PLoS ONE: maksimalgrænseværdi på prostatakræft Antigen Expression for Diagnose og lmmunotherapy

Abstrakt

Baggrund

Tumor antigen (TA) -targeted monoklonalt antistof (mAb) immunterapi kan være effektiv til behandling af en bred vifte af kræft ætiologier; Imidlertid har disse tilgange demonstreret variabel klinisk effektivitet til behandling af patienter med prostatacancer (PSA). En forhindring i øjeblikket hindrer translationel fremskridt har været den manglende evne til at kvantificere mAb dosis, der når tumoren stedet og binder sig til de målrettede TAs. Koblingen af ​​mAb til nanopartikel-baserede magnetisk resonans imaging (MRI) sonder skulle muliggøre

in vivo

måling af patient-specifikke biodistributioner; disse målinger kunne lette fremtidige udvikling af nye dosimetri paradigmer, hvor mAb dosis titreres for at optimere resultaterne for enkelte patienter.

Metoder

prostata stamcelle antigen (PSCA) er bredt udtrykt på overfladen af prostatacancer (PSA) celler. Anti-humane PSCA monoklonale antistoffer (mAb 7F5) blev bundet til Au /Fe

3 O

4 (GoldMag) nanopartikler (mAb 7F5 @ GoldMag) at tjene som PSCA-specifikke theragnostic MRI sonde tillader visualisering af mAb biodistribution

in vivo

. Først antistoffet immobilisering effektivitet GoldMag partiklerne og effektiviteten for PSCA-specifik binding blev vurderet. Dernæst PC-3 (prostatacancer med PSCA overekspression) og SMMC-7721 (hepatomaceller uden PSCA ekspression) tumorbærende mus blev injiceret med mAb 7F5 @ GoldMag til MRI. MRI probe biofordelinger blev vurderet ved stigende tidsintervaller efter infusion; terapi respons blev vurderet med målinger serielle tumor volumen

Resultater

Målrettet binding af mAb 7F5 @ GoldMag sonder til PC-3 celler blev verificeret ved hjælp af optiske billeder og MR.; selektiv binding blev ikke observeret for SMMC-7721 tumorer. Det immunterapeutiske effekt af mAb 7F5 @ GoldMag i PC-3-tumorbærende mus blev verificeret med signifikant hæmning af tumorvækst sammenlignet med ubehandlede kontroldyr.

Konklusion

Vores lovende resultater tyder gennemførligheden for at bruge mAb 7F5 @ GoldMag sonder som en ny paradigme til påvisning og immunterapeutisk behandling af PSA. Vi forventer optimistisk, at tilgange har potentiale til at blive oversat til de kliniske indstillinger

Henvisning:. Ren J, Wang F, Wei G, Yang Y, Liu Y, Wei M, et al. (2012) MRI af prostatakræft Antigen Expression for Diagnose og lmmunotherapy. PLoS ONE 7 (6): e38350. doi: 10,1371 /journal.pone.0038350

Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, Frankrig

Modtaget: Januar 15, 2012; Accepteret: 3 maj 2012; Udgivet: 27 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Ren et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC) 30.973.408, NSFC 81.000.627, og NSFC 81001015. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige kræftform blandt mænd i USA og er den anden hyppigste dødsårsag af kræft hos mænd [1]. Lokaliseret PCa kan behandles med kirurgi eller strålebehandling, men sygdommen igen i ca. 20 til 30% af patienterne. Androgen-deprivationsbehandling, den mest almindelige behandling efter tilbagefald, er effektiv, men sygdommen vinder skrider i de fleste patienter, der modtager en sådan behandling [2], [3], [4]. For mænd med metastatisk PCa, median overlevelse i seneste fase varierede 3 studier fra 12,2 til 21,7 måneder [1], [2], [3], [4]. Et kemoterapeutisk middel, docetaxel, er den eneste godkendte behandling vist sig at forlænge overlevelsen blandt mænd med denne betingelse, der giver en median overlevelse fordel på 2 til 3 måneder [5], [6]. Konventionelle anticancer behandlingsformer såsom kemoterapi og strålebehandling, er karakteriseret ved en mangel på tumor celle specificitet.

