Abstrakt
Baggrund
sphingosinkinase-1 (SphK1) er en onkogen lipid kinase især involveret i respons på cancerterapi i prostatacancer. Androgener regulere prostatakræft celledeling, og androgen deprivation terapi er standarden for pleje i behandling af patienter med fremskreden sygdom. Her har vi udforsket rolle SphK1 i reguleringen af androgen-afhængige prostatakræft cellevækst og overlevelse.
Metodologi /vigtigste resultater
Kortsigtet androgen fjernelse inducerede en hurtig og forbigående SphK1 hæmning forbundet med en reduceret cellevækst in vitro og in vivo, en begivenhed, som ikke blev observeret i de hormonafhængige ufølsomme PC-3-celler. Støtte til kritiske rolle SphK1 inhibering i den hurtige virkning af androgen depletering, kunne dets overekspression forringe faldet cellevækst. Tilsvarende tilsætningen af dihydrotestosteron (DHT) til androgen-berøvet LNCaP-celler genetableret celleproliferation, gennem en androgen receptor /PI3K /Akt afhængig stimulering af SphK1, og inhibering af SphK1 kunne markant hæmme virkningerne af DHT. Omvendt langsigtet fjernelse af androgen støtte i LNCaP og C4-2B celler resulterede i en gradvis stigning i SphK1 udtryk og aktivitet i hele progression til androgenuafhængighed tilstand, der var præget af købet af en neuroendokrine (NE) -lignende celle fænotype. Vigtigt er det, inhibering af PI3K /Akt pathway-by negativ indvirkning SphK1 aktivitet-kunne forhindre NE differentiering i begge cellemodeller, en begivenhed, der kunne efterlignes af SphK1 inhibitorer. Fascinerende blev reversability af NE fænotype ved udsættelse for normal medium forbundet med en udtalt hæmning af SphK1 aktivitet.
Konklusioner /Betydning
Vi rapporterer det første bevis på, at androgen deprivation inducerer en differentiel effekt på SphK1 aktivitet i hormon-følsomme prostatacancercellelinjer modeller. Disse resultater tyder også på, at SphK1 aktivering ved kronisk androgen deprivation kan tjene som en kompenserende mekanisme prostata kræftceller til at overleve i androgen-udtømte miljø, der giver støtte til dets hæmning som en potentiel terapeutisk strategi at forsinke /forhindre overgangen til androgen-uafhængige prostata kræft
Henvisning:. Dayon A, Brizuela L, Martin C, Mazerolles C, Pirot N, Doumerc N, et al. (2009) sphingosinkinase-1 er centralt for Androgen-Reguleret prostatakræft vækst og overlevelse. PLoS ONE 4 (11): e8048. doi: 10,1371 /journal.pone.0008048
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA
Modtaget: 23, 2009; Accepteret: November 2, 2009; Udgivet: 26 November, 2009
Copyright: © 2009 Dayon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Inserm, CNRS, Fondation pour la Recherche Médicale, Association pour la Recherche sur les Tumeurs de la Prostata, og Institut National du Cancer (til OC). AD er modtager af Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche og La Ligue Nationale Contre le Cancer. CM er modtager af Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Prostatakræft er den hyppigste malignitet tegner sig for 25% af alle nydiagnosticerede kræfttilfælde hos mænd og er den næststørste årsag til kræftdødsfald [1]. Primær behandling med kirurgi eller strålebehandling til patienter med orgel-indesluttede prostatakræft demonstrerer overordnede 10-årige overlevelsesrater på over 75% [2], [3]. Til trods for dette, anslås det, at tilnærmelsesvis 15% af patienterne stede lokalt fremskreden eller metastatisk sygdom, og omkring 40% af patienterne vil få tilbagefald efter lokal behandling [4].
