyllet med 2 ml PBS med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i makrofager forberedelse, til måling af VEGF og for NO koncentrationer.

Peritoneale celler og peritoneale makrofager isolation

peritoneal celler blev opnået ved centrifugering af bughulen flush. Peritoneale makrofager blev isoleret fra peritoneale celler ved differentiel adhæsion til plast. Makrofagerne blev dyrket i RPMI med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i 20 timer. Til måling arginase aktivitet blev celler vasket med PBS og opløst i 0,1% TritonX100 i vand i 30 minutter ved stuetemperatur.

Tumor homogenater

Tumor homogenater blev fremstillet ud fra tumorprøver, som blev opbevaret ved -80 ° C, i vand indeholdende 0,1% Triton X 100 og protease inhibitor cocktail (Sigma P8340). Homogenater blev centrifugeret i 30 minutter ved 13400 g, og supernatanterne blev anvendt til måling arginase aktivitet, arginase 1, glatmuskelactin og VEGF indhold og caspase-3-aktivering.

Knoglemarvsceller isolation

skinneben og lårben af ​​tumor-bærende mus blev fjernet og skyllet med PBS. Efter centrifugering af høstede celler på en Ficoll-gradient ved 4000 g i 20 minutter ved stuetemperatur mononukleære celler blev isoleret med PE-konjugeret primært antistof anti-CD 115 og anti-PE mikroperler (Biolegends). CD-115 positive og negative celler blev analyseret for arginase aktivitet.

hvide blodlegemer isolation (WBC)

WBC blev isoleret under anvendelse af Ficoll densitetsgradient (Amersham). WBC fraktion blev vasket, celler blev talt, lyseret i vand indeholdende 0,1% Triton X 100 og analyseret for arginase 1 proteinindhold.

Aorta ring spiring assay

aortaringe blev fremstillet fra thorax aorta hos Sprague-Dawley-rotter, som beskrevet [21]. Ringe blev indlejret i kollagengel og opretholdt i Bio MPM medium (Biological Industries, Israel). Behandlingen med 10 uM diclofenac startede en dag efter podning og varede i 5 dage. Ringene blev derefter fikseret i 4% bufret formalin, farves med 0,02% krystalviolet i absolut ethanol. Spirende område blev evalueret under anvendelse af Image Pro program.

Caspase-3-aktivering

Caspase-3-aktivering blev målt i tumor homogenater ved at adskille den ikke-spaltet og spaltes caspase-3 på en 20% acrylamid SDS-PAGE-elektroforese gel og blotting med monoklonale anti-caspase-3 (Cell Signaling).

VEGF og NO-indholdet

VEGF-indholdet blev målt i serum, i supernatant af bughulen flush, i tumor homogenater, PANC02 og dyrkede makrofager ved hjælp af musen VEGF Quantikine immunoassay kit (R Sigma og Dnase 0,33 mg /ml; Sigma) i 45 minutter ved 37 ° C. GFP positive population blev oprenset ved høj hastighed cellesortering under anvendelse af FACS Aria (Becton, Dickinson). Celler blev talt og lyseret i vand indeholdende 0,1% Triton X 100 og analyseret for arginase 1 proteinindhold.

PANCO2 celler vækstrate

PANC02 celler blev podet i RPMI suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Diclofenac (10 eller 50 uM) blev tilsat den følgende dag, og efter 4 dages behandling, blev cellerne indhold målt ved anvendelse af et celleproliferation kit (Biological Industries, Israel).

Immunhistokemi, TUNEL-farvning og morfometri

Paraffinsnit af tumorer blev farvet under anvendelse af følgende primære antistoffer: rotte-anti-muse F4 /80 (Serotec), monoklonalt anti arginase-1 (BD Transduction Laboratories), monoklonalt anti α-glatmuskelactin (Sigma), monoklonale anti Ki 67 (NeoMarkers), kanin-anti-phosphor-histon H3 (Cell Signaling), kanin-anti-VEGF (Calbiochem) og monoklonale anti von Willebrandt faktoren (DACO). Peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret sekundære antistoffer blev anvendt til chromogen detektion.

TUNEL-farvning [23] blev udført under anvendelse i detektion situ celledød kit (Roche).

Kvantificering af immunostaning data blev udført enten ved høj effekt feltanalyse optælling på mindst 10 områder /dias af 4 forskellige tumorer i hver gruppe eller ved hjælp af billedanalyse-system (ARIOL SL-50).

Statistisk analyse

Alle data blev analyseret med SigmaStat software (Aspire software international). En Mann-Whitney-test blev anvendt til beregning signifikante forskelle mellem ubehandlede og diclofenac behandlede prøver. En værdi på p ≤ 0,05 blev accepteret som signifikant.

Sample størrelsen og antallet af gentagelser er angivet i legender.

Resultater

Diclofenac hæmmer tumorvækst i en ortotopisk model af pancreascancer hos mus Salg

PANC02 celler blev injiceret i halen af ​​bugspytkirtlen. Efter 4 dage kræftceller dannet små tumorer ca. 4 mm længde. Tumorer udviklet sig hurtigt; på dag 8 de var fordoblet i længde og konsekvent metastaseret til den peritoneale område af den abdominale indsnit udføres for tumorpodning. På dag 14, tumorer, som voksede på stedet af podning (primære tumorer), vejede 300-500 mg og var yderst vaskulariseret. De metastatiske tumorer ved abdominale snit og i milten var også fremtrædende (Fig 1A).

Mus blev inokuleret med 4 × 10

5 PANC02 celler i halen del af bugspytkirtlen. På dag 3 efter inokulation (dagen for inokulering blev betegnet som dag 1) blev mus randomiseret i ubehandlede og diclofenac behandlede grupper (7-8 mus i hver gruppe) og diclofenac 30 mg /kg legemsvægt behandlingen blev påbegyndt. På dag 14 efter inokulering blev musene dræbt og primære og metastatiske tumorer blev fjernet og vejet. A, en repræsentant fotografier af

i situ

primære (

cirkler

) og metastatiske tumorer (

pile

). Indsætter vise isolerede primære tumorer. B, Middelværdi ± SE for tumor vægte på 8 ubehandlet og 7 diclofenac mus * P≤0.01. Den repræsentativt forsøg ud af fire er vist.

Tre til fire uger efter podning, bughulen var fuld af blodige ascites. Talrige metastatiske tumorer blev fundet i den peritoneale kavitet, herunder lymfeknuder fordøjel- spor, og mus begyndte at dø. Metastatiske tumorer på lever eller lunger blev ikke påvist.

Efterfølgende eksperimenter blev derfor afsluttet på dag 14 efter podning. Musene optrådte normale på dette tidspunkt, og der var ingen tab af kropsvægt.

Diclofenac (30 mg /kg legemsvægt) blev givet dagligt i drikkevand startende på dag 3 efter podning. Dens virkninger blev undersøgt efter 11 dages behandling. Som vist i fig 1B, vægten af ​​den primære tumor (vokser i bugspytkirtlen) var signifikant lavere (60%) i diclofenac-behandlede mus sammenlignet med ubehandlede dyr. Metastatiske tumorer, som voksede i den abdominale snit også vejede mindre i diclofenac behandlede mus, i alle forsøg, men denne effekt opnåede ikke statistisk signifikans.

Diclofenac øger apoptose af tumorceller

in vivo

, men ikke

in vitro

faldt tumor vægt observeret i diclofenac behandlede mus førte os til at undersøge spredning og apoptose af tumorceller.

tumorer farvet for Ki 67 (til stede under alle aktive faser af cellecyklussen: G1, S, G2, og mitose) og phospho-histon H3 (den specifikke markør af mitotiske celler) viste ingen forskel mellem ubehandlede og diclofenac behandlede mus, fig S1

. som vist i figur 2, diclofenac behandling steg apoptose med 6 fold, som angivet ved TUNEL-farvning af tumorer og kvantificering (fig 2A). Dette resultat blev yderligere understøttet af en forøget tilstedeværelse af spaltet caspase 3 i homogenater fra tumorer udskåret fra diclofenac-behandlede mus (figur 2B).

A og B, blev mus inokuleret med PANC02 celler og behandlet med diclofenac som beskrevet i Figur 1. A,

lEF

t, TUNEL farvning superpositionerede i DAPI farvning af faste tumorer,

højre

, gennemsnit ± SE% af TUNEL positive kerner ud af DAPI farvede kerner. Omkring 9000 kerner fra tumorer af 4 ubehandlet og 4 diclofenac behandlede mus blev talt * P≤0.001. B, blev caspase-3 aktivering i tumor homogenater af 4 ubehandlet og 3 diclofenac behandlede mus målt som beskrevet i Materialer og Metoder, en ud af to forsøg. C, PANC02 (3000 celler /brønd) blev podet i 96-NUNC brønde. Dagen efter podning 10 eller 50 uM diclofenac blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i yderligere 4 dage. Antallet af celler blev målt under anvendelse af et Cell Proliferation Kit. Middelværdi ± SE for OD på 6 brønde i hver gruppe. Et eksperiment repræsentativt for 3.

