PLoS ONE: Sletning af glutathion peroxidase-2 Forhindrer azoxymethan-induceret Colon Cancer Development

Abstrakt

selenoprotein glutathionperoxidase-2 (GPx2) synes at have en dobbelt rolle i carcinogenese. Mens det beskyttede mus mod coloncancer i en model for inflammation-udløst carcinogenese (azoxymethan og dextran natriumsulfat behandling), den fremmet vækst af xenotransplanterede tumorceller. Derfor analyserede vi effekten af ​​GPx2 i en musemodel efterligner sporadisk kolorektal cancer (azoxymethan-behandling kun). GPx2-knockout (KO) og vildtype (WT) mus blev justeret til enten marginalt mangelfuld (-Se), passende (+ Se), eller supranutritional (++ Se) selenstatus og blev behandlet seks gange med azoxymethan (AOM ) for at inducere tumorudvikling. I -se og ++ Se-grupper, antallet af tumorer var signifikant lavere i GPx2-KO end i respektive WT mus. På + Se kost, blev antallet af dysplastiske krypter reduceret i GPx2-KO mus. Dette kan forklares ved mere basal og AOM-inducerede apoptotisk celledød i GPx2-KO-mus, der fjerner beskadigede eller præmaligne epitelceller. I WT var dysplastiske krypter GPx2 opreguleret i forhold til normale krypter, som kunne være et forsøg på at undertrykke apoptose. I modsætning hertil i + Se-grupper tumor numre var ens i begge genotyper men tumorstørrelse var større i GPx2-KO mus. Sidstnævnte var forbundet med en inflammatorisk og tumor-fremmende miljø som indlysende fra infiltrerede inflammatoriske celler i tarmslimhinden af ​​GPx2-KO-mus selv uden nogen behandling og karakteriseret som low-grade inflammation. I WT mus tendens antallet af tumorer at være lavest i + Se sammenlignet med -se og ++ Se fodring indikerer, at selen kunne forsinke tumorigenese kun i passende status. Afslutningsvis rolle GPx2 og formentlig også af selen afhænger kræft scenen og naturligvis om inddragelse af betændelse

Citation:. Müller MF, Florian S, Pommer S, Osterhoff M, Esworthy RS, Chu FF et al. (2013) Sletning af glutathion peroxidase-2 Forhindrer azoxymethan-induceret tyktarmskræft Development. PLoS ONE 8 (8): e72055. doi: 10,1371 /journal.pone.0072055

Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

Modtaget: Juni 3, 2013; Accepteret: 8 jul 2013; Udgivet: 19 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Müller et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den tyske Research Foundation (Br 778 /8-1). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald i de vestlige lande. Epidemiologiske undersøgelser knyttet en suboptimal selen status til en øget risiko for at udvikle CRC [1]. Dette er relevant for befolkninger uden for Nordamerika som Europa, hvor gennemsnitlige plasma selen niveauer er 90 mg /l (revideret i [2]). Forskelle i baseline plasma selen niveauer af deltagende fag kan have bidraget til de inkonsistente resultater af interventionsforsøg gennemføres for at studere formodede anti-kræftfremkaldende egenskaber selen tilskud. Følgelig både Nutritional forebyggelse af kræft (NPC) og selen og E-vitamin Cancer Trial (SELECT) viste, at deltagerne påbegyndelse af undersøgelsen med plasma selen niveauer af ≥120 ug /L ikke drage fordel af tilskud [2]. Siden selenoprotein P, den mest følsomme markør for selenstatus [3], er mættet ved 120 ug /L plasma selen, foreslås det, at Se-medieret forebyggelse af kræft afhænger optimal selenoprotein udtryk [2].