Prostatacancer celleproliferation reguleres af androgener og androgen deprivation terapi (ADT) er standarden for pleje i behandling af patienter med fremskreden sygdom. ADT indledningsvis effektiv, hvilket reducerer både prostata størrelse og prostataspecifikt antigen (PSA) niveauer, men i sidste ende alle patienter blive resistente over for hormonal manipulation [4]. ADT inducerer ændringer i prostatacancer biologi fremme dens progression til androgen-refraktære tilstand eller hormon-refraktær prostatacancer (HRPC) fænotype, med en tilhørende forventet levetid på kun 15 til 20 måneder. Det er ikke klart, hvordan prostatacancerceller gøre overgangen fra androgen-afhængige til androgen-uafhængige status efter ADT. Blandt de mange mekanismer involveret i at omgå virkningerne af androgen ablation, har aktiveringen af phosphotidylinositol-3-kinase /Akt (PI3K /Akt) signalering blevet beskrevet som en central pathway [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9]. Vigtigere, har kliniske studier bekræftede vigtigheden af Akt aktivering i prostatakræft progression til androgen uafhængighed og dårlig klinisk resultat [10], [11], [12], [13], [14].
Talrige undersøgelser har vist, at, efter lang tids ADT, prostatacancerceller erhverve en neuroendokrine (NE) -lignende fænotype, der fører til tumorer i beriget i NE-celler. NE celler udgør en mindre bestanddel af den normale prostata og udskiller flere neuropeptider, der kan fremkalde mitogene virkninger på tilgrænsende kræftceller i androgen-depleterede betingelser [15]. Selv NE celler er blevet beskrevet årtier siden, har deres funktionelle roller i prostatakræft progression først for nylig fået stor opmærksomhed. Neuroendokrin tumor og serum biomarkører er opreguleret efter ADT i prostata cancer patienter indikerer en dårlig prognose [16], [17], [18], [19]. Konsekvent til kliniske observationer, er androgen tilbagetrækning-induceret NE differentiering også ses i cellekultur og dyremodeller [20], [21], [22], [23], [24], og den transgene adenocarcinom af musen prostata model prostata (TRAMP) kræft viser en markant stigning i prostata neuroendokrine cellepopulation med sygdomsprogression [25].
Sphingosin 1-phosphat (S1P) er et lipid mediator, som spiller en vigtig regulerende rolle i tumorcellevækst, overlevelse , invasion, og angiogenese [26]. Balancen mellem de cellulære niveauer af S1P og dets metaboliske forstadier ceramid og sphingosin betragtes som en switch, der kan fastslå, om en celle prolifererer eller undergår apoptose eller vækststandsning [27]. Et centralt regulator af denne balance er det sphingosinkinase-1 (SphK1), enzymet konvertere sphingosin til S1P. SphK1 tjener den dobbelte funktion at producere den pro-vækst, anti-apoptotisk S1P, og faldende intracellulære niveauer af pro-apoptotisk ceramid. Yderligere understøtter en rolle for SphK1 at fremme cancer, har SphK1 vist sig at virke som et onkogen [28], dens mRNA overudtrykkes og positiv immunfarvning for SphK1 blev fundet i forskellige tumorer [29], [30], [31], [ ,,,0],32], [33], og stigningen i SphK1 udtryk i tumor biopsier blev korreleret med kort overlevelse hos patienter med glioblastom og brystkræft [30], [34]. Desuden er SphK1 enzymatisk aktivitet og ekspression markant forøget i tumorprøver fra prostatacancerpatienter (sammenlignet med normale modstykker) korrelerer med andre markører, såsom PSA-niveau, tumorklassificering samt med det kliniske resultat efter prostatektomi (Malavaud og Cuvillier, indsendt). Mens SphK1 aktivitet kan stimuleres af en bred vifte af vækstfaktorer [26], vi har tidligere vist i prostatacancer celle- og dyremodeller, der anticancerbehandlinger (kemoterapeutiske midler eller ioniserende stråling) føre til dets inhibering antyder, at SphK1 kunne virke en sensor til anticancer behandlinger [35], [36], [37], [38].
i denne undersøgelse har vi undersøgt potentielle rolle SphK1 i reguleringen af androgen-afhængige cellevækst og overlevelse i hormon- følsomme LNCaP prostatakræft celle model. For første gang viser vi, at androgen deprivation udøver en kontrasterende effekt på SphK1. Mens kortvarig androgen tilbagetrækning inducerede en midlertidig hæmning af SphK1, kronisk androgen udtømning udløste en opregulering af SphK1 korrelerer med NE differentiering af LNCaP og C4-2B celler støtter inddragelsen af SphK1 i progressionen mod androgen-uafhængighed.
