PLoS ONE: Hæmning af ANO1 /TMEM16A Chloride Channel ved Idebenone og dens cytotoksicitet til Cancer Cell Lines

Abstrakt

De ekspressionsniveauerne af anoctamin 1 (ANO1, TMEM16A), et calcium-aktiverede klorid kanal (CACC) er steget betydeligt i flere tumorer, og inhibering af ANO1 er kendt for at reducere celleproliferation og migration. Her udførte vi cellebaseret screening af en samling af naturlige produkter og lægemiddellignende forbindelser for at identificere inhibitorer af ANO1. Som et resultat af screening, idebenon, miconazol og plumbagin blev identificeret som hidtil ukendte ANO1 inhibitorer. Elektrofysiologiske undersøgelser viste, at idebenon, en syntetisk analog af coenzym Q10, helt blokeret ANO1 aktivitet i FRT celler, der udtrykker ANO1 uden nogen effekt på intracellulært calcium signalering og CFTR, en cAMP-reguleret klorid kanal. De CACC aktiviteter i PC-3 og CFPAC-1-celler, der udtrykker rigelige endogent ANO1 var stærkt blokeret af idebenon. Idebenon inhiberede celleproliferation og apoptose i PC-3 og CFPAC-1-celler, men ikke i A549-celler, som ikke udtrykker ANO1. Disse data antyder, at idebenon, en hidtil ukendt ANO1 inhibitor, har potentiale til anvendelse i cancerterapi

Henvisning:. Seo Y, Park J, Kim M, Lee HK, Kim J-H, Jeong J-H, et al. (2015) Hæmning af ANO1 /TMEM16A Chloride Channel ved Idebenone og dens cytotoksicitet til kræftceller. PLoS ONE 10 (7): e0133656. doi: 10,1371 /journal.pone.0133656

Redaktør: Johannes Reisert, Monell Chemical Senses Center, UNITED STATES

Modtaget: April 15, 2015; Accepteret: 29 jun 2015; Udgivet: 21 jul 2015

Copyright: © 2015 Seo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Yonsei University Global specialisering Projekt af 2014, en Grant i Sydkorea Healthcare teknologi R D Project, Ministeriet for Sundhed . Welfare anliggender, Republikken Korea (HI08C2149) og Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi [NRF-2012R1A1A1040142]

Konkurrerende interesser: Den forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Calcium-aktiverede Cl

-. kanaler (CaCCs) er i vid udstrækning udtrykt i forskellige celletyper og væv, og de er impliceret i mange fysiologiske aktiviteter såsom epitelvæske sekretion, kontraktion af glat muskulatur, og sensorisk signaltransduktion [1-3]. CaCCs blev først beskrevet over 3 årtier siden, men den molekylære identitet CaCCs er for nylig blevet identificeret [4]. I 2008 rapporterede tre uafhængige forskergrupper at anoctamin-1 (ANO1, TMEM16A) genet koder et CACC, viser calcium-aktiverede Cl

– strømme, når det blev udtrykt i oocyter og pattedyrceller [5-7]. ANO1 udtrykkes i forskellige celletyper, herunder tracheal, tarm, og glandulær epitel, glatte muskelceller, tarm pacemaker celler, sensoriske neuroner, og flere tumorer [5, 7-9].

ANO1 var også kendt som opdagede på GIST-1 (DOG1), tumor amplificeret og overudtrykt sekvens 2 (TAOS2) og cancer oral overudtrykt 2 (ORAOV2) [10, 11]. DOG1, TAOS2 og ORAOV2 er navngivet, så fordi ANO1 er stærkt overudtrykt i gastrointestinale stromale tumorer (GIST) og orale planocellulære karcinomer. ANO1 er kortlagt til det kromosomale bånd 11q13, der ofte amplificeret i en række humane carcinomer, herunder hoved-og-hals pladecellecarcinom (HNSCC), GIST, bryst- og prostatacancer. Seneste tyder ANO1 involvering i celleproliferation, cellemigration, tumorigenese og kræft progression [12, 13]. For eksempel inhibering af ANO1 ekspression i prostatacancer PC-3-celler reducerede signifikant proliferation, metastase og invasion, og blokeret tumorvækst i et xenotransplantat musemodel [14]. Farmakologisk hæmning af ANO1 af T16A

inh-A01, en selektiv ANO1 inhibitor, reduceret proliferation af interstitielle celler af Cajal (ICC) og CFPAC-1 bugspytkirtelkræftceller udtrykker endogent ANO1 [15]. I brystkræftceller, nedregulering af den ANO1 genekspression reduceret proliferation, provokeret apoptose, og hæmmede tumorvækst i en xenograft model. Desuden farmakologisk inhibering af CACC aktivitet af ANO1 reducerede cellelevedygtighed i HNSCC, esophageal pladecellecarcinom (ESCC) og brystcancerceller via hæmning af epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) og calmodulin-afhængig proteinkinase II (CaMKII) signalering [16 ].

de fleste data viser, at farmakologisk hæmning af ANO1 kanal aktivitet kan have potentiale til at give terapeutiske fordele for HNSCC, ESCC, GIST, bryst og prostata cancer patienter. Da ANO1 nylig er blevet identificeret, blev kun få forbindelser identificeret som potente ANO1 hæmmere såsom CACC

inh-A01, garvesyre, T16A

inh-A01, digallic syre, dichlorophen, benzbromaron og N – ((4 methoxy) -2-naphthyl) -5-nitroanthranilic acid (MONNA). Desuden farmakologisk egenskab og virkningsmekanismer af inhibitorer er stadig uklart, [17-21].

Til identifikation af nye ANO1 hæmmere, vi udførte en celle-baseret screening med en samling af naturlige produkter og narkotika -lignende forbindelser under anvendelse af en celle baserede high-throughput screening assay oprettet til bestemmelse af ANO1 inhibitorer i tidligere undersøgelse [19]. Vi fandt nogle narkotika-lignende forbindelser og naturlige produkter, der viser potent ANO1 hæmmende aktivitet, og undersøgte effekten af ​​hit-forbindelser på vækst hæmning af cancer cellelinjer, som udtrykker ANO1 endogent.

Materialer og Metoder

Materialer og løsninger

Idebenone, coenzym Q10, plumbagin, miconazol og andre kemikalier, medmindre andet er angivet, blev indkøbt fra Sigma. Mus ANO2 blev indkøbt fra Origene Technologies Inc. (Rockville, MD, USA, katalog nr MC205812). Forbindelsen samling anvendes til screening (Spectrum Collection, 2320 forbindelser) blev indkøbt fra MicroSource Discovery Inc. (Gaylordsville, CT). Dette bibliotek består af humane terapeutiske lægemidler eller lægemiddel-lignende forbindelser og naturlige produkter. Forbindelserne blev fortyndet med DMSO for at nå en koncentration på 2,5 mM. Dette blev anvendt som 100x koncentrerede stamopløsning, som blev behandlet på cellerne.

Cellekultur

Fisher rotte skjoldbruskkirtlen (FRT) celler blev stabilt transficeret med humant ANO1 (abc) eller human vildtype skriv CFTR separat, og begge af cellerne blev stabilt transficeret med halogenidet sensor YFP-H148Q /I152L /F46L eller YFP-H148Q som beskrevet i tidligere undersøgelse [20, 22]. FRT-celler blev stabilt transficeret med muse ANO2 (Origene Technologies Inc.) og halogenidet sensor YFP-F46L /H148Q /I152L. FRT celler dyrket i Coon`s modificeret F12-medium suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. PC3 og HT-29-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. A549-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. CFPAC-1-celler blev dyrket i Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) suppleret med 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.

cellebaseret screening

ANO1 /TMEM16A og YFP udtrykkende FRT-celler blev udpladet i 96-brønds sorte-walled mikroplader (Corning Inc., Corning, NY) ved en densitet på 20.000 celler per brønd i F12 medium suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin. Analyser blev udført ved hjælp Fluostar Omega mikropladelæser (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland) og MARS Data Analysis Software (BMG Labtech). Hver brønd i pladen med 96 brønde blev vasket 3 gange i PBS (200 pi /vask), hvorefter 100 pi PBS. Testforbindelser (1 pi) blev tilsat til hver brønd ved 25 uM slutkoncentration. Efter 10 minutter blev plader med 96 brønde overføres til en pladelæser til fluorescens-assay. Hver brønd blev analyseret individuelt for TMEM16A-medieret I

– tilstrømning ved at optage fluorescens kontinuerligt (400 ms pr punkt) i 2 s (baseline), derefter 100 pi af 140 mM I

– opløsning indeholdende 200 uM ATP blