PLoS ONE: Anti-IL-20 monoklonalt antistof blænder Prostata Cancer Vækst og knogleosteolysen i murine Models

Abstrakt

Interleukin (IL) -20 er en proinflammatorisk cytokin i IL-10 familien. IL-20 er forbundet med tumorpromotion i patogenesen af ​​oral, blære og brystcancer. Men lidt er kendt om den rolle, IL-20 i prostatakræft. Vi hypotesen, at IL-20 fremmer væksten af ​​prostatacancerceller. Immunohistokemisk farvning viste, at IL-20 og dets receptorer blev udtrykt i humane PC-3 og LNCaP prostatakræft-cellelinier og i prostata tumorvæv fra 40 patienter.

In vitro

, IL-20 opreguleret N-cadherin, STAT3, vimentin, fibronektin, RANKL, cathepsin G, og cathepsin K, og øget migration og koloni dannelse af prostata kræftceller via aktiveret p38, ERK1 /2 , AKT, og NF-KB signaler i PC-3 celler. Vi undersøgte virkningerne af anti-IL-20 monoklonalt antistof 7E på prostatatumorvækst

in vivo

hjælp SCID mus subkutan og intratibial xenograft tumormodeller.

In vivo

, 7E reducerede tumorvækst, undertrykte tumor-medieret osteolyse, og beskyttet knoglemineraltætheden efter intratibial injektion af prostata kræftceller. Vi konkluderer, at IL-20 er involveret i cellemigrering, kolonidannelse, og tumor-induceret osteolyse af prostatacancer. Derfor kan IL-20 være en roman mål til behandling af prostatacancer

Henvisning:. Hsu YH, Wu CY, Hsing CH, Lai WT, Wu LW, Chang MS (2015) Anti-IL-20 monoklonalt antistof undertrykker Prostata Cancer vækst og knogleosteolysen i murine modeller. PLoS ONE 10 (10): e0139871. doi: 10,1371 /journal.pone.0139871

Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, Frankrig

Modtaget: 12. maj 2015; Accepteret: September 16, 2015; Udgivet: 6 oktober 2015

Copyright: © 2015 Hsu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Taiwan (mEST 103-2311-B-006-002 og mEST 104-2311-B-006-007 -MY2)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den anden mest indfaldende kræft og den sjette årsag til kræft. dødsfald hos mænd verden over [1]. Flertallet af mænd med fremskreden prostatacancer har sklerotisk knoglemetastaser, som forårsager alvorlige smerter og patologiske knoglebrud [2, 3]. Invasion af knoglen rummet ved cancerceller forårsager en ubalance i osteoclast og osteoblast aktivitet, som igen afbryder knoglehomøostase [4]. Disse kræft-induceret knogle svar favorisere overlevelse og vækst af kræftceller i deres nye omgivelser. Selvom prostatakræft knoglemetastaser primært osteoblastiske i naturen, er der stigende tegn på, at osteoklast-medieret osteolyse bidrager også til knogle sygelighed i prostata cancer patienter med knoglemetastaser [5, 6].

Andre rapporterer, at bryst og prostata cancere inducerer osteoclast-aktivering ved at frigive opløselige faktorer, såsom IL-1, IL-6, og makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF). De fleste af disse mediatorer virker på osteoblaster og stromale celler, og bidrage til osteolytiske læsioner ved opregulering receptoraktivator af NF-KB-ligand (RANKL), hvilket giver en mulig mekanisme til at forklare forøget knogleresorption i knoglemetastaser [6, 7]. RANKL binder til sin receptor (RANK) på cellemembranen af ​​osteoklaster, som fører til differentiering og modning af osteoklaster [8]. Cathepsin K, en cysteinprotease, der udskilles af osteoklaster og prostatacancerceller, nedbryder ekstracellulære matrix under knogleresorption [9]. Cathepsin G, en kemoattraktant for osteoklastpræcursorer, kan behandle RANKL til en opløselig form (sRANKL), der fremmer osteoklast aktivering [10, 11]. Blokering cathepsin G og cathepsin K reducerer tumorinduceret osteolyse, hvilket antyder, at cathepsin K og cathepsin G er afgørende i mikromiljø kræft-induceret osteolytiske læsioner [10, 12].

Inflammation kritisk relateret til tumor betydeligt progression. Det påvirker tumorigenese på det molekylære niveau ved at modulere tumormikromiljøet og regulere balancen af ​​cytokiner, chemokiner og transkriptionelle faktorer [13, 14]. Den epitel-mesenkymale overgang (EMT) er kritisk for kræft metastaser. EMT ændrer adfærd af kræftceller og får dem til at invadere det omgivende stroma, fører til deres intravasation, formidling, og kolonisering af fjerne steder [15, 16]. Under EMT, tumorceller, som er epiteliale-lignende celler, erhverve mesenchymale egenskaber, og tabet af den epitheliale markør E-cadherin fører til en stigning i de mesenkymale markører N-cadherin, fibronectin og vimentin [17]. Adskillige EMT induktorer som Sneglen og Twist, er transkriptionsfaktorer, der undertrykker E-cadherin udtryk [16, 18]. Andre undersøgelser [19, 20] har rapporteret, at cancerceller fremmet EMT ved at aktivere STAT3 signalvejen.

IL-20 er et medlem af IL-10 familien, som inkluderer IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 og IL-26 [21, 22]. Det signalerer gennem to typer af heterodimer receptor kompleks: IL-20R1 /IL-20R2 og IL-22R1 /IL-20R2 [23]. IL-20 er involveret i adskillige inflammatoriske sygdomme, såsom rheumatoid arthritis [24], atherosclerose [25], psoriasis [26, 27], osteoporose [28], oral cancer [29], og brystkræft [30].

Prostatacancer er en kompleks sygdom, hvor metastaser til knoglen er en årsag til morbiditet og kan gå forud metastase til andre vitale organer. Vi har tidligere [28, 30] viste, at IL-20 ikke kun fremmer bryst tumor spredning og migration, men også modulerer osteoklastdifferentiering ved opregulering RANKL og RANK. Anti-IL-20 monoklonalt antistof (mAb) 7E faldt osteolytiske knoglelæsioner i musemodeller for brystkræft og beskyttede ovarieektomiserede mus mod osteoporotisk knogletab, som begge støtter tanken om, at IL-20 er kritisk for regulering af tumor-medieret osteolyse. Vi hypotesen, at IL-20 fremmer væksten af ​​prostatacancerceller. Derfor undersøgte vi udtryk for IL-20 og dens biologiske funktion i prostata kræftceller og vurderet det terapeutiske potentiale 7E i xenograft prostatakræft musemodeller.

Materialer og metoder

Immunhistokemi

paraffinindlejrede vævssnit på 40 human prostatacancer prøver blev opnået fra en kommerciel prostatacancer vævsarray (SuperBioChips Laboratories, Seoul, Korea), og blev anvendt til immunhistokemisk (IHC) farvning med anti-IL-20 (7E ), anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, eller anti-IL-22R1 mAb (R R 200) eller høj-ekspression (H ≥ 200). Immuncytokemisk farvning af IL-20 og dets receptorer i PC-3-celler blev udført ved anvendelse af den samme protokol som beskrevet ovenfor.

Cellekultur

prostatakræft-cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Humane prostatacancer-cellelinier, PC-3 og LNCaP, blev opretholdt i RPMI-1640 med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, Rockville, MD), 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin . Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

Celleproliferationsassay

PC-3-celler (3 x 10

4) blev dyrket natten over og derefter udsat for human (h) IL-20 (200 ng /ml) i 72 timer i medium indeholdende 1% FBS. For at bekræfte den specifikke aktivitet af IL-20, 7E (2 ug /ml) blev tilsat til dyrkningssystemet, enten alene eller sammen med IL-20 ved en 10: 1 (7E: IL-20) koncentrationsforhold. Cellerne blev derefter inkuberet med 1 mg /ml methylthiazol tetrazolium (MTT) (Sigma-Aldrich) i 3 timer og MTT-formazan krystaller blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich). Absorbans blev målt ved 550 nm.