Overbevisende data viser, at tumor antigen (TA) -targeted monoklonalt antistof (mAb) -baseret immunterapi er klinisk effektiv til behandling af en bred vifte af kræft ætiologier [7], [8]. Imidlertid har TA-målrettet mAb-baseret immunterapi påvist variable klinisk effektivitet til behandling af patienter med PCa; denne form for terapi har været effektive i kun en delmængde af sygdommen udtrykker specifikt rettet TA [9], [10]. En forhindring, der i øjeblikket hindrer translationel fremskridt har været den manglende evne til at kvantificere patient-specifikke dosis af mAbs, der binder til de målrettede TAs. Disse oplysninger er stort set ukendt i kliniske omgivelser, men ville tillade justeringer eller vedtagelse af alternative behandlingsstrategier patientspecifikke dosis når det er nødvendigt (dvs. målrette et andet antigen og /eller udnytte alternative mAbs).

I kliniske indstillinger, 18- F fluorodeoxyglukose (FDG) positronemissionstomografi (PET) giver en tidlig og præcis måde at afgøre, om kræft reagerer på behandlingen. Nogle nye molekylær imaging teknologier med PET holde lovende for PCa ledelse. Fluorestradiol (FES) måler østrogenreceptorer at spore tumorer og fluorthymidin (FLT) giver indsigt i cellulær vækst og proliferation [11], [12]. For nylig er der andre metaboliske PET-sporstoffer succes er blevet testet for prostatacancer [13], [14]. Vigtigere er det, har der været en undersøgelse, der bruges af humaniseret anti-PSCA (prostata stamcelle antigen) intakt antistof som en molekylær billeddannelse probe til PET-billeddannelse, som i øjeblikket er under udvikling til evaluering i en pilot klinisk imaging undersøgelse [13]. Dog kan PET give tilstrækkelig rumlig opløsning til påvisning af tidlige fase af PCa [15]. Fordelene ved MRI end nukleare-baserede molekylære billeddannelsesteknikker omfatter højere rumlig opløsning, overlegen blødt væv kontrast, og evnen til at integrere molekylære, anatomiske og fysiologiske billeddata, alle uden at udsætte en patient for potentielt skadelige radionuklider. Desuden MRI giver et indblik i tumor funktion og har potentiale til at bygge bro yderligere kløft mellem molekylær biologi og klinisk oversættelse.

De seneste prækliniske forskning bestræbelser på at udvikle multimodalitetsaspekterne molekylær billeddannelse metoder har potentiale for noninvasive PCa diagnosticering og imaging-styrede immunterapi [16], [17]. Flere grupper arbejder aktivt for udviklingen af ​​imaging sonder for cellulær og molekylær MRI [12], [16], [18], [19], [20]. Superparamagnetisk jernoxid (SPIO) nanopartikler kan let bindes til forskellige molekylære markører, herunder ligander, antistoffer og peptider som MRI sonder [21], [22], [23], [24]. Den statiske magnetfelt betydeligt forstyrret af disse SPIO-baserede sonder, er faseforskydningshastigheder af behandlingen spins fører til lokaliseret tab signal i MR-billeder.

Au /Fe

3O

4 nanopartikler med en shell /kernestruktur syntetiseres ved reduktion af Au

3+ med hydroxylamin i nærvær af Fe

3O

4 [25], [26]. Au /Fe

3 O

4 nanopartikler blev anvendt til denne undersøgelse med en gennemsnitlig størrelse 50 nm (Shell /kerne, 5/45 nm) i diameter (GoldMag Biotechnology Co., Ltd, Xian). Magnetiske nanopartikler (Fe

3 O

4) har tiltrukket bred opmærksomhed på grund af deres potentielle anvendelser i MR [21], [22], [23], [24], [27]. Dannelsen af ​​guld shell på den magnetiske nanopartikel blev udført ved en iterativ reduktion fremgangsmåde under anvendelse af hydroxylamin [28], [29]. Den Fe

3 O

4 kerne giver en partikel af en lille størrelse med betydelig magnetiske moment, og en guld belægning på Fe

3 O

4 kerne kan introducere en god platform for yderligere konjugering med biomolekyler især for biosensorer fabrikation. Guldet-belagte Fe

3 O

4 nanopartikler blev rapporteret til at udvise god biokompatibilitet og affinitet via amin /thiol terminal grupper [28], [29]. Med relativ større antistof immobilisering kapacitet, Au /Fe

3 O

4 nanopartikler er en god antistof luftfartsselskab i forhold til Au nanopartikler og Fe

3 O

4 nanopartikler. På grund af iboende høj mætning magnetisering, Au /Fe

3 O

4 nanopartikler kunne svar hurtigt på ydre magnetfelt med mindre tidsforbrug under separationsproces. Derfor guld-coatede magnetiske nanopartikler opfylder de grundlæggende krav som immunologi luftfartsselskab. Disse Au /Fe