den selenoproteome består af proteiner kodet af 25 gener i mennesker [4]. Blandt dem er fem selen-afhængige hydroperoxid-reducerende glutathionperoxidaser (GPX), nemlig GPx1-4 og GPx6. GPx1-4 er udtrykt i murine tarmepitel [5], men kun GPx2 er overvejende placeret i krypten basis [6], [7], hvor også tarm stamceller bor. Desuden er GPx2 højt udtrykt i kolorektale tumorer [6], [8], [9]. Rolle GPx2 under CRC udvikling er stadig uklart. På den ene side, GPx2 faldt tumor numre i en inflammation-udløst colon carcinogenese model efter anvendelse af azoxymethan (AOM) og dextran natriumsulfat (DSS) ved at virke antiinflammatorisk [10]. Dette er i overensstemmelse med den spontane ileocolitis og tarmkræft i GPx1 /GPx2 dobbelt knockout-mus [11], [12]. Begge kunne næsten fuldstændigt reddet af én WT allel af GPx2 men ikke af GPx1 [13]. På den anden side forekommer GPx2 at støtte proliferation. Tumorer produceret af AOM /DSS behandling var mindre i GPx2-KO end i WT mus [10], som var tumorxenotransplantater afledt af GPx2-deficient HT-29 celler sammenlignet med kontrolceller [14]. Desuden er GPx2 opreguleret af β-catenin [7], [15] og ΔNp63 [16], begge inducere spredning.

Formålet med den aktuelle undersøgelse var at analysere den rolle, GPx2 og selen i en model, hvor CRC udelukkende induceret af AOM, derved efterligne sporadisk colon carcinogenese hos mennesker [17]. Tumor udvikling blev overvåget i GPx2-KO og WT mus fodret med en moderat selen-mangel (-Se), -adequate (+ Se) eller -supranutritional (++ Se) kost. Da AOM inducerer aktiverende mutationer i β-catenin (revideret i [18]), blev co-lokalisering af nukleare β-catenin og forbedret GPx2 udtryk analyseret.

Metoder

Dyr og Experimental Design

C57BL /6J WT og GPx2-KO mus, der genereres som C57BL /6J; 129Sv /J hybrid var blevet tilbagekrydset til C57BL /6J mus i fem generationer [19] før ind i studiet som søskende. Dyrene blev anbragt i individuelt ventilerede bure under specifik-patogenfrie betingelser med en 12 h mørk lys cyklus og fri adgang til mad og vand. Mus blev fodret med en torula gær-baseret diæt (nr C1045, Altromin, Lage, Tyskland) med en basal selen indhold på 0,054 mg pr kg diæt (-Se). + Se og ++ Se-diæter blev fremstillet ved at sætte L (+) – selenomethionin (Acros Organics, Geel, Belgien) for at nå en endelig selen koncentration på 0,15 mg (+ Se) og 0,6 mg (++ Se) pr kg kost, henholdsvis [20]. Indholdet selen blev målt fluorimetrisk som tidligere beskrevet [21]. Fravænnede mus blev fodret forsøgskosten i 4 uger for at justere selenstatus før AOM-behandling og derefter hele eksperimentet (fig. 1A). 10 mg /kg legemsvægt AOM (Sigma, Steinheim, Tyskland) eller et tilsvarende volumen saltvand (Sigma) injiceret intraperitonealt en gang om ugen i seks uger. Akutte virkninger af AOM blev analyseret i 5 mus 8 timer efter den første injektion AOM (kortvarig eksperiment). Tumorer blev analyseret 16 uger efter den sidste AOM-injektion (langsigtet eksperiment). 20 AOM-behandlede og 10 saltvandsbehandlede mus per gruppe blev analyseret for tumorigenese og yderligere 5 dyr blev anvendt til histologi. Undersøgelserne blev godkendt af det mellemstatslige Animal etiske komité (MLUV 32-2347 /4 + 68). blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Mus blev bedøvet med Isofluran® og dræbt ved cervikal dislokation. Miltvægt blev bestemt og vævsprøver blev lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C.

(A) fravænnede mus blev fodret en eksperimentel kost, der var enten selen-fattige (-Se), -adequate (+ Se) eller -supranutritional (++ Se) i mindst 4 uger før AOM injektion. AOM blev injiceret en gang om ugen i seks uger og mus blev aflivet 16 uger efter den sidste AOM-injektion (langsigtet eksperiment). For at undersøge akutte AOM effekter blev musene aflivet 8 timer efter den første injektion AOM (kortvarig eksperiment). (B) I alt GPX-aktivitet blev bestemt 8 timer efter en enkelt saltvandsinjektion (kontrol grupper af den kortsigtede eksperiment) i jejunum og lever af GPx2-KO og WT mus. Værdier er middelværdier + SD, n = 5. Signifikans blev beregnet ved anvendelse af 2-vejs ANOVA med Bonferroni post-test. *** P≤0.001 vs WT,

# p ≤ 0,05,

## P≤0.01, og

### P≤0.001 vs + Se.

Histopatologi af colon tumorer og præ-neoplastiske læsioner

at identificere tumorer og præneoplastiske læsioner, tyktarmen blev åbnet på langs, fladtrykt på filterpapir og fikseret i 4% fosfatbufferet formalin pH 7,0 (Roth, Karlsruhe, Tyskland). Til identifikation af tumorer og kryptfoci (ACF), blev colon farvet med 0,1% methylenblåt [22]. Bagefter mucin depleteret foci (MDF) blev identificeret i den samme colon væv ved sekventiel farvning med høj jern diamin (HID) og 1% Alcian Blue (AB). Prøverne blev analyseret ved anvendelse af et stereomikroskop (Olympus SZH10, Olympus, Tokyo, Japan). Placeringen og diameter af læsioner og antallet af krypter i en ACF eller MDF (crypt multiplicitet) blev registreret. Alle MDF består af mere end to krypter, og alle tumorer blev skåret ud og verificeret af hæmatoxylin og eosin (H 1:8.000), anti-ki-67 (M7249, Dako, 1:60), anti prolifererende celler (PCNA, # 2714-1, Epitomics, Burlingame, CA, USA, 1:20.000), anti-p53 (NCL-p53-CM5p, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK, 1:1.600), anti-GPx2 antiserum [23] (1:12.000), og anti-F4 /80 (MCA497, Serotec, Kidlington (Oxford), UK, 1:8.000). Sekundære antistoffer eller kits (N-Histofine® Mousestain Kit, N-Histofine® Simple Stain Mouse MAX PO for musevæv, anti-rotte eller anti-kanin, alle fra Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan), blev anvendt i 30 minutter ved stue temperatur. Antistofbinding blev visualiseret med diaminobenzidin (Dako). Immunreaktivitet blev scoret i en blindet måde. Længden af ​​PCNA-positive zone og total krypt længde blev målt ved anvendelse Mirax Viewer Software (Version 1.12.22.0, Carl Zeiss, Gottingen, Tyskland) fra 100 krypter pr dyr. F4 /80-positive celler i lamina propria langs tværsnit krypter blev bedømt i 10 krypter pr dyr.

Kvantificering af apoptotiske celler blev udført ved hjælp af morfologiske kriterier i hæmatoxylin farvede snit af den distale colon i 200 på langs åbnet krypter per dyr som beskrevet [20]. For at identificere MDF i vævssnit blev muciner visualiseret ved sekventiel farvning med 1% AB, pH 2,5 og Periodic Acid-Schiff (PAS) og modfarvning med hæmatoxylin. Serielle snit blev farvet med PAS /AB, H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

GPx2-KO mus udvikler Færre AOM-inducerede tumorer end WT Mus Under begge, en selen-fattig og -supplemented. kost

Efter fodring mus for -Se og ++ Se-kost, jejunum og hepatisk GPX aktivitet blev signifikant nedsat og forøget, sammenlignet med + Se-grupper (fig. 1B). Højere GPX-aktivitet blev fundet i jejunum af GPx2-KO sammenlignet med WT mus på ++ Se diæt (fig. 1B), formodentlig forårsaget af en kompensatorisk opregulering af GPx1 som vi tidligere beskrevet for ileum og colon [20]. Tarmens lokalisering af GPx2 blev analyseret ved IHC i colon fra WT mus (fig. S1A). GPx2 var højest ved crypt baser og målelig ved den øverste tredjedel af krypter. Lignende niveauer af GPx2 protein blev detekteret i colon fra WT mus på + SE og ++ Se-kost, mens GPx2 ekspression blev nedreguleret på -se kostvaner.

For at teste virkningen af ​​en GPx2- KO på tumorudvikling blev mus udfordret seks gange med AOM og analyseret 16 uger efter den sidste AOM ansøgning. Selvom tumorincidens ikke var signifikant forskellig mellem de eksperimentelle grupper, -Se og ++ Se GPx2-KO mus havde signifikant lavere tumor tal end WT mus på samme kost (Fig. 2A). Mens tumor numre var ens lav i GPx2-KO-mus uanset selenstatus (-Se: 5, + SE: 5, ++ SE: 3), tumor numre i WT-mus var højere i -Se og ++ Se-grupper end i + Se gruppe (-Se: 14 og ++ Se: 13 vs. + Se: 7). Den selenstatus påvirkede ikke signifikant tumorincidensen eller total tumor nummer. Alle tumorer blev ikke-invasive adenomer placeret fra den tværgående colon til endetarmen [25].

16 uger efter den sidste AOM injektion WT og GPx2-KO-mus blev analyseret for tumorforekomst og total tumor antal pr gruppe ( A) og til ACF bestående af 4 krypter (B) eller ≥4 krypter (C) ved methylenblåt farvning. MDF (D) blev talt i HID /AB farvet colon. ACF og MDF-numre er vist som scatter dot plots med middelværdien. Tumor diameter er afbildet som kasse og whiskers fra min til max (E). P-værdier for (A) blev beregnet ved anvendelse af Fishers eksakte test. For at teste betydning for total tumor nummer, blev tumorincidensen vægtes med tumor nummer. P-værdier for (B-E) blev beregnet ved anvendelse uparret t-test. * P ≤ 0,05 og ** P≤0.01 vs WT,

# p ≤ 0,05 vs. -Se. Nr ACF, MDF eller tumorer blev observeret i saltvandsbehandlede kontroller (n = 10).

Vi kvantificeret ACF og MDF, der begge betragtes som præneoplastiske markører [26]. Vi differentieret mellem ACF med en lav ( 4) og en høj (≥4) krypt mangfoldighed fordi sidstnævnte formodes at være en bedre biomarkør for tumor udvikling end den tidligere [26]. Antal ACF blev ikke påvirket af de selen diæter (fig. 2B og C). Mens -Se WT mus havde en tendens (p = 0,06) til at have færre ACF med lav krypt multiplicitet end respektive GPx2-KO-mus (fig. 2B), -Se WT mus havde signifikant mere ACF med høj krypt multiplicitet end GPx2-KO-mus (fig . 2C). Vi kvantificerede også MDF, som er karakteriseret ved ændringer i den cellulære sammensætning af krypten herunder tab af slimceller. I modsætning til ACF, MDF består altid af dysplastiske krypter sandsynligvis udvikle sig til tumorer [26], [27]. Kun + Se WT mus havde signifikant mere MDF forhold til GPx2-KO-mus (fig. 2D), mens -Se og ++ Se WT mus havde flere tumorer end GPx2-KO-mus (fig. 2A). Således i selen-tilstrækkelighed forskellen mellem genotyper blev kun påvist på MDF-niveau. Tumor numre var lige lav i begge genotyper under + Se som kunne implicerer, at betingelserne for tumorudvikling var mere passende i -Se og ++ Se WT grupper.

Tumordiameteren blev målt som parameter for tumorvækst. GPx2-KO og WT mus på -Se og ++ Se-diæter havde samme tumorstørrelse, mens tumorer var signifikant større i + Se GPx2-KO end i + Se WT mus (Fig. 2E). ++ Se GPx2-KO mus havde mindre tumorer i sammenligning med -Se GPx2-KO-mus. I WT-grupper, har kosten selen ikke signifikant påvirker tumorstørrelse.