cellemigrationsassay

Cell migration blev analyseret under anvendelse af et modificeret Boyden kammer med en polycarbonat filter med 8 um porer (Nucleopore, Cabin John, MD). De øverste brønde blev fyldt med PC-3-celler (5 x 10

4). De nedre kamre blev fyldt med hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mlgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, eller hIL-20 plus mlgG i RPMI-1640 indeholdende 1 % FBS. RPMI-1640 med 1% FBS blev anvendt som en negativ kontrol. Cellerne fik lov til at migrere i 8 timer, og derefter de blev farvet og talt. Forsøget blev udført i tre gange ved anvendelse firedobbelte brønde.

Real-time migration assay

PC-3-celler blev podet ved 5 x 10

4 celler /ml i 6-brønds skåle og fik lov til at binde i 18 timer. Cellerne blev derefter udsat for medium indeholdende hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mlgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, eller hIL-20 plus mlgG. Cell migration kinetik er optaget med en fluorescerende celle analysator (JULI Smart, Montreal Biotechnologies Inc. (MBI), Dorval, Montreal, Canada) i 18 timer og derefter analyseret ved hjælp ImageJ software (https://rsbweb.nih.gov/ij/)

Soft agar kolonidannende assay

Celler udviser eksponentiel vækst blev suspenderet i komplet vækstmedium indeholdende 0,35% Bacto-agar (A-6013 type 1 lav EEO;. Sigma-Aldrich) og overlejret på 0,5% agarosegel i 30 mm skåle (1 × 10

4 celler /skål). Medium indeholdende IL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mlgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, eller hIL-20 plus mlgG blev overlejret på topagar. Skålene blev holdt ved 37 ° C i en befugtet inkubator (5% CO

2, 95% O

2) i tre uger. I denne periode, blev mediet ændres hver 2 dage. Antallet af synlige kolonier ( 50 um) blev talt under et mikroskop. Alle eksperimenter blev udført tre gange.

Real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR)

For at analysere ekspressionen af ​​IL-20 og dens receptorer, totalt RNA fra PC-3 og LNCaP-celler blev ekstraheret under anvendelse af et reagens (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA), og derefter totalt RNA gennemgik revers transkription (Clontech, Palo Alto, CA) ifølge producentens instruktioner. Det amplificerede template blev påvist under anvendelse SYBR Green med en real-time PCR-system (StepOnePlus; Applied Biosystems) med genspecifikke primere. Glyceraldehyd phosphat dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en intern kontrol. For at undersøge ekspressionen af ​​E-cadherin, N-cadherin, STAT3, vimentin, fibronectin, RANKL, cathepsin G, og cathepsin K, blev PC-3-celler inkuberet med hIL-20 (200 ng /ml) i 2 til 6 timer. Ekspressionsniveauerne af disse gener blev analyseret ved anvendelse SYBR Green (Applied Biosystems) som interaktionen middel. Kvantificering analyse af mRNA blev normaliseret med humant GAPDH som husholdning genet. Relative multipla af ændring i mRNA-ekspression blev bestemt ved at beregne 2

-ΔΔCt.

Western blotting

PC-3-celler (2 × 10

5) blev stimuleret med hIL- 20 (200 ng /ml) (R blev anvendt (TPCK Sigma-Aldrich) for at blokere proteaseaktiviteten af ​​cathepsin G. PC-3-celler blev præinkuberet med 1 uM af TPCK i 1 time og derefter behandlet med hIL-20 i yderligere 72 timer. TPCK blev opløst i 100% ethanol (EtOH), og derefter fortyndet i dyrkningsmedium. Vehikelkontrollen var 0,0175% EtOH i dyrkningsmedium. Niveauet af sRANKL i det endelige dyrkede medium blev analyseret ved ELISA.