Resultater
Short-Term androgendeprivation Reducerer Cell proliferation i LNCaP – men ikke i PC-3 Celler – og er forbundet med nedsat SphK1 Aktivitet
Cell proliferation blev markant reduceret overarbejde i CSS (androgen-frit medium) -behandlede LNCaP-celler sammenlignet med FBS (som indeholder lave niveauer af androgener) behandlede celler (fig. 1A, venstre panel). For at understøtte MTT resultater, celletælling (fig. 1A, midterste panel) og [
3H] thymidin inkorporering (fig. 1A, højre panel) målinger bekræftede, at CSS betingelser haft en dramatisk effekt på celle nummer og DNA-syntese der godtgør, at MTT kunne anvendes som surrogat indeks for cellulær proliferation i vores celle model. Dette blev også korreleret med udskillelsen af PSA hvis niveau var stærkt reduceret i begge CSS-behandlede celler sammenlignet med FBS-behandlede celler (fig. 1B). Tværtimod har androgen deprivation ikke ændre væksten af PC-3 hormonafhængige refraktær (HR) celler, hvis vækst blev kun ændret af serum sult (fig. 1C) .Når sammenlignet med FBS betingelser, androgen depletering i LNCaP inducerede en bemærkelsesværdig nedgang i SphK1 aktivitet inden for de første 24 timer (fig. 1D, venstre panel). Senere blev en rebound i SphK1 aktivitet observeret, som blev væsentligt over 4 dages behandling (fig. 1D, venstre panel). I PC-3 celler, blev en betydelig og varigt fald i SphK1 aktivitet kun observeret under serum afsavn betingelser (fig. 1D, højre panel). spejling virkningerne på celleproliferation (fig. 1C). Som forventet i PC-3 celler, der er upåvirket af CSS betingelser, kunne ingen væsentlige SphK1 ændringer dokumenteres (Fig. 1C, D).
Overnight serum berøvet LNCaP (
En
,
D
) og PC-3 (
C Salg,
D Salg) celler blev inkuberet i nærvær af 5% FBS, 5% CSS eller uden serum (SFM) i de angivne tidsrum . Celleproliferation i LNCaP (
En
,
venstre panel
) og PC-3 celler (
C
) blev bestemt ved MTT assay og udtrykt som procent af kontrol i begyndelsen af eksperimentet (dag 0). Cell nummer (
En
,
midterste panel
) og DNA-syntese (
En
,
højre panel
) blev målt som beskrevet i materialer og metoder.
Kolonner
, middelværdien af mindst fireogtyve uafhængige eksperimenter for MTT-assay og seks forsøg til celletælling og DNA-syntese;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001. Udskilt PSA-niveau blev målt i dyrkningsmedier fra LNCaP-celler (
B
).
Kolonner
, betyder mindst seks uafhængige forsøg;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001.
D
, SphK1 aktivitet blev bestemt i både LNCaP og PC-3-celler og udtrykt som procent af FBS-behandlede celler.
Kolonner
, betyder mindst tolv og seks uafhængige eksperimenter for LNCaP- og PC-3 celler henholdsvis;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001; **,
P
0,01; *,
P
0,05; ns, ikke-signifikant.
Effekten af Kastration i orthotopisk Xenotransplanted SCID mus er associeret med SphK1 Hæmning
Effekten af androgen deprivation var næste undersøgt
in vivo
ved anvendelse af en kirurgisk ortotopisk implantation (SOI) af LNCaP og PC-3-celler, der overudtrykker GFP [36]. Ni og tre uger efter SOI af LNCaP /GFP og PC-3 /GFP-celler fik henholdsvis SCID-mus randomiseret i to grupper og udsat for kastration eller skinbehandlingen. Som vist ved høj forstørrelse mikroskopi af en repræsentativ primær LNCaP /GFP tumor, kastration inducerede et dramatisk fald i tumorvolumen og masse (fig. 2A og B) inden for 7 dages behandling sammenlignet med sham-behandlede dyr. Effekten af kastration var forbundet med et signifikant fald i SphK1 aktivitet i vævsekstrakter (fig. 2B, højre panel). Endvidere blev virkningen på primær tumor parallelt med en markant reduktion i formidling metastase i kastration-behandlede gruppe (tabel S1). Som forventet havde kastration ikke påvirke tumorudvikling i SCID-mus xenotransplanted PC-3 /GFP-celler (fig. 2C). Tumorer og volumener var ens i begge sham-behandlede og kastrerede dyr (fig. 2D), og SphK1 aktivitet (fig. 2D, højre panel) samt formidling metastaser (tabel S1) var sammenlignelige i begge grupper.
Ni og tre uger efter SOI af LNCaP /GFP og PC-3 /GFP-celler henholdsvis SCID-mus blev randomiseret i to grupper. Disse dyr blev derefter udsat for kastration eller skinbehandlingen. Repræsentant fluorescerende primær LNCaP (
A
) og PC-3 (
C
) tumorer fra forsøg med simuleret injektionskontrol og kastration-behandlede dyr på tidspunktet for obduktion (7 dage efter behandling). Tumor masse af udskåret primær LNCaP- (
B
,
venstre panel
) og PC-3 (
D
,
venstre panel
) GFP-mærkede tumor .
Kolonner
, betyder fra 8 dyr;
barer
, SE. SphK1 aktivitet blev målt i vævsekstrakter opnået fra forsøg med simuleret injektionskontrol, og kastration-behandlet LNCaP (
B
,
højre panel
) og PC-3 (
D
,
højre panel
) tumorbærende dyr.
Kolonner
, betyder fra 8 dyr;
barer
, SE. De to-tailed
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001; eller ns, ikke signifikant.
SphK1 Overekspression Renders LNCaP Celler mindre følsom over for Androgen Nedbrydning
Fordi der blev observeret en hæmning af SphK1 under kortvarig androgen deprivation
in vitro
(fig. 1D) og
in vivo
(fig. 2B), vi undersøgte, om transfektion af LNCaP celler med SphK1 kunne gøre disse celler mere modstandsdygtige over for androgen udtynding. Transfektionseffektiviteten blev verificeret ved immunoblotting (fig. 3A, venstre felt). Den SphK1 aktivitet af SphK1-overekspression LNCaP (fig. 3A, højre panel) blev forøget til ~1100 pmol /mn /mg protein (dvs. -30 gange højere sammenlignet med den for tomme vektor transficerede celler). Den instrumentale rolle SphK1 inhibering i reduceret cellevækst blev bekræftet ved cellelevedygtighedsassays, som viste, at LNCaP overudtrykker SphK1 var markant mindre følsomme over for virkningerne af androgen depletering (Fig. 3B). Samtidigt, SphK1 tvungen udtryk var forbundet med en højere udskillelse af PSA i CSS-behandlede LNCaP celler afspejler dens virkninger på celleproliferation (fig. 3C).
SphK1 udtryk i LNCaP celler blev analyseret ved Western blotting hjælp anti- FLAG antistof (
En
,
venstre panel
). Resting SphK1 aktivitet blev målt i LNCaP /neo og LNCaP /SphK1 celler (
En
,
højre panel
).
B
, overnight serum berøvet LNCaP-celler blev inkuberet i nærvær af 5% FBS eller 5% CSS i 6 dage. Celleproliferation blev derefter bestemt og udtrykt som procent af 5% FBS-behandlede celler.
Kolonner
, betyder mindst tolv uafhængige forsøg;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001.
C
, secerneret PSA-niveauet blev målt i dyrkningsmedier fra LNCaP /Neo og LNCaP /SphK1 celler efter 24 timers inkubation i 5% CSS medium.