GPx2 og β-catenin blev forhøjet i præneoplastiske Læsioner

GPx2 udtryk øges især i tidlige stadier af neoplastisk transformation i den menneskelige tarm [6], der kan være medieret af β-catenin [7]. For at teste, om GPx2 ekspression også er forøget i præneoplastiske læsioner af AOM-behandlede mus blev GPx2 analyseret ved IHC i + Se WT-mus 16 uger efter den sidste AOM ansøgning. PAS /AB-farvning identificeret 67 MDF i fem mus. Serielle snit blev farvet for β-catenin, GPx2, og Ki-67. p-catenin immunreaktivitet blev forøget i 85% (57/67) af MDF i forhold til den omgivende normale væv i overensstemmelse med publicerede data [27]. GPx2 immunoreaktivitet blev øget i 67% (45/67) af MDF sammenlignet med normale krypter.

MDF blev yderligere karakteriseret baseret på deres grad af dysplasi og krypt mangfoldighed at bestemme, om GPx2 og β-catenin co-lokalisere . MDF med en mindre grad af dysplasi havde en næsten normal krypt morfologi, en lav multiplicitet, nogle resterende slimceller (fig. 3A-I), og en normal fordeling af ki-67-positive celler (fig. 3A-IV). Disse MDF udviste mere membran-lokaliserede β-catenin, der overvejende blev detekteret i den luminale del (fig. 3A-II blå pil) i krypten eller i hele krypter sammenlignet med normale krypter. GPx2 immunoreaktivitet blev let øget ved krypt bunden af ​​dem, MDF sammenlignet med normale krypter og forlænget mod den luminale side (fig. 3A-III sort pil). Derfor, i MDF med mindre dysplasi GPx2 og β-catenin er forhøjede i forskellige epitelceller.

Serial IHC-farvning af colon schweiziske ruller blev udført i PAS /AB, β-catenin, GPx2, og Ki-67 i fem + Se WT-mus 16 uger efter den sidste AOM-behandling (A-C). Repræsentative farvninger af en MDF karakteriseret ved en mindre grad af dysplasi og lav crypt multiplicitet (A), en MDF med avanceret dysplasi og højere multiplicitet (B), og en microadenoma (C). Blomstrende inflammation i AOM-behandlede, -Se GPx2-KO-mus blev identificeret ved PAS /AB, F4 /80, og H & E-farvning (D). Miltvægt blev normaliseret til legemsvægt (E). Midler + SD, n = 10 i saltvandsbehandlede og n = 20 i AOM-behandlede grupper. Signifikans blev bestemt ved anvendelse af 2-vejs ANOVA med Bonferroni post-test. * P ≤ 0,05 vs WT,

xP≤0.05 vs saltvand.

MDF med avanceret dysplasi var præget af højere mangfoldighed, fortykkede epitelceller, næsten fuldstændigt tab af slimceller, og øget ki-67-farvning (fig. 3B-i og IV) og udviste både mere β-catenin og GPx2 immunoreaktivitet i hele crypt (fig. 3B-II og III). På celleniveau, GPx2 og β-catenin co-lokaliseret i midten af ​​MDF med avanceret dysplasi, hvilket antyder, at høje niveauer af begge proteiner var kun detekterbar i et specifikt område i krypten under et bestemt tidspunkt på dysplastiske transformation.

Endvidere blev en microadenoma karakteriseret ved fuldstændig bæger celletab, forstyrret crypt arkitektur (fig. 3C-i), massiv opregulering af nuklear og cytoplasmatisk β-catenin (fig. 3C-II), og et stort antal ki-67-positive celler (fig. 3C-IV). I denne struktur blev GPx2 udtryk helt mistet i området med forhøjet β-catenin, mens den forblev opreguleret mindre dedifferentierede omkringliggende krypter (fig. 3C-II og III, pilespidser) med lignende karakteristika som MDF med fremskreden dysplasi.