Prostatakræft PC-3-bærende tumor model

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de protokoller, baseret på Taiwan National Institutes Sundhedsstyrelsen (Taipei, Taiwan) standarder og retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr. Procedurerne forskning blev godkendt af Det Dyreetiske udvalg National Cheng Kung University. blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser og til at reducere antallet af anvendte dyr. Otte uger gammel mand svær kombineret immundefekt (SCID) mus blev anvendt i alle eksperimenter. Kort beskrevet blev mus bedøvet under anvendelse af en intraperitoneal (i.p.) injektion af pentobarbital (50 mg /kg) og blev derefter injiceret med buprenorphin (2 mg /kg; i.p.) til kirurgisk smertelindring. Den venstre brystfedtpude af hver mus subkutant injiceret med PC-3-celler (1 x 10

6). Succesraten til subkutan (s.c.) tumorimplantation var 100%. Musene blev derefter randomiseret til 3 grupper (n = 4 i hver gruppe), og behandlet med phosphatbufret saltvand (PBS), 7E (10 mg /kg, sc) eller muse-immunglobulin G (mlgG; 10 mg /kg ; sc) tre gange om ugen for varigheden af ​​behandlingsplanen. Antistoffet blev injiceret (s.c.) i periferien af ​​den voksende tumor i tumorbærende SCID-mus. Raske kontroller blev ikke injiceret med tumorceller. Tumorstørrelsen blev målt med en skydelære i tre på hinanden vinkelrette dimensioner og beregnes efter følgende formel: tumorstørrelse = 0,5 × (længde x bredde x dybde). Fyrre dage efter tumorcellerne var blevet injiceret, blev musene aflivet ved anvendelse af CO

2, og tumorvævet blev høstet og vejet. At analysere ekspressionsniveauer af IL-20 og cathepsin G, blev tumorvævet isoleret fra de 4 mus i hver gruppe indsamlet, og det totale RNA blev ekstraheret til yderligere analyse.

Intratibial injektion af PC-3 i SCID-mus

Otte uger gamle mandlige SCID-mus blev bedøvet under anvendelse af en injektion af pentobarbital (50 mg /kg) og derefter af buprenorphin (2 mg /kg, IP) til kirurgisk smertelindring. Hver fik en medial parapatellar incision og en kanyle blev placeret i den intramedullære kanal af skinnebenet. PC-3-celler, ved en koncentration på 2 × 10

5/100 pi, blev langsomt injiceret i skinneben og incisionen blev lukket med 5-0 krom suturer. For postoperativ analgesi, buprenorphin (2 mg /kg; i.p.) injiceret en gang dagligt i 3 dage efter kirurgi. Succesraten for intratibial tumor implantation var 100%. Musene blev derefter tilfældigt inddelt i tre grupper (n = 5 i hver gruppe) og injiceret med vehikel (PBS; ip), mlgG (10 mg /kg, ip) eller 7E (10 mg /kg, IP) tre gange om uge. Syv uger efter behandlingerne begyndte, blev musene aflives ved hjælp af CO

2, og deres tibial metafyser blev analyseret

in vivo

hjælp mikro-computertomografi (mikro-CT) med en høj opløsning, lavdosis X-ray scanner. Knoglemineraltæthed (BMD) blev analyseret i 50 på hinanden følgende skiver. Resultaterne blev beregnet som en procentdel versus værdier fra en sund kontrol.

Statistisk analyse

Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) blev anvendt til den statistiske analyse. En envejs variansanalyse (ANOVA) parametrisk Kruskal-Wallis test blev anvendt til at sammenligne data mellem grupper. Post hoc sammenligninger blev udført under anvendelse af Dunns multiple sammenligningstest. Data er gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Signifikans blev fastsat til