Kolonner
, betyder mindst seks uafhængige forsøg;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001
dihydrotestosteron hurtigt og Forbigående Stimulerer SphK1 aktivitet i en androgen. Receptor /PI3 kinase-afhængig måde
som en nedregulering af SphK1 aktivitet blev korreleret med fjernelse af androgener i LNCaP celler (fig. 1D), var det af interesse at fastslå, om dette kunne vendes ved den tilsætning af androgener. Under CSS betingelser, kunne tilsætning af dihydrotestosteron (DHT) udløse et tidligt og forbigående stimulering af SphK1 (så tidligt som 15 min), hvorefter SphK1 aktivitet vendte tilbage til basale niveauer (fig. 4A). Den hurtige stimulering af SphK1 var afhængig af aktivering af PI3K /Akt signalering, som er blevet vist at mediere de hurtige virkninger af androgener [39], [40]. Faktisk mens wortmannin (WT) hæmmede både aktiveringen af Akt (fig. 4B, øverst) og SphK1 (fig. 4B, nederst) induceret af DHT, den SphK1 inhibitor SKI-2 påvirkede ikke Akt fosforylering (fig. 4B, top ). Stimuleringen af PI3K /Akt /SphK1 pathway var kritisk til transmission de proliferative virkninger af DHT under CSS betingelser. Faktisk ligner de PI3K-inhibitorer WT og LY294002 (fig. 4C), de SphK1 inhibitorer SKI-2 og F-12509a kunne hæmme DHT-induceret celleproliferation, DNA-syntese samt PSA sekretion (Fig. 4D).
En
, overnight serum berøvet LNCaP celler blev inkuberet under 5% CSS betingelser og behandlet med 10 nM DHT for de angivne tider. SphK1 aktivitet blev kvantificeret og udtrykt som procent af ubehandlede celler.
Kolonner
, betyder mindst seks uafhængige forsøg;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001; **,
P
0,01; ns, ikke-signifikant.
B
, overnight serum berøvet LNCaP celler blev inkuberet med 10 nM DHT i 45 min i tilstedeværelse eller ikke af 2,5 uM SKI-2 eller 200 nM wortmannin (WT). Cellelysater blev analyseret for phospho-Akt og Akt ekspression ved Western blot analyse. Lignende resultater opnåedes i tre uafhængige forsøg (
top
). Overnight serum berøvet LNCaP-celler blev inkuberet under 5% CSS betingelser og behandlet med eller uden 10 nM DHT og 200 nM wortmannin (WT) i 45 minutter, og essayed for SphK1 aktivitet (
bunden
).
Kolonner
, betyder på mindst fem uafhængige forsøg;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: **,
P
0,01; ns, ikke-signifikant.
C
, overnight serum berøvet LNCaP-celler blev inkuberet i FBS eller i CSS betingelser for 6 dage med eller uden 200 nM wortmannin (WT) eller 1 pM LY294002 i nærvær eller ikke af 10 nM DHT som angivet. Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assay og udtrykt som procent af kontrol ved begyndelsen af forsøget (dag 0).
Kolonner
, betyder på mindst otte uafhængige forsøg;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001; ns, ikke-signifikant.
D
blev natten serum berøvet LNCaP celler inkuberet i FBS eller i CSS forhold med eller uden 2,5 uM SKI-2 eller F-12509a i tilstedeværelse eller ikke af 10 nM DHT i 24 timer (
top
), 48 h (
midterste
) eller 6 dage (
bund
). Udskilt PSA-niveau blev kvantificeret 24 timer efter den angivne behandling (
top
). DNA-syntese og MTT-baserede celleproliferation måling blev udtrykt som procent af kontrol ved begyndelsen af behandlingen, 2 og 6 dage.
Kolonner
, betyder på mindst fem uafhængige forsøg;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001; **,
P
0,01; eller ns, ikke-signifikant.
Effekten af androgen receptor antagonist blev næste undersøgt med bicalutamid. Som forventet blev LNCaP celledeling respons på 10 nM DHT totalt sløvet med 10 pM bicalutamid (fig. 5A). DHT-udløst stimulering af SphK1 aktivitet var også fuldstændigt inhiberet i nærvær af androgen receptor antagonist (fig. 5B).
Overnight serum berøvet LNCaP-celler blev inkuberet under 5% CSS betingelser og behandlet med eller uden 10 pM bicalutamid i tilstedeværelse eller ikke af 10 nM DHT for 2 (
En
,
top
) eller 6 dage (
En
,
bund
). DNA-syntese og celletælling målinger blev udtrykt som procent af kontrol ved begyndelsen af behandlingen.