Den forbedrede apoptose forårsaget af diclofenac

in vivo

ikke kunne sammenfattet

in vitro

. PANC02 celler dyrket i 4 dage i nærværelse af 10 og 50 uM af diclofenac voksede med samme hastighed som ubehandlede celler (Fig 2C) angiver, at

in vivo

effekter af diclofenac kræve nogle mæglere, der er fraværende i

in vitro

system.

Antiangiogenisk effekt af diclofenac

in vivo

ex vivo

Tumorer fra diclofenac behandlede dyr var meget bleg (fig 1A), hvilket antyder, at behandlingen forårsagede en antiangiogenisk virkning. Således som vist i fig 3A og B, farvning for vaskulær endotel markør von Willebrand Factor og optælling af blodkar viste en 4 ganges fald i antallet af store perifere kar og en 2 fold fald i kapillær densitet i tumorer af diclofenac-behandlede mus. Endvidere glatmuskelactin farvning (Fig 3C) afslørede tynd, lige fartøjer i behandlede tumorer sammenlignet med talrige, brede, bugtede blodkar fra tumorer af ubehandlede mus. Analyse af glatmuskelactin ekspression i tumorceller homogenater ved Western-blot viste et signifikant fald (2,5 gange) i diclofenac-behandlede mus (fig 3D og E).

A-F blev mus inokuleret med PANC02 celler og behandlet med diclofenac som beskrevet i figur 1. A-D, diclofenac behandling forårsager morfologiske ændringer i tumor blodkar. A, Von Willebrand farvning af store perifere kar (

øverst)

og kapillærer (

bund

). B, Middelværdi ± SE for store perifere kar /dias. tælles omkring periferien af ​​hvert dias (

top

) og gennemsnit ± SE af kapillærer /område tælles i 10 forskellige centrale områder af tumorer under X40 forstørrelse (

bund

). Fartøjer Count blev evalueret i tumorer i 4 ubehandlet og 4 diclofenac behandlede mus, * P≤0.01. C, glatmuskelactin farvning afslørede meget tynde blodkar vægge i diclofenac-behandlede mus. D og E, glatmuskelactin proteinindhold i tumor homogenater (50 ug protein loaded per bane) af 4 ubehandlet og 3 diclofenac behandlede mus målt som beskrevet i materialer og metoder, middelværdi ± SE for arbitrære enheder /lane, * P≤0.01. F, Diclofenac reducerer VEGF indhold af tumoren og det peritoneale hulrum, men ikke serum. VEGF niveauer blev målt som beskrevet i Materialer og metoder i tumor homogenater-pg /mg protein (

top

), i bughulen-pg /mus (

center

) og i serum AB-PG /ml (

bund

). Resultaterne er gennemsnit ± SE for 4 til 6 mus pr gruppe. *, ** Og # signifikant forskellig fra ubehandlede, tumorbærende mus P≤0.02. Lignende resultater blev opnået i to uafhængige forsøg. G, Diclofenac inhiberer vaskulær spiring.

ex vivo

inhibitoriske virkning af diclofenac på spiring blev målt i rotte aortaringe dyrket i fravær eller nærvær af 10 uM diclofenac i 5 dage som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne er gennemsnit ± SE af spire område med 5 ringe i hver gruppe målt ved anvendelse af Image Pro program. * Signifikant forskellig fra ubehandlede gruppe P≤0.01 De fotografier af repræsentative ringe fra ubehandlet (

venstre

) og diclofenac (

højre

) behandlede grupper er inkluderet. Lignende resultater blev opnået i 4 uafhængige eksperimenter.

VEGF har vist sig at være den væsentligste proangiogen faktor i tumorer [24]. Derfor målte vi tumor VEGF niveauer af diclofenac behandlede og ubehandlede mus (fig 3F). Behandlede mus tumorer indeholdt 3 gange mindre VEGF sammenlignet med tumorer fra ubehandlede mus, hvilket tyder på, at faldet i tumorvaskulatur resultater fra en nedregulering af VEGF (figur 3F,

top

). Eftersom tumorceller hurtigt spredes gennem bughulen, vi næste målte VEGF indhold i peritonealvæske. Den udskyllelige mængde af VEGF fra bughulen af ​​tumor- bærende mus var 13 gange højere end skinopererede raske mus. Dette beløb faldt med 2,8 gange efter diclofenac behandling (Fig 3F,

center

).

Disse markante effekter på VEGF indhold, både i bughulen og i tumorvæv, blev ikke afspejlet i ændringer i VEGF serumkoncentration (fig 3F,

bund

). Således serum VEGF koncentrationerne var ens i serum af sundt skin drives mus, i tumor- bærende mus og i tumor-bærende mus behandlet med diclofenac.