P

0.05

Resultater

Ekspression af IL-20 og dets receptorer i patienter med prostatacancer

Fyrre prostata adenocarcinom vævsprøver (fase II, n = 8;. Fase III, n = 32) blev IHC farvet med anti-IL-20 mAb’er. Farvning intensiteten var høj-udtryk i 22 prøver (Fig 1A) og lav-udtryk i 18 prøver. For at undersøge om prostatacancer celle er målcellen for IL-20, anvendte vi IHC-farvning til at analysere ekspressionsniveauerne af IL-20 ‘s receptorer (IL-20R1, IL-20R2, og IL-22R1) i prostata adenocarcinom vævsprøver fra 40 patienter. Prostata carcinomceller blev alle positivt farvet med anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, og anti-IL-22R1 mAb’er (figur 1B, 1C og 1D). Intensiteten af ​​IHC-farvning af prostatacarcinom væv var heterogen (Fig 1F). Anti-IL-20 og anti-IL-20R1 mAb’er er stærkt farves på tumorceller, men anti-IL-20R2 og anti-IL-22R1 mAb’er er ikke (Fig 1A, 1B, 1C og 1D, pile) på den repræsentative carcinom væv. Udtrykket af IL-20R1, IL-20R2, og IL-22R1 var høj i 37, 7, og 10 prøver, henholdsvis.

(AE) Kirurgisk biopsi prostata prøver adenocarcinom væv (fase II, n = 8 ; fase III, n = 32) fra 40 patienter blev opnået fra en kommerciel prostatakræft væv array. IHC-farvning med anti-IL-20, anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, og anti-IL-22R1 mAb’er viste, at IL-20 og dets receptorer (IL-20R1, IL-20R2, og IL-22R1) blev plettet. Muse IgG1 (mIgG1) isotype var den negative kontrol. Pile angiver prostatacancerceller. Forstørrelse: 200 ×. Data er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter med lignende resultater. (F) Kvantificering af farvningsintensitet af anti-IL-20, anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, og anti-IL-22R1 mAb’er fra 40 human prostatacancer prøver. IHC, immunhistokemisk farvning; mAb, monoklonalt antistof; mlgG, mus immunglobulin.

Cell proliferation blev hæmmet i 7E-behandlede PC-3 celler

For at klarlægge, hvilken rolle af IL-20 i patogenesen af ​​prostatakræft, vi først undersøgt hvorvidt IL-20 og dets receptorer (IL-20R1, IL-20R2, og IL-22R1) blev udtrykt i prostata cancercellelinier. RT-qPCR og IHC-farvning viste, at IL-20 og dets receptorer alle blev udtrykt i PC-3-celler (fig 2A og 2B), og i LNCaP-celler (figur 2A). Det første trin i tumorudvikling menes at være resultatet af en genetisk ændring, der fører til den unormale proliferation af en enkelt celle. For at bestemme om IL-20 fremmes PC-3-celleproliferation, anvendtes en MTT-assay, hvilket viste, at IL-20 ikke signifikant fremmer celleproliferation af PC-3-celler, men denne celle proliferation blev dosisafhængigt inhiberet i 7E-behandlede PC-3-celler (fig 2C og 2D). Tumorprogression involveret cellevandring og metastase til fjerne organer. A real-time migration assay viste, at cellemigrering var forøget i IL-20-behandlede PC-3-celler i forhold til ubehandlede kontroller, blev aktiviteten af ​​hvilken svækket af 7E (Fig 3A og 3B). Desuden er en Boyden kammer assay viste lignende resultater (figur 3C og 3D).

(A) RT-qPCR viste, at IL-20 og dets receptorer blev udtrykt i prostatacancer PC-3 og LNCaP-celler. Data er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter med lignende resultater. (B) IHC viste, at IL-20 og dets receptorer blev udtrykt i prostatacancer PC-3-celler. Data er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter med lignende resultater. (C) en MTT assay viste, at celleproliferation blev inhiberet i 7E-behandlede PC-3-celler. Medium alene blev anvendt som en negativ kontrol. 7E blev anvendt til at inhibere aktiviteten af ​​hIL-20. * P 0,05 versus ubehandlede kontroller, #p 0,05 versus hIL-20-gruppen. Dataene er middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg. (D) en MTT assay viste, at celleproliferation blev dosisafhængigt inhiberet i 7E-behandlede PC-3-celler. * P 0,05, ** p 0,01 versus mlgG kontroller. Dataene er middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg. RT-qPCR, real-time kvantitativ polymerase kædereaktion; MTT, methylthiazol tetrazolium; 7E, anti-IL-20 monoklonalt antistof; hlL-20, human interleukin-20.