B
, overnight serum berøvet LNCaP celler blev inkuberet med 10 nM DHT i 30 minutter i tilstedeværelse eller ikke af 10 uM bicalutamid, og SphK1 aktivitet blev kvantificeret og udtrykt som procent af kontrol i starten af behandlingen.
Kolonner
, betyder på mindst fem uafhængige forsøg;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001; **,
P
0,01; eller ns, ikke-signifikant.
SphK1 er involveret i Androgen Udtømmelse-induceret Neuroendokrine transdifferentiering af LNCaP og C4-2B Celler
Vi næste undersøgt potentielle inddragelse af SphK1 i overgangen til androgen refraktær tilstand efter kronisk androgen tilbagetrækning. Med henblik herpå LNCaP og C4-2B celler, som tidligere er blevet rapporteret til at erhverve en neuroendokrine (NE) fænotype [20], [21], [23], [41], [42], [43] blev opretholdt under CSS betingelser for op til 42 dage. LNCaP-celler udsat for et hormon-deficient medium undergik neuroendokrine (NE) morfologiske ændringer (tilsyneladende efter tilnærmelsesvis 7-10 dage) som angivet ved soma komprimering og udvikling af lange og forgrenede neuritiske forlængelser (fig. 6A), hvorimod kontrol LNCaP parentale celler bevaret en tenformet epitelial morfologi (fig. 6A). Foruden morfologiske karakteristika, transdifferentiated NE-lignende prostatacancerceller er defineret ved ekspressionen af en række produkter, herunder neurosekretionsceller chromogranin A (CgA) og neuron-specifik enolase (NSE). CgA anses for at være den mest pålidelige indikator for prostata NE differentiering.
En
, repræsentative fase kontrast billeder af LNCaP celler i begyndelsen af forsøget (dag 0) og efter 42 dage inkubation i trækulsafdrevet betingelser (dag 42). indhold Chromogranin A (CgA) blev evalueret ved immunoblotting på de angivne tidspunkter (
bunden
) .Secreted Neuron enolase (NSE) blev målt i dyrkningsmedier fra LNCaP-celler på de angivne tidspunkter (
højre panel
).
Kolonner
, betyder fem uafhængige forsøg;
barer
, SD. De to-tailed
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001. SphK1 aktivitet (
B
,
venstre panel
) blev bestemt på de angivne tidspunkter i LNCaP celler inkuberet i CSS betingelser.
Points
, betyder fem uafhængige eksperimenter;
barer
, SD.
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001.
Indsat
, S1P indhold som vist ved TLC.
Højre panel
, ekspression af SphK1, phospho-Akt, og Akt blev analyseret ved Western blotting på de angivne tidspunkter. Lignende resultater blev opnået i fem uafhængige eksperimenter.
C
, udtryk af CGA og phospho-Akt (
venstre panel
) og SphK1 aktivitet (
højre panel
) blev analyseret 10 dage efter behandling eller ikke med en uM LY294002 eller 200 nM wortmannin (WT) under trækul strippet betingelser.
Kolonner
, betyder fem uafhængige forsøg;
barer
, SD. De to-tailed
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001.
D
, udskilt NSE niveau blev målt i dyrkningsmedier 10 dage efter behandling eller ikke med 5 uM SKI-2 under trækul strippet forhold (
venstre panel
). Ekspression af CGA og phospho-Akt blev analyseret ved western blot (
højre panel
).