AOM-behandlet Selen-dårlig GPx2-KO mus udviklede en Florid betændelse i Colon

AOM-behandlede -Se GPx2-KO mus udviklet en klar betændelse lige fra en moderat til en blomstrende tilstand , som ikke blev observeret i nogen anden gruppe (fig. 3D). I den distale colon, inflammation var moderat som karakteriseret ved krypt degeneration, infiltrering af immunceller (vist ved F4 /80-positive myeloide celler), og en stigning i bindevæv. Ved begyndelsen af ​​den tværgående tyktarm en blomstrende inflammation (fig. 3D) med massiv immuncelle infiltration blev observeret. Crypt arkitektur var fordrejet i de berørte områder sandsynligvis på grund af svigt af epitelcelle fornyelse.

Et veletableret indikator for systemisk inflammation er milt vægt. Miltvægten tendens til at blive forøget i alle AOM-behandlede grupper (fig. 3E) og var signifikant højere i AOM-behandlede -Se GPx2-KO-mus end i respektive WT mus. Dette korrelerer med colon inflammation. På grund af den massive forvrængning i epithelmorfologi, β-catenin og GPx2 co-lokalisering i -Se GPx2-KO-mus kunne ikke sammenlignes med de øvrige grupper. Der blev ikke observeret nogen åbenlyse forskelle i dysplastiske strukturer eller tilsvarende β-catenin-niveauer mellem + Se og ++ Se GPx2-KO og WT mus (data ikke vist).

AOM-behandling Øget apoptotisk celledød i epitelceller fra GPx2-KO mus

AOM vides at inducere DNA alkyleringsprocesser addukter at peak 8 timer efter dens anvendelse [28]. Evnen til at fjerne DNA addukter af DNA-reparation eller p53-afhængig apoptose af de beskadigede celler er afgørende for forebyggelse af kræft udvikling [29]. Som tidligere rapporteret, at antallet af apoptotiske celler ved krypten base er signifikant højere i GPx2-KO end i WT mus og er dosisafhængigt formindsket ved forøgelse af selenforsyningen [20]. Det er velkendt, at kortvarig AOM-behandling øger apoptose [28]. Vi tælles apoptotiske celleantal (fig. 4A-D) og analyseret nuklear lokalisering af p53 (fig. S1B og C) 8 timer efter AOM injektion. Som forventet blev nukleare farvning af p53 på krypt basis steg i alle AOM-behandlede mus (fig. S1B og C), mens det var ikke målbart i mus uden AOM-behandling (fig. S1c). AOM ændrede ikke GPX-aktivitet (data ikke vist) eller GPx2 ekspression i WT-mus (fig. S1A).

(A-D) 8 timer efter AOM eller saltvand injektion blev apoptotiske epitelceller talt i 200 krypter per dyr under anvendelse H-farvede snit af den distale colon. Cryptocoryner var inddelt i 4 kvartaler. Den første viser den øvre del af krypten og den fjerde krypten base. Data er vist som middel + standardafvigelse, n = 5. Signifikans blev bestemt ved anvendelse af 2-vejs ANOVA med Bonferroni post-test. * P ≤ 0,05, *** P≤0.001 vs WT,

# p ≤ 0,05,

## P≤0.01,

### P≤0.001 som angivet,

xxP≤0.05 ,

xxxP≤0.001 vs saltvand.

AOM-behandling påvirkede ikke apoptotiske celletal i den luminale 1

st krypt kvartal (fig. 4A) uanset genotype eller selen status. GPx2-KO mus havde signifikant flere AOM-inducerede apoptotiske celler i -se og + Se-grupperne i 2

nd crypt kvartal (fig. 4B) og i -Se gruppe af 3

rd crypt kvartal (Fig . 4C) end respektive WT mus. I 4

th krypt kvartal, antallet af AOM-inducerede apoptotiske celler var lige så høj i begge genotyper (Fig. 4D). Det øgede antal apoptotiske celler ved krypt base af ubehandlede GPx2-KO-mus kunne bekræftes (fig. 4D, saltvand). Sammenfattende GPx2-KO-mus havde flere AOM-inducerede apoptotiske celler end WT-mus, som er specifikt placeret i midten af ​​krypten, den 2

nd og 3

rd krypt kvartal. Således AOM-initierede celler kan være blevet fjernet mere effektivt i GPx2-KO-mus resulterer i udvikling af færre tumorer.