(A-B) Cellemigrering blev evalueret ved hjælp af real-time migration assay. PC-3-celler blev inkuberet med medium indeholdende hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mlgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, eller hIL-20 plus mlgG. Cell migration kinetik blev registreret ved hjælp af en smart fluorescerende celle analysator til 18 timer. (A) Repræsentative time-lapse billeder til sporing bevægelser afstand af PC-3-celler er vist for hver gruppe. Bevægelsen afstanden for hver celle er præsenteret i forskellige farver (count = 7 celler). (B) Kvantisering af bevægelsen afstand (i um) af pc-3 celler (tæller = 7 celler). Muse IgG var den negative kontrol af 7E. * P 0,05 versus ubehandlede kontroller, #p 0,05 versus hIL-20-gruppen. Data er middelværdierne ± SD af tre uafhængige forsøg, hver udført i fire eksemplarer. (C-D) Cellemigrering også vurderet under anvendelse af en modificeret Boyden kammer assay. De øverste brønde blev fyldt med 5 × 10

4 PC-3 celler. De nedre kamre blev fyldt med hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mlgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, eller hIL-20 plus mlgG i RPMI-1640 indeholdende 1 % FBS. RPMI-1640 med 1% FBS blev anvendt som en negativ kontrol. Cellerne fik lov til at migrere i 8 timer. (C) Repræsentant Giemsa farvning billeder er vist for hver gruppe. (D) Kvantificering af migrerede celler pr. ** P 0,01 versus ubehandlede kontroller. ## P 0,01 versus hIL-20-gruppen. Dataene er middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg, hver udført i fire eksemplarer.

Colony dannelse blev forfremmet i IL-20-behandlede PC-3 celler

Det første trin i lokal invasion af prostatacancer er en stigning i kolonien dannelsen af ​​kræftceller. En blød agar-kolonidannelse assay viste, at forankringsuafhængig kolonidannelse var signifikant højere i IL-20-behandlede PC-3-celler end i ubehandlede kontroller, hvis aktivitet var svækket af 7E (fig 4A og 4B).

PC-3-celler (1 x 10

4 /brønd) blev inkuberet med hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mlgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, eller hIL-20 plus mlgG i 3 uger. Dyrkningsmediet blev udskiftet hver 2. dag. (A) Repræsentative billeder er vist for hver gruppe. (B) Kolonidannelse var signifikant højere i IL-20-behandlede PC-3-celler. 7E (2 ug /ml) blev anvendt til at inhibere aktiviteten af ​​IL-20. * P 0,05, ** p 0,01 versus ubehandlede kontroller, ## p 0,01 versus hIL-20-gruppen. Værdier er de midler ± SD af tre uafhængige forsøg, hver udført i tre eksemplarer.

Signal transduktion blev induceret i IL-20-behandlede PC-3 celler

Epithelial-mesenkymale overgang ( EMT) er fundamental i tumorprogression og metastase. For at undersøge om IL-20 er involveret i prostata tumormetastase gennem EMT, blev RT-qPCR anvendt til at analysere ekspressionen af ​​epitel markør E-cadherin, N-cadherin, STAT3, vimentin og mesenchymale markør fibronectin i PC-3-celler inkuberet med IL-20. Den viste, at E-cadherin var blevet nedreguleret (Fig 5A) og N-cadherin, STAT3, vimentin, var og fibronectin blevet væsentligt opreguleret (Fig 5B, 5C, 5D og 5E), mens der i 7E-behandlede celler, denne opregulering var svækket. At afdække den mulige mekanisme mellem IL-20 og tumorprogression, signal- molekyler af ERK1 /2, AKT, NF-KB, og p38 blev vurderet og fundet phosphoryleres i IL-20-behandlede PC-3-celler (Fig 5F) .