Kolonner
, betyder fem uafhængige forsøg;
barer
, SD. De to-tailed
P
værdier mellem midlerne er som følger:. **,
P
0,01
I overensstemmelse med tidligere observationer [41], [44], viste immunoblots at CgA ekspression var meget lav i både parentale LNCaP (fig. 6A, nedre panel) og C4-2B (fig S1) -celler, mens dets ekspression niveau var betydeligt større over tid i hormon-deficient medium. Endvidere sammenlignet med ikke hormon-berøvet LNCaP-celler (D0), blev en 3 gange stigning i NSE sekretion til mediet fundet efter 42 dage under CSS betingelser indikerer en NE-lignende fænotype (Fig. 6A, højre panel). Baseret på vores tidligere observationer, at SphK1 aktivitet ved androgen deprivation blev kun forbigående hæmmet med en betydelig rebound inden for 4 dages inkubation i CSS medium (fig. 1D), derefter analyseret vi SphK1 aktivitet op til 42 dage i løbet af NE transdifferentiering processen. Bemærkelsesværdigt, SphK1 aktivitet (fig. 6B) steg progressivt op til 4 gange stigning efter 42 dage af androgen depletering. Dette blev yderligere illustreret af en markant stigning i S1P indhold (fig. 6B, indsat). Parallelt blev SphK1 proteinekspression signifikant forøget (fig. 6B, højre panel). Aktiveringen af SphK1 var korreleret med stimulering af Akt (fig. 6B, højre panel), en pro-overlevelse signalvejen rapporteret at være opreguleret under NE transdifferentiering af LNCaP induceret af androgen udtømning [6], [7], [23 ], [45]. Sammenlignelige fund blev observeret i C4-2B celle model (figur S1).
I tråd med tidligere undersøgelser [6], farmakologisk hæmning af PI3K /Akt pathway kunne hindre NE transdifferentiering af både LNCaP (fig. 6C ) og C4-2B (fig S1) opbevares i 10 dage under CSS betingelser. Notatet blev blokaden af CGA akkumulation induceret af PI3K hæmmere WT og LY294002 markant forbundet med et fald i både Akt phosphorylering og SphK1 aktivitet (fig. 6C, højre panel og figur S1).
For at undersøge funktionelle rolle af SphK1 i NE transdifferentiering undersøgte vi effekten af den farmakologiske inhibitor SKI-2 på LNCaP og C4-2B celler. I nærværelse af SKI-2 (5 uM), særskilte NE-lignende morfologi observeret i det væsentlige ophævet med LNCaP udviser en afrundet morfologi med korte sjældent forgrenede cellulære processer (ikke vist). Desuden blev både sekretion af NSE (fig. 6D, venstre felt) og CGA akkumulering (fig. 6D, højre panel og fig S1) markant formindsket mens Akt phosphorylering var uændret dermed antyder, at SphK1 inhibering kan til en vis grad blokere NE transdifferentiering .
fysiologiske eller farmakologiske midler, der forøger intracellulære niveauer af cyklisk AMP (cAMP) kan inducere udvikling af en NE morfologi i LNCaP eller c4-2 celler i nærvær af steroider [41], [44], [46 ]. Notatet er cAMP stigning tidligere blevet rapporteret at være forbundet med aktivering af SphK1 i osteoblaster [47]. Derfor undersøgte vi rollen af cAMP som en potentiel opstrøms regulator af SphK1 under NED. LNCaP og C4-2B celler blev stimuleret med adenylatcyklase aktivator forskolin (FSK) og phosphodiesteraseinhibitoren IBMX, eller med epinephrin (EPI), en β-adrenerg receptoragonist. Behandlingen med Fsk /IBMX eller Epi kraftigt stimuleret SphK1 aktivitet (fig. 7A), og korreleret med øget indhold cAMP (fig. 7B) og erhvervelse af NE morfologi (data ikke vist), kendetegnet biokemisk ved CgA akkumulering (fig. 7C). Interessant, har pharmacoligical hæmning af SphK1 ikke har nogen virkning på cAMP niveauer (fig. 7B), hvorimod det markant gjorde hæmme NED (fig. 7C). Bemærkelsesværdigt, under androgen deprivation betingelser blev en tilsvarende stigning i cAMP intracellulære niveauer observeret, hvilket ikke kunne være blokeret af farmakologisk inhibering af SphK1 (fig. 7D). Disse resultater vækker en rolle for cAMP til stimulering af SphK1 aktivitet under NED.
En
, SphK1 aktivitet blev bestemt i LNCaP og C4-2B celler behandlet i 3 dage i fravær eller i nærvær af 10 pM Fsk /10 mM IBMX eller 10 uM Epi.