3 O

4 nanopartikler kræver kun et enkelt trin for antistof immobilisering og give relativt store og stabile antistof bindende kapacitet [20], [26], [30], [31], [32]. Antistof-konjugeret Au /Fe

3 O

4 nanopartikler kan potentielt tjene som en følsom theragnostic MRI sonde tillader

in vivo

visualisering af mAb biodistribution og målrettet levering til tumorer. Disse teknikker kan i sidste ende give klinikere at optimere individuel dosis for forbedrede resultater under immunterapi og /eller give mulighed for hurtig, rettidig vedtagelse af alternative behandlingsstrategier når det er nødvendigt.

prostata stamcelle antigen (PSCA) er en glycosyl phosphoinositol forankret celleoverfladeprotein, der hører til Thy-1 /Ly-6 klasse af overfladeantigener. PSCA er en ideel kandidat til udvikling af reagenser til påvisning eller immunterapi af PCa, fordi det har øget udtryk specificitet for PCa og har en celle overflade sted [33], [34], [35], [36]. mAb 7F5 øjeblikket anbefales til påvisning af PSCA af human oprindelse under Western blotting, immunfluorescens og flowcytometri procedurer [36], [37].

I denne undersøgelse mAb 7F5 blev konjugeret til Au /Fe

3 O

4 nanopartikler til at producere nye MRI theragnostic sonde (7F5 @ Au /Fe3O4) til PCA. Formålet med undersøgelsen var at undersøge effekten af ​​denne theragnostic MRI sonde specifikt rettet PSCA på overfladen af ​​humane prostata kræftceller (PC-3 celler) til påvisning og immunterapi i en mus xenograft model.

Materialer og Metoder

cellelinjer og Animal Model

Denne undersøgelse blev foretaget med godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg. Alle dyr blev opstaldet og håndteres i henhold til Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer og alt animalsk arbejde blev godkendt af den relevante udvalg (IACUC 0000000 og 0000000A-1). Protokollen blev godkendt af den lokale etiske komité (etiske udvalg, fjerde Military Medical University 127/2008), og alle dyr fik human måde i overensstemmelse med “The Principles of Laboratory Animal Care” formuleret af den nationale Selskab for Medicinsk Forskning og “Guide for pleje og anvendelse af forsøgsdyr “udgivet af National Institutes of Health (NIH publikation nr 86-23, revideret 1996).

Fire til seks uger gamle nøgne mus (mandlige Bab /c mus , vejer mellem 25 og 30 g) blev anvendt til disse undersøgelser. En human prostatacarcinom-cellelinie; PC-3 blev initieret fra en knogle metastase af en grad IV prostata-adenocarcinom [33], [34], [35], [36]. Cellerne blev opnået kommercielt fra American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD) og dyrket som et monolag i Eagles minimale essentielle medium (Invitrogen Corp., Grand Island, New York) suppleret med 15% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C under en blanding af 95% luft og 5% CO

2. Til oprettelse af PC-3 tumor-bærende model blev mus inokuleret med 2 x 10

6 celler /5 ml PBS i højre flanke. En anden tumor-bærende mus (SMMC-7721 tumorer uden PSCA udtryk) blev oprettet for at tjene som kontrolgruppe. SMMC-7721, en human hepatoma carcinom (HCC) cellelinie, blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Invitrogen Corp., Grand Island, New York) suppleret med 10% FBS ved 37 ° C under en blanding af 95% luft og 5% CO

2 [38].

Konstruktion og vurdering af mAb 7F5 @ Au /Fe3O4 Theragnostic MRI Probe

MR theragnostic sonder blev bygget ved hjælp af enten PCa specifik mAb 7F5 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Californien) eller et ikke-specifikt antistof, muse-anti-humant IgG (Wuhan Boster Biology Co. Wuhan) for at tjene som kontrol probe. Begge 7F5 @ Au /Fe3O4 og IgG @ Au /Fe3O4 sonder blev konstrueret som tidligere beskrevet [20], [26], [30], [31], [32]. Kort beskrevet 200 pi (1 mg /ml) af Au /Fe

3O

4 nanopartikler blev anbragt i en pipette rør. Dette rør blev derefter anbragt i et magnetisk separator i 2 min. 100 ug antistofprotein (enten mAb 7F5 eller IgG) blev opløst i 400 pi koblingspuffer; det separerede Au /Fe