Crypt Længde og proliferativ Zone er forstørret i colon af GPx2-KO-mus

for at analysere, om ændringerne i apoptotiske celler yderligere kan påvirke morfologien af ​​krypten, dens længde og højden af ​​det proliferative PCNA-positive zone blev målt. Begge blev øget betydeligt i GPx2-KO mus uanset selen status eller AOM-behandling (fig. 5). Udvidelsen af ​​PCNA-positive zone persisteret efter normalisering for crypt længde (data ikke vist), hvilket betyder, at den proliferative zone i GPx2-KO-mus dækkede ~ 10% af den samlede krypt længde end i WT. Da AOM kun inducerer apoptose i prolifererende celler [28], de AOM-inducerede apoptotiske celler bør være co-lokaliseret med proliferative PCNA-positive celler. Den IHC for PCNA af GPx2-KO mus afslørede, at de prolifererende celler ikke kun bor i 4

th og 3

rd krypt kvartal som observeret i WT mus, men også i de 2

nd krypt kvartal (fig. 5B). Dette korrelerede med flere apoptotiske celler i 2

nd krypt kvartal i -Se og + Se GPx2-KO-mus (fig. 4B).

Længden af ​​krypter og PCNA-positive zone i den distale colon af GPx2-KO og WT mus fodret de forskellige selen diæter blev bestemt 8 timer efter en enkelt dosis af AOM eller saltvand. (A) Længden af ​​PCNA-positive zone (grå farve) og PCNA fri zone (hvid farve) blev målt i den distale colon. Hele søjler repræsenterer total krypt længde. Værdier er middelværdier + SD, n = 5. Signifikans blev beregnet ved anvendelse af 2-vejs ANOVA med Bonferroni post-test. * P ≤ 0,05, ** P≤0.01, *** P≤0.001 vs WT. Symboler over de grå søjler angiver forskelle i PCNA-positive zone. Symboler over de hvide søjler angiver forskelle i total krypt længde. (B) Repræsentant PCNA farvning af saltvandsbehandlede, -Se WT og GPx2-KO-mus.

GPx2-KO mus er karakteriseret ved en lav-grade tarmbetændelse

Tidligere analyser har vist, at en dobbelt knockout af GPx1 og GPx2 resulterer i spontan ileocolitis [11]. For at karakterisere den basale tarmbetændelse status i ubehandlede GPx2-KO-mus, F4 /80-positive myeloide celler invaderer lamina propria af tyktarmsepitelet blev talt. Genotype forskelle var igen højest i -se grupper, faldt i + Se og forsvandt i ++ Se grupper (fig. 6A). Desuden -Se GPx2-KO-mus havde flere CD3-positive T-celler i lamina propria end WT-mus (data ikke vist). Betragtninger AOM-behandlede -se GPx2-KO mus udviklede en blomstrende betændelse med forstyrret krypt arkitektur (fig. 3D), ubehandlet -Se GPx2-KO mus udviste mindre alvorlig betændelse og vedligeholdes en intakt krypt morfologi (fig. 6B). Sammenfattende GPx2-KO mus udviklede en basal lav kvalitet inflammation, hvilket var højest i -Se.

F4 /80-positive myeloide celler blev analyseret i ubehandlede GPx2-KO og WT mus efter 7 uger på selen kostvaner. F4 /80-positive celler i lamina propria støder op til en krypt blev talt i tyktarmen (A). Midler + SD, n = 4. Repræsentative F4 /80-farvning af -Se WT og GPx2-KO kolon (B). Signifikans blev bestemt ved anvendelse af 2-vejs ANOVA med Bonferroni post-test. * P ≤ 0,05, ** P≤0.01 vs WT,