B
, intracellulære koncentrationer af cAMP blev kvantificeret i LNCaP og C4-2B celler behandlet i 3 dage med 5% FBS eller 10 pM Fsk /10 mM IBMX i fravær eller i nærværelse af 5 uM SKI-2.
C
, Chromogranin Et indhold (CgA) blev evalated ved immunoblotting i LNCaP og C4-2B celleekstrakter inkuberet i 3 dage med eller uden 5 uM SKI-2 i nærværelse af 5% FBS, 10 pM Fsk /10 mM IBMX eller 10 uM Epi. Lignende resultater opnåedes i tre uafhængige forsøg.
D
, intracellulære koncentrationer af cAMP blev kvantificeret i LNCaP og C4-2B celler før eller 14 dage efter behandling eller ikke med 5 uM SKI-2 under trækul strippet betingelser.
Kolonner
, betyde tre uafhængige forsøg;
barer
, SD. De to-tailed
P
værdier mellem midlerne er som følger: ***,
P
0,001; *,
P
0,05; eller ns, ikke-signifikant.
For at afgøre, om
in vitro
resultaterne af den potentielle inddragelse af SphK1 i NE differentiering havde nogen relevans for human sygdom, sektioner fra en repræsentant patient, som gennemgik palliativ transuretral resektion for lokalt recidiv under fuldstændig androgen blokade blev immunfarvet for CgA og SphK1 udtryk (fig. 8). SphK1 farvning blev begrænset til cytoplasma med nogle celler bliver mere intenst farvet end de andre (fig. 8B, åben pilespids). Fibromuskulær stroma farvede ikke positivt for SphK1. CgA farvning blev observeret i et mindretal af cancerceller, ca. 10%, i form af sekretoriske granuli (H, fig. 8d). Co-ekspression af CGA i blå med brun SphK1 resulterede i intense mørkebrunt signal (fast pilespids). Bemærk i fig. 8A (nederst) og fig. 8C, neuron-lignende udseende af dobbelt-mærkede kræftcelle (fast pil).
Dual immunfarvning med anti-SphK1 (brun) og anti-CgA (blå) af en resektion eksemplar høstet i en 84 yo mand med T4NxM1 prostatacancer under fuldstændig androgen blokade. Lav serum PSA og positivt serum NSE foreslog dårligt differentieret kræft med neuroendokrine funktioner, hvilket bekræftes af patologisk undersøgelse af den resekterede prøve viser høj kvalitet prostatakræft (Gleason 9) med positiv farvning for CgA. Blå kornet sekretion karakteristisk for neuroendokrine differentiering colocalized med brun SphK1 immun reaktivitet i neuron-lignende celler (fast pilespids).
Overgangen til androgen refraktær tilstand under kronisk androgen udtømning er karakteriseret
i vitro
af et tab af respons af androgen-berøvet celler til enten FBS eller DHT [20]. Så tidligt som 7 dage og ved 14 dage androgenfjernelse, LNCaP var fuldstændig ikke reagerer efter overførsel til FBS forhold eller ved behandling med DHT med hensyn til celleproliferation (fig. 9A, venstre panel) eller sekretion af PSA (fig. 9A, højre panel). Imidlertid NE-lignende fænotype er reversibel ved påfyldning medier med komplet serum flere uger [20]. Når LNCaP androgen-udtømt i 42 dage blev skiftet tilbage til normal FBS medium, cellevækst genoptaget i perioden i den følgende uge, og inden for de næste 21 dage i FBS medium, cellemorfologien tilbage til den for forældrenes LNCaP celler (data ikke vist). Som vist i fig. 8B, disse celler var nu ikke kun i stand til at vokse normalt og secernerer PSA i nærvær af FBS ligesom parental LNCaP (fig. 1A), men også at reagere igen til tilsætning af DHT under CSS ligner parentale celler betingelser (fig. 4C og D). Interessant nok blev den reversability induceret ved efterfyldning af medier med komplet serum i 21 dage i forbindelse med en dyb nedregulering af SphK1 aktivitet (fig. 9C), som gik tilbage til de niveauer, der findes i parentale celler. **,
P
0,01; barer, SD. barer, SD. barer, SD.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.