3O

4 nanopartikler blev derefter tilsat til 350 pi af antistofopløsningen. Den resterende antistofopløsning (50 pi) blev anvendt til kobling tests effektivitet. Antistofopløsningen med Au /Fe

3O

4 nanopartikler blev anbragt i en konstant temperatur (37 ° C) ryster i 20 minutter ved 180 rpm, flyttes til et centrifugerør. Dette rør blev anbragt i et magnetisk separator for at fjerne supernatanten af ​​immobiliseret antistof-Au /Fe

3O

4 nanopartikler. 50 pi af denne supernatant blev anvendt til kobling af tests effektivitet. Bindingskapacitet Au /Fe

3O

4 overflade blev bestemt ved anvendelse af et UV-VIS-spektrofotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts) og koblingseffektivitet (procent af protein optagelse) beregnet: × 100%, med OD ( præ) og OD (post) de absorbansmålinger ved 280 nm for de 50 pi før og efter kobling antistofopløsninger hhv. Specifik binding er tidligere evalueret beskrevet [20], [26], [30], [31], [32]. Kort fortalt, separat, 5 ug /ml 7F5 @ Au /Fe3O4 eller IgG @ Au /Fe3O4 blev inkuberet med 5 x 10

5 PC-3-celler og SMMC-7721 celler i 30 minutter i fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS ) puffer. Cellerne blev vasket to gange med PBS, farvet med fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugeret ged anti-mus sekundært antistof via inkubation i 1,5 timer (stuetemperatur). Prøver blev vasket to gange med PBS til evaluering af specifik binding ved anvendelse af flowcytometri assay. Til optisk mikroskopi-analyse, PC-3 og SMMC-7721 celler klæbet til dækglassene. Separat 200 ug /ml 7F5 @ Au /Fe3O4 eller IgG @ Au /Fe3O4 blev derefter inkuberet med PC-3-celler og SMMC-7721 celler natten over ved 37 ° C. Cellerne blev vasket tre gange med PBS. Cellerne blev farvet med Cy3 konjugeret gede-anti-muse-sekundært antistof via inkubation i 1,5 timer ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter fikseret i 4% formalin i 30 minutter og nuklear kontrastfarvning udførtes med 4, 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI, Sigma, St. Louis, MO) farvning i en 1,5 ug /ml opløsning (5 min /RT). Endelig blev dækglas monteret og derefter visualiseret med laser scanning konfokal mikroskopi (LSCM, Olympus Optical Co. Ltd., Tokyo, Japan).

Toksicitet af 7F5 @ Au /Fe3O4 MRI Probe i Kulturcenter PC-3 Cells

PC-3-celler med 93% -95% levedygtighed (trypanblå-farvning) blev podet i plader med 96 brønde (4000 celler /brønd) med 4 ml dyrkningsmedium. Den følgende dag 20 pi mAb 7F5 eller 20 pi mAb 7F5 @ GoldMag sandsynlighed sattes til PC-3 cellesuspensioner. I begge tilfælde er den endelige koncentration af mAb 7F5 var de samme (0,2, 2, 4, 8 og 16 ug /ml, hvert n = 6). Cellerne blev behandlet med forskellige mAb 7F5 koncentrationer (fra mAb 7F5 opløsning eller mAb 7F5 @ GoldMag) i 96-brønds plader ved cellekultur inkubator i 24 timer. Toksiciteten af ​​tilsvarende mængder af GoldMag partikler sammenlignet med mAb 7F5 @ GoldMag blev evalueret som godt. Slutkoncentrationen af ​​GoldMag partikel var de samme (2, 4, 8, 16, og 32 ug /ml, hvert n = 6). Den cellelevedygtighed (antallet af levende celler) blev målt ved trypan blue-farvning efter behandling 24 timer. Cellen hæmning blev beregnet ved hjælp af formlen: celle hæmning rate = (1- Npost /NprE) × 100%; hvor Npost er antallet af levende celler og NprE er antallet af cellerne i brøndene pre-behandlet.