(AE) PC-3-celler blev behandlet med hIL-20 (200 ng /ml) i de angivne tidsrum, og ekspressionsniveauerne af E-cadherin, N-cadherin, STAT3, vimentin, og fibronectin blev analyseret ved anvendelse af RT-qPCR med specifikke primere. * P 0,05, ** p 0,01 versus 0-timers kontrol. Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter, hver udført in triplo. (F) PC-3-celler (2 x 10

5) blev inkuberet med hIL-20 (200 ng /ml) i de angivne tidsperioder, og derefter cellelysater blev opsamlet og analyseret under anvendelse af immunoblotting med specifikke antistoffer mod phospho- p38, fosfor-ERK1 /2, fosfor-AKT, og fosfor-NF-KB. p-actin antistof blev anvendt som en intern kontrol. Kvantificering af båndene blev foretaget under anvendelse ImageJ software. * P 0,05 versus 0-min kontrol. Dataene er middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg.

RANKL, cathepsin G, og cathepsin K udskrifter og sRANKL protein produktion blev induceret i IL-20-behandlede PC-3 celler

for at teste om IL-20 regulerer cathepsiner og RANKL i prostatacancer, blev PC-3-celler behandlet med IL-20 i 6 timer. En RT-qPCR gentranskriptet analyse viste opreguleret RANKL, cathepsin G og cathepsin K-ekspression i IL-20-behandlede PC-3-celler, blev hvis aktivitet neutraliseret ved 7E (Fig 6A, 6B og 6C). Desuden viste et ELISA-assay en signifikant (p 0,05) stigning i sRANKL ekspression i IL-20-behandlede PC-3-celler (Fig 6D). Derfor fremsatte vi den hypotese, at IL-20-behandlede PC-3-celler producerer cathepsin G og efterfølgende spalte RANKL at generere sRANKL, hvilket yderligere fremmer osteoklast aktivering i knogle mikromiljø. For at bekræfte at spaltningen af ​​RANKL var cathepsin G-afhængig, anvendte vi en specifik cathepsin G-inhibitor (TPCK, 1 uM) til blokering proteaseaktiviteten af ​​cathepsin G. Resultatet bekræftede vores hypotese (Fig 6E).

(AC) PC-3-celler blev behandlet med hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mlgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, eller hIL-20 plus mlgG for 6 timer, og ekspressionsniveauerne for RANKL, cathepsin G, og cathepsin K blev analyseret under anvendelse af RT-qPCR med specifikke primere. * P 0,05, ** p 0,01 versus ubehandlet kontrol, #p 0,05 versus hIL-20-gruppen. Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter, hver udført in triplo. (D) PC-3-celler blev inkuberet med hIL-20 (100, 200, eller 400 ng /ml) i 48 timer blev dyrkningsmediet opsamlet og derefter koncentrationen af ​​sRANKL blev bestemt under anvendelse af ELISA. * P 0,05 versus ubehandlede kontroller. Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter, hver udført in triplo. (E) PC-3-celler blev præinkuberet med 1 uM af cathepsin G-specifik inhibitor (TPCK) i 1 time og derefter behandlet med hIL-20 (400 ng /ml) i 72 timer. Vehikelkontrollen var 0,0175% EtOH i dyrkningsmedium. Koncentrationen af ​​sRANKL blev bestemt under anvendelse af ELISA. * P 0,05 versus ubehandlede kontroller, #p 0,05 versus hIL-20 plus EtOH køretøj kontroller. Data er middelværdierne ± SD af tre uafhængige forsøg, hver udført in triplo. RT-qPCR, real-time kvantitativ polymerase kædereaktion; sRANKL, opløselig RANKL; EtOH, ethanol.

Tumorvækst blev hæmmet i 7E-behandlede PC-3 prostatakræft implanteret

Baseret på vores

in vitro

resultater, vi yderligere undersøgte den effekter af 7E på prostata tumorvækst

in vivo

i vores mus xenograftmodel. PC-3-celler blev injiceret (sc) i SCID-mus, som derefter blev behandlet med PBS, mlgG (10 mg /kg, sc) eller 7E (10 mg /kg, sc) injektioner 3 gange om ugen, og tumorvækst var målt i 40 dage. Der var mindre vækst i 7E-behandlede gruppe end i mIgG- og PBS-behandlede kontrolgrupper (Fig 7a). Efter 40 dage blev musene aflivet, og deres tumorer blev vejet. Tumorer i 7E-behandlede gruppe vejede mindre end i mIgG- og PBS-behandlede grupper (fig 7B). Tumorvæv fra hver gruppe blev derefter isoleret at ekstrahere RNA. RT-qPCR viste, at IL-20-ekspression i 7E-behandlede gruppe var signifikant lavere end i mIgG- og PBS-behandlede kontrolgrupper (Fig 7C). Derudover blev cathepsin G-ekspression nedreguleres i 7E-behandlede gruppe (figur 7D).

(A-D) PC-3-celler blev injiceret (s.c.) i yverfedt puder af SCID-mus. En dag senere blev musene injiceret (s.c.) med PBS, 7E (10 mg /kg), eller mlgG (10 mg /kg, n = 4 pr gruppe) tre gange om ugen. (A) Tumor size blev målt ved anvendelse af en skydelære. (B) Mus blev aflivet 40 dage efter at de var blevet injiceret med PC-3-celler, og deres tumorer blev opsamlet og vejet. (C-D) Tumor vævsprøver fra hver gruppe (n = 4) blev isoleret ved slutningen af ​​eksperimentet. Ekspressionen af ​​IL-20 og cathepsin G i tumorvæv blev analyseret ved anvendelse af RT-qPCR med specifikke primere. * P 0,05, ** p 0,01 versus mlgG kontroller. Data er middelværdier ± SD. Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter med lignende resultater. (E-F) 7E behandling beskyttet mod knogletab og mindsket knogletæthed formindskelse i intratibial PC-3-injicerede osteolytiske mus. PC-3-celler (2 x 10

5/100 pi) blev langsomt injiceret i knoglemarven hulrum skinnebenets. Mus blev injiceret i.p. med PBS, 7E (10 mg /kg), eller mlgG (10 mg /kg) (n = 5 i hver gruppe) tre gange om ugen. Sunde kontroller blev ikke injiceret med kræftceller. (E) Den tibialismetafyse blev taget fra raske kontrolmus og mus med PC-3-induceret osteolyse. Repræsentative mikro-CT-scanninger er vist for hver gruppe. (F) tibial BMD blev målt, og resultaterne udtrykkes i procent i forhold til raske kontrolværdier. * P 0,05 versus mlgG kontroller. Data er vist som middelværdi ± SD. Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter med lignende resultater. BMD, knogletæthed; mikro-CT, mikro-computertomografi.

7E hæmmede tumor-induceret osteolyse i PC-3 prostatakræft implanteret

I udviklingen af ​​prostatakræft, mange patienter i sidste ende udvikle knoglemetastaser . Baseret på vores

in vitro

data, vi spekuleret på, at IL-20 kan fremme osteoklastogenese ved at regulere sRANKL og cathepsin G udtryk i prostata kræftceller. Derfor har vi spekulerede på, om at hæmme IL-20 ville reducere prostatakræft osteolyse

in vivo

. PC-3-celler blev injiceret i knoglemarven hulrum af skinneben i SCID-mus, som derefter blev injiceret (i.p.) med PBS, mlgG, eller 7E tre gange om ugen i de næste 7 uger. Micro-CT-scanninger, der anvendes til at undersøge effekten af ​​7E på prostatacancer-induceret osteolyse, viste, at PC-3 cancer-induceret osteolyse inhiberet i 7E-behandlede gruppe sammenlignet med de mIgG- og PBS-behandlede grupper (fig 7E) . BMD var signifikant lavere i mIgG- og PBS-behandlede kontrolgrupper end i raske kontrolgruppe;