For at bestemme om diclofenac direkte kan hæmme angiogenese, målt vi spiring angiogenese af rotte aorta ringe

ex vivo

som reaktion på lægemiddelbehandling. Som vist i fig 3G, blev spiring område inhiberet af 2,5 gange, når aortaringe blev inkuberet med 10 pM af diclofenac (C max for diclofenac-behandlede patienter), hvilket viser, at diclofenac kan direkte inhibere udvikling blodkar.

Diclofenac øger arginase aktivitet i pancreas tumorer og i peritoneale makrofager, men ikke i knoglemarv-CD 115 positive og CD 115 negative celler

et af resultaterne af COX-2-overekspression af tumorceller er en stor produktion af PGE2 som fører til en svækket T-celle-respons [14] [25]. PGE2 inducerer arginase en aktivitet og arginin optagelse i myeloide afledte suppressorceller (MDSCs), hvilket førte til arginin udtynding i tumoren omkringliggende. Den relative mangel på arginin forårsager en defekt i CD3ζ ekspression af det tumor-infiltrerende T-celler. Da COX-2-inhibitorer blev vist til delvist stoppe tumorvækst gennem arginase inhibering i MDSC [14], [25] målte vi arginase aktivitet i pancreas tumor homogenater fra ikke-behandlede og diclofenac behandlede mus (Fig 4A,

top

).

A-C, alle mus undtagen dem indikeret blev podet med tumorer på dag 1 og dræbt på dag 14. En blev arginase aktivitet målt som beskrevet i materialer og metoder i tumor homogenatet

( top)

, i makrofager isoleret ved bughulen flush og dyrkes i 20 timer (

center)

, og i frisk isolerede peritoneale celler (

nederst)

. Mus blev behandlet med diclofenac 30 mg /kg i 11 dage (

top og midten

) eller i 2 dage før eksperimentets afslutning (

bunden

). Resultaterne er gennemsnit ± SE for arginase aktivitet i tumor homogenater af 6-7 mus i hver gruppe (

top

) eller i Triton X-100 opløst celler opnået fra 3-7 mus gennem peritoneal flush og måles i firdobbelte (

center og bund

). Hvert eksperiment blev gentaget mindst 3 gange, og resultaterne af den repræsentative forsøg er vist. * Signifikant forskellig fra ubehandlede gruppe P≤0.01. # Signifikant forskellig fra ubehandlede gruppe af tumor- læggende mus. B, arginase-1-farvning af tumorer. Fikseret tumorer blev farvet for arginase 1 som beskrevet i Materialer og Metoder. Fotografier af sektioner blev taget under X 10

(øverst)

eller X 40 (

bund

) forstørrelse. C, Identifikationen af ​​to separate populationer af celler i tumor (diclofenac-behandlet) stroma: F4-80 positive og arginase positive celler. De serielle snit blev farvet for F4 /80

(venstre

) og for arginase 1,

(højre)

. De samme områder blev identificeret og sammenlignet for tilstedeværelsen af ​​begge mærker. Fotografier af sektioner blev taget under X 20 forstørrelse. Et eksperiment, repræsentativt for 2. D, går Diclofenac fremprovokere arginase aktivitet, når de inkuberes med makrofager i cellekultur. Peritoneale makrofager blev isoleret fra tumor-fri mus som beskrevet i Materialer og metoder og inkuberet i 48 timer med 10 eller 30 pM diclofenac efterfulgt af arginase måling. Middelværdi ± SE for arginase aktivitet af 3 brønde i hver gruppe. Et eksperiment, repræsentant for 3.

Til vores overraskelse arginase aktivitet ikke var hæmmet af diclofenac behandling, men snarere blev signifikant aktiveret af 2,4 gange.

Immuno-histologisk farvning viste arginase 1 positive celler ved periferien af ​​tumorer i både ubehandlede og diclofenac-behandlede mus (figur 4b). Antallet af arginase 1-udtrykkende celler og deres farvningsintensitet syntes at stige under diclofenac behandling. En væsentlig, 1,8 gange stigning i arginase 1 proteinindhold i tumorer i diclofenac-behandlede mus blev også målt ved Western blot-analyse af tumor homogenater (fig S2). Brug et antistof mod den makrofag markør F4 /80 (fig 4C) vi kunne ikke finde nogen overlapning med arginase en farvning.