Toksicitet af 7F5 @ Au /Fe3O4 MRI Probe i mus

Six-uge- gamle nøgne mus (mandlige Bb /c-mus, der vejer mellem 30 og 35 g, n = 35) blev anvendt til toksicitetstest. Alle grupper modtog en enkelt dosis ved intravenøs injektion. Tre grupper af mus (hver gruppe n = 5) modtog 7F5 @ Au /Fe

3 O

4; tre grupper af mus (hver gruppe n = 5) modtog IgG @ Au /Fe3O4 på et doser på 100, 200 og 300 pi henholdsvis (normaliseret dosis 1 mg Au /Fe

3 O

4 med 50 ug antistof i hver ml i følgende forsøg). Supplerende Kontrolgruppen modtog saltvandsinjektioner (300 pi, n = 5). Toksiciteten af ​​7F5 @ Au /Fe3O4 eller IgG @ Au /Fe3O4 prober blev vurderet med flere indekser. For akut toksicitet, blev dyrene observeret for begivenheder såsom vitale tegn, mentale, kost og aktivitetsniveau efter administration af sonden i 96 timer. Systemisk toksicitet blev vurderet ved anvendelse ændringerne i animalske legemsvægt. Vægten og fysiske status for alle musene blev overvåget i en periode på 30 dage. Dyrene blev vejet på dagen for sonden injektion og hver 5 dage derefter indtil 30 dage efter injektion.

Magnetic Resonance Imaging

Disse undersøgelser blev udført ved hjælp af en klinisk 3.0T hele kroppen MR -system (Siemens Magnetom Trio, Erlangen, Tyskland). Systemet var i stand til at fungere ved en maksimal slew rate på 200 mT /m /ms og en maksimal gradient styrke på 40 mT /m. Integreret system krop spoler blev brugt til RF excitation og en otte-kanals klinisk hoved spole blev brugt til signalmodtagelse.

In vitro MR-scanning af 7F5 @ Au /Fe3O4 Målrettet Celler

PC-3 celler og SMMC-7721-celler blev dyrket med 7F5 @ Au /Fe3O4 og IgG @ Au /Fe3O4 separat i 12 timer. Koncentrationerne af 7F5 @ Au /Fe3O4 og IgG @ Au /Fe3O4 var 1 mg Au /Fe

3 O

4 pr 50 ug antistof for hver 1 ml dyrkningsmedium med 0,5 millioner celler. Efter 12 timer blev høstede celler vasket 3 gange med PBS. Celleprøver blev blandet med 1,5 ml 1% agarose i små centrifugerør indeholdende I) PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4; II) PC-3 + IgG @ Au /Fe3O4; III) SMMC-7721 + 7F5 @ Au /Fe

3 O

4; eller IV) SMMC-7721 + IgG @ Au /Fe3O4 med hver prøve indeholdende ca. 5 x 10

5 mærkede celler (hver gruppe, n = 8). Hurtig spin-ekko T1-vægtet (T1W) og T2-vægtede (T2w) MRI-målinger blev udført ved anvendelse af følgende parametre: gentagelse tid (TR) /ekkotid (TE) = 500/25 ms (T1W) og 4000/90 ms (T2w), synsfelt (FOV) = 156 × 156 mm

2; skivetykkelse = 2 mm; matrix size = 192 × 192.

In vivo MR-scanning af 7F5 @ Au /Fe3O4 Målrettet Tumorer

PC-3 og SMMC-7721 tumor-bærende mus blev injiceret med enten 200 pi (1 mg Au /Fe

3O

4 med 50 ug antistof i hver ml) 7F5 @ Au /Fe3O4 via halevenen (PC-3 tumorbærende mus, n = 8; SMMC-7721 tumorbærende mus, n = 8) eller 200 pi IgG @ Au /Fe3O4 (hver, n = 8). Under MRI undersøgelser blev mus bedøvet med ketamin (80 mg /kg) via intraperitoneal injektion (IP). MRI undersøgelser blev udført før og 6, 12 og 24 timer efter injektion. Efter lokalisering spejder scanninger blev FSE T1W og T2w målinger udført (T1W: TR /TE = 500/25 ms; T2w: TR /TE = 4000/90 ms, skivetykkelse = 3 mm, FOV = 56,25 × 100 mm

2; skivetykkelse /plade tykkelse = 2 /12,8 mm; matrix size = 72 × 128). Efter MRI blev mus aflivet via CO

2.