## P≤0.01 vs. -Se.

Diskussion

Tumor Udvikling og Initiation

GPx2-KO-mus udviklede færre tumorer på -Se eller ++ Se-kostvaner og færre MDF på + Se kost end respektive WT mus (fig. 2A og D). Dette indikerer, at GPx2-KO-mus er mere resistente over for AOM-inducerede cancer. I modsætning hertil GPx2-KO mus udviklede flere tumorer i en AOM /DSS-induceret tyktarmskræft model [10], som korreleret med en mere alvorlig DSS-colitis ved GPx2 sletning. Således er den anti-kræftfremkaldende aktivitet GPx2 i inflammation-udløst tyktarmskræft primært forårsaget af dets anti-inflammatoriske rolle. Den pro-kræftfremkaldende aktivitet GPx2 efter AOM-behandling alene fremhæver den afgørende betydning af DSS-colitis som en tumor-drivende kraft i AOM /DSS modellen. AOM inducerer G /A base-konverteringer, som primært resulterer i aktivering af mutationer i β-catenin. Disse mutationer modvirkes af forsvarsmekanismer, herunder DNA-basen reparation eller apoptose. Derfor apoptose spiller en dominerende rolle i forebyggelsen af ​​AOM-induceret kræft. Ved 6-8 timer efter AOM behandling, crypt epiteliale celler undergår apoptose i en p53-afhængig måde [30], [31] (fig. S1B og C). Hvis beskadigede progenitorceller unddrage apoptose, kan de producere afvigende krypter, som kan udvikle sig tumorer [32]. Mus mangelfuld i pro-apoptotiske gener som

p53

[33],

Bak

[34], og

Puma

[35] har højere antal af ACF eller tumorer og en lavere AOM-induceret apoptose.

Vi har vist her, og tidligere, at GPx2 mangel øger basal apoptose sats i krypt baser af tarmepitelet uanset selen status, selv om de fleste åbenbart i -Se tilstand (fig . 4D, saltvand) [20]. Et andet kendetegn ved GPx2-KO tarmepitelet er et forstørret proliferation zone (fig. 5), som formentlig er et forsøg på at modvirke apoptotisk celletab. 8 timer efter AOM-behandling blev flere AOM-inducerede apoptotiske celler tælles i midten af ​​krypt region (2

nd og 3

rd krypt kvartal. Figur 4B og C) i -Se og + Se GPx2- KO i sammenligning med WT-mus. Kun GPx2-KO mus har et højere antal prolifererende celler i denne region. Højere niveauer af basal og AOM-induceret apoptose i GPx2-KO mus formodes at effektivt eliminere AOM-initierede celler. I WT mus, er dysplastiske krypter karakteriseret ved forhøjede GPx2 niveauer (fig. 3A og B), som formodentlig undertrykker apoptose. I GPx2-KO dysplastiske krypter en forbedret hastighed af apoptose kan modvirke ondartet progression. Baseret på disse resultater, GPx2 åbenbart er i stand til at forbedre udviklingen af ​​kræft ved at undertrykke apoptose, som ellers fjerner beskadigede eller transformerede celler.

tumorstørrelse og Promotion

Uventet, tumorer var større i + Se GPx2- KO end i WT-mus (fig. 2E). Dette passer ikke med den pro-proliferative funktion GPx2 som postuleret fra en xenograftmodel med siRNA-medieret knockdown af GPx2 [14] og AOM /DSS-behandlede GPx2-KO mus [10], hvilket ville have resulteret i større tumorer i WT snarere end i GPx2-KO. I den foreliggende undersøgelse tumorstørrelse var lig i -se og + Se-GPx2-KO-mus og signifikant med ++ Se (fig. 2E). Denne korreleret med mængden af ​​infiltrerede inflammatoriske celler (fig. 6) i den ubehandlede GPx2-KO kolon, som kun blev øget i -Se og + Se, men ikke i ++ Se GPx2-KO i forhold til WT mus. Mus mangelfuld i både GPx1 og GPx2 spontant udvikle ileocolitis [11] og DSS-induceret colitis er mere alvorlig hos mus mangelfuld GPx2 [10]. Her udviser vi at uprovokerede GPx2-KO-mus har en lav kvalitet colitis, kendetegnet ved øget milt vægt (fig. 3E), infiltration af inflammatoriske celler (fig. 6), og krypt forlængelse (fig. 5A). Desuden blev plasma TNFa-niveauer steg i + Se GPx2-KO-mus (upubliceret observation).