For yderligere at karakterisere arginase en udtrykkende celler i PANC02 tumorer, vi podet PANC02 celler i transgene mus, hvor en GFP reporter drives af CX3CR1-promotoren. Aktivitet af denne kemokinreceptor promotor er begrænset til mononukleare myeloide celler, herunder alle cirkulerende CD116

+ monocytter, og er i det væsentlige fraværende fra celler af lymfoid oprindelse. Vi isolerede GFP-positive celler fra tumorer og fandt, at disse celler udtrykker høje niveauer af arginase 1 (fig S3).

Således øget aktivitet af arginase fundet i tumorer fra diclofenac behandlede mus skyldes mindst til dels aktiveringen af ​​arginase 1 i monocytafledt CX3CR1

+ -celler. Arginase aktivitet var fraværende i dyrkede PANC02 (resultater ikke vist) og arginase 1 protein blev aldrig påvist i tumor celler

in vivo

ved immunfarvning.

Den slående effekt af diclofenac behandling på arginase aktivitet i bugspytkirtlen tumorer førte os til at undersøge arginase aktivitet i peritoneale makrofager. Peritoneale makrofager kan være involveret i tumor overvågning [26], og viser en forbedret arginase udtryk i tumor-bærende mus [27]. Makrofager fra peritoneal lavage blev isoleret ved præferentiel binding til dyrkningsskåle og dyrket natten over. Immunfarvning viste, at de var begge F4 /80 positive og arginase 1-positive (resultater ikke vist). Arginase aktivitet blev opreguleret (4,8 gange) i makrofager afledt af tumor- bærende mus behandlet med diclofenac i 11 dage, sammenlignet med ubehandlede mus, (Fig 4A

Center of).

Siden makrofag arginase ekspression kan ændre sig i respons på dyrkningsskål adhæsion [28] vi også målt arginase aktivitet i ikke-dyrkede frisk isolerede celler fra muse peritoneale hulrum, hvorved det går ud på makrofager renhed, (fig 4A

bund)

.

diclofenac effektivt stimulerede arginase aktivitet i ikke-dyrkede celler afledt af både tumor-fri og tumor-bærende mus behandlet med diclofenac i 2 dage kun med 7 og 3 gange. Tumor tilstedeværelse forbedret arginase aktivitet ved 4 gange øget aktivitet fra 0,03 (celler fra ikke-tumor bærende mus) til 0,12 mg urea /min /mg protein (celler fra tumor -fyldt mus), som er på linje med tidligere rapporterede resultater [27] .

Vi tælles også antallet af peritoneale celler udvundet fra hver mus og fandt, at en 2 dages diclofenac behandling gav en 3 gange stigning i celler fra tumor-frie mus. Det gennemsnitlige antal celler ± SE var 0,6 × 10

6 ± 0,06 × 10

6 udvundet fra ubehandlede mus og 1,5 × 10

6 ± 0,4 × 10

6 fra diclofenac behandlede mus (p≤ 0,02, 7 mus i hver gruppe).

Denne observation viser, at efter en kort diclofenac behandling, den samlede arginase aktivitet i peritoneale celler (for det meste makrofager) er meget høj, både på grund af den store stigning i en specifik aktivitet af dette enzym og på grund af stigningen i antallet af aktiverede celler.

aktiveringen af ​​arginase aktivitet ved diclofenac kunne ikke påvises

in vitro

. Inkubation af peritoneale makrofager i 48 timer (Fig 4D) forøgede ikke arginase aktivitet, men snarere haft en vis nedgang i den specifikke aktivitet af dette enzym. De samme resultater blev opnået, når makrofagerne blev inkuberet i 96 timer med diclofenac (resultater ikke vist). Således, i lighed med virkningen af ​​diclofenac på apoptose af tumorceller, mediatorer tilstedeværende

in vivo

og fraværende i dyrkede makrofager var nødvendige for at opnå induktion af arginase aktivitet ved dette stof.

Vi undersøgte også, om der kan påvises arginase aktivering ved diclofenac i knoglemarvs makrofag forstadier. Vi isolerede mononukleære celler fra skinneben og lårben af ​​tumorbærende mus ubehandlede og behandlede i 11 dage med diclofenac. Vi fandt meget lav arginase aktivitet i begge CD 115

+ og CD 115

– celler. Således arginase aktivering af diclofenac sker enten i differentierede makrofager eller mæglerne er nødvendige for at fremme diclofenac- induceret- aktivering af arginase ikke når knoglemarven rum.

Diclofenac reducerer NO niveau i bughulen og i serum

Derefter undersøgte vi, hvorvidt den udtalte aktivering af arginase i både tumorvæv og i peritoneale makrofager påvirket NO-produktion.