Vurdering af 7F5 @ Au /Fe3O4 Probe biofordeling

tumorvæv blev høstet fra seks mus efter 7F5 @ Au /Fe3O4 sonde infusion ( 3 fra hver tumor-type) til histologisk analyse. Tumorvæv blev frosset i OCT medium og sektioneret ved 5 um intervaller. For Prussian blånelse farvning blev disse afsnit inkuberet i en 01:01 opløsning af 10% vandig opløsning af kaliumferrocyanid og 20% ​​saltsyre i 30 min.

yderligere 24 mus blev anvendt til kvantitativ analyse af 7F5 @ Au /Fe3O4 og IgG @ Au /Fe3O4 probe distributioner (4 grupper, 6 mus /gruppe, der har PC-3 eller SMMC-7721 tumorer og modtage enten 7F5 @ Au /Fe3O4 og IgG @ Au /Fe3O4 probe infusioner). Lever, milt og tumorprøver blev opsamlet fra hvert dyr ved 24 timer efter injektion. Disse væv blev fremstillet til induktivt koblet plasma atomemissionsspektroskopi med en CCD-detektor. (ICP-AES, Varian, Palo Alto, CA) ved fordøjelse af cellerne med 25% chlorsyre og derefter opvarmning af opløsningen, indtil en fast remanens dannet. De carbonholdige materialer blev fjernet og det faste stof opløst i 2% HNO

3 (salpetersyre). Den spektrometer afsløring bølgelængde var sat til 238 nm for jern og kalibreret med tre forskellige standard prøver (Fe valgt som spor metal element for ICP-AES vurdering af sonde fordeling, da Fe er princippet komponent af Au /Fe

3 O

4 nanopartikler).

Anti-tumor Effekt af Theragnostic Au /Fe

3 O

4 MR Probe

15 dage efter tumor celle implantation, 200 ul af 7F5 @ Au /Fe3O4 probe (PC-3 tumorbærende mus, n = 15; SMMC-7721 tumorbærende mus, n = 15) eller 200 pi af kontrol IgG @ Au /Fe3O4 probe (PC-3 tumorbærende mus, n = 15; SMMC-7721 tumorbærende mus, n = 15) blev injiceret via halevenen på dag 0, 4 og 8. vitale tegn, mental tilstand, blev kost og aktivitetsniveau for hvert dyr observeres dagligt Tumorstørrelse blev målt i tre dimensioner (længde, bredde og højde) med en passer, og tumorvolumen blev beregnet under anvendelse af tumorvolumen formlen = 4 /3π × (længde /2) x (bredde /2) x (højde /2) [39] . Tumorvolumenet blev målt ved forskellige tidspunkter efter indgivelse af proben (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 og 65 dage efter tumorcelleimplantation, probe infusion på dag 15). Alle mus blev aflivet på dag 65.

Billedanalyse og statistiske metoder

Billede blev udført ved hjælp af ImageJ (version 1.34s, National Institutes of Health, MD, USA). Region interesse (ROI), er opstillet omfattende tværsnit af respektive hætteglas eller musetumorer (ROI inkluderet omkring 30 voxels for hver fantom hætteglas, 30 voxels for hver

in vitro

celleprøve rør eller 40 voxels for hver tumor ) til at måle gennemsnitlig T2w signal intensitet (S

middelværdi). Separat ROI blev trukket ydersiden af ​​røret eller inden for et område tomrum af væv (trukket ved konsekvente positioner mellem gentagne målinger) til at estimere de relative støjniveauer baseret på standardafvigelsen for baggrundssignalet (NSD). Disse beregninger blev anvendt til at estimere den relative signal-til-støj-forhold (SNR) = S

betyder /NSD for hver måling. For tumorbærende mus, blev disse målinger gentaget for hver MRI-scanning efter injektion; disse målinger blev også gentaget for hver

in vitro

Au /Fe

3 O

4 celleprøve hætteglas.

Alle statistiske beregninger blev udført ved hjælp af SPSS softwarepakke (SPSS, Chicago , IL, USA). Til undersøgelser systemiske toksicitet, for at tage højde for variabiliteten i baseline kropsvægt blev tidsforløbet af kropsvægt målinger for hvert dyr rapporteres som en procentdel af den oprindelige baseline legemsvægt. Envejs ANOVA blev anvendt til at sammenligne disse justerede kropsvægt indeks tværs behandlingsgrupper ved hvert tidsinterval efter infusion (Tukey post-hoc korrektion, p 0,05 betragtet som statistisk signifikant). Dernæst blev envejs ANOVA bruges til at sammenligne a) T2w SNR målinger fra

in vitro

prøve hætteglas, der indeholder forskellige cellelinjer og målretning dele og b)

in vivo

T2w SNR målinger i tumorer hos pre-infusion og tre efter infusion tidsintervaller (separate sammenligninger for PC-3 og SMMC-7221 musemodeller). Tilsvarende blev envejs ANOVA anvendt til at sammenligne organspecifikke ICP-AES målinger af probekoncentration i PC-3 og SMMC-7721 tumorbærende mus. Endelig til terapeutiske undersøgelser af effekten ved hver post-infusion observation interval, en t-test blev anvendt til at sammenligne tumor volumen målinger mellem behandlede dyr og kontroldyr. (P 0,05 betragtet som statistisk signifikant)

Resultater

Immobilisering Effektivitet og specifik binding Assessment

hastigheden af ​​antistof-immobiliserede kobling blev gradvist reduceret med stigende koncentrationer af mAb 7F5. Tilføjelse 60 ug mAb 7F5 til en 1 mg prøve af Au /Fe

3O

4 nanopartikler gav en koblingseffektivitet tæt på 83 ± 9%; således, for en 1 mg prøve, omtrent 50 ug af mAb 7F5 var overflade-koblet til Au /Fe

3O

4 nanopartikler. For at undgå bias under senere

in vitro

in vivo

sammenlignende undersøgelser, kobling effektivitet blev også bestemt for den ikke-specifikke antistof IgG. Under lignende betingelser, IgG i Au /Fe

3O

4 nanopartikel koblingseffektivitet var ca. 71 ± 5% således kræver tilsætning af 80 ug IgG-protein for at opnå en overflade-kobling af 50 ug IgG til tilsvarende 1 mg prøve af Au /Fe

3O

4 nanopartikler. Flowcytometri vist, at den positive sats for binding var 93,6 ± 8,2% for 7F5 @ Au /Fe3O4 + PC-3 celler, mens den positive sats var kun 4,2 ± 1,2% for 7F5 @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721. Den positive rate af binding var 5,7 ± 1,7% for IgG @ Au /Fe3O4 + PC-3 celler og 6,9 ± 2,1% for IgG @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721 celler. Rød fluorescens blev observeret i membranen og cytoplasma 7F5 @ Au /Fe3O4 + PC-3-celler med LSCM (øverste række i fig. 1), mens ingen rød fluorescens blev observeret i 7F5 @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721 celler (nederste række i fig. 1). På IgG @ Au /Fe3O4 gruppe, blev ingen rød fluorescens observeret for både PC-3-celler og SMMC-7721 cellelinier

Red fluorescens (7F5 @ Au /Fe3O4rpar;. Observeret i membranen af ​​7F5 @ Au /Fe3O4 + PC-3-celler (øverste række), mens ingen rød fluorescens blev observeret i membranen af ​​7F5 @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721 celler (nederste række). cellekerner blev farvet blå farve via DAPI (midterste kolonne). 7F5 @ Au /Fe3O4 fluorescens billeder og DAPI billeder er fusioneret i længst til højre kolonne. Scale bar, 10 um.

Toksicitet af 7F5 @ GoldMag MRI Probe i Kulturcenter PC-3 Cells

toksicitet af 7F5 @ GoldMag MRI Probe in vitro blev vist i fig S1 toksiciteten af ​​mAb 7F5 eller 7F5 @ GoldMag blev demonstreret og cellen hæmning steg med stigende mAb koncentration.. der er ingen statistisk signifikans i hver koncentration af mAb 7F5 eller 7F5 @ GoldMag (p . 0,05 i hver koncentration, fig S1A). Desuden sammenlignet med 7F5 @ GoldMag gruppe, GoldMag partikel alene ikke påvirkede celleproliferation (p 0,05 i hver koncentration, fig. S1B)

toksicitet Theragnostic Au /Fe

3 O

4 Probe i mus

Akut toksicitet:. Alle mus overlevede, og ingen unormale reaktioner i vitale tegn, mental tilstand, kost , og aktivitetsniveau 96hrs efter administration. Systemisk toksicitet i fig. 2: mus i kontrolgruppen tog på i vægt støt i løbet af forsøget; henviser vægtforøgelse lidt reduceret i dyr, der modtog en infusion af 7F5 @ Au /Fe3O4 ved doser på både 100 pi og 200 pi. Ingen signifikant forskel blev observeret mellem 7F5 @ Au /Fe3O4 og saltvand grupper på ethvert tidspunkt, og ingen af ​​disse mus døde under den 30 dage lange observationsperiode efter infusion. Ingen kliniske tegn på toksicitet såsom rysten, nedsat aktivitet, eller ustabile bevægelser blev observeret. Lignende resultater blev observeret for IgG @ Au /Fe3O4 behandlede dyr ved doser på 100 pi og 200 pi (data ikke vist). Men fra den 20-dages observation interval fremefter, de dyr, der modtog en 300 pi dosis udviste signifikant lavere kropsvægt sammenlignet med disse dyr i kontrol og to grupper lavere dosis (P 0,05 for hver af disse normaliserede vægtøgning sammenligninger). En mus i denne høje dosis-gruppen døde på dag 30. Lignende resultater blev observeret for den høje dosis IgG @ Au /Fe3O4 gruppe med to af disse mus dør på dag 25 og 27, henholdsvis. Fire mus fra højdosis grupper (tre mus fra 7F5 @ Au /Fe3O4-gruppen og en fra IgG @ Au /Fe3O4 gruppe) viste kliniske tegn på toksicitet, herunder rysten, nedsat aktivitet og ustabile bevægelser ved dag 20. Disse resultater tyder øget systemisk toksicitet for dyr, som fik en dosis på enten 7F5 @ Au /Fe3O4 eller IgG @ Au /Fe3O4 sonder 300 uL.

In vitro

MRI af 7F5 @ Au /Fe3O4 Målrettede celler

In vitro

undersøgelser påvist signifikant større T2w SNR reduktioner inden PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4 celleprøver (rør I) sammenlignet med pc-3 + IgG @ Au /Fe3O4 celleprøver, SMMC-7721 + 7F5 @ Au /Fe3O4 prøver, og SMMC-7721 + IgG @ Au /Fe3O4 prøver inden rørene II, III, og IV (fig. 3A). Prøverne inden rørene II, III og IV viste ingen klart mærkbare fald SNR (sammenligninger gav ingen statistisk signifikante forskelle fra kontrol, p 0,05 for hver sammenligning); Den T2w SNR indenfor PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4 prøve celle (rør I) var signifikant lavere end T2w SNR inden prøverør II, III, og IV i fig. 3B (p 0,05 for hver sammenligning)

Tube I:. PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4 prøvecelle, rør II: PC-3 + IgG @ Au /Fe3O4 prøve; rør III: SMMC-7721 + 7F5 @ Au /Fe3O4 prøve; Tube IV: SMMC-7721 + IgG @ Au /Fe3O4 prøve. Kvantitativ T2w SNR målinger (B) for celleprøven hætteglas afbildet i (A).

In vivo

MRI af 7F5 @ Au /Fe3O4 Målrettet Tumorer

PC-3-tumorbærende mus administreret 7F5 @ Au /Fe3O4 nanopartikler udvist betydelig fald i T2w tumor signalintensitet ved 6, 12, og 24 timer efter infusion (øverste række i fig. 4). Nr klart blev observeret mærkbar tumor signal ændringer for SMMC -7721 tumorbærende mus på nogen af ​​de tre efter infusion tidspunkter (nederste række i fig. 4). Histologiske analyser (. Preussisk blå farvning i figur 4) viste heterogen aflejring af Au /Fe3O4 Au /Fe

3 O

4 nanopartikler afbildet som punktformig blå-farvede foci i PC-3 tumorvæv; dog blev disse indskud ikke observeret inden SMMC-7721 tumorvæv.

PC-3 tumor-bærende mus administreret 7F5 @ Au /Fe3O4 nanopartikler viste markante fald i T2w tumor signal intensitet 6, 12, og 24 timer efter -infusion (øverste række). Nr klart blev observeret mærkbar tumor signal ændringer for SMMC -7721 tumorbærende mus på nogen af ​​de tre efter infusion tidspunkter (nederste række). Preussiske blå farvning (PB) viste, at Au /Fe3O4 nanopartikler afbildet som punktformig blå-farvede foci i PC-3 tumorvæv; disse indskud blev ikke observeret inden SMMC-7721 tumorvæv. Scale barer, 10 mm for MRI og 50 um for preussisk blå farvning billede.

Efter 7F5 @ Au /Fe3O4 infusion, T2w SNR ændringer i PC-3 tumorer var statistisk signifikante i forhold til baseline pre -infusion tumor SNR niveauer (p 0,05 for hver sammenligning), fig. 5A. Yderligere betydelige reduktioner i tumor SNR blev observeret mellem 6 og 12 timer efter infusion tidspunkter (P 0,001); mens betyde T2w tumor SNR senere steg 24 timer efter infusion (i forhold til tidligere målinger på 12 timer efter infusion), dette fund var ikke statistisk signifikant givet stikprøvestørrelse (p = 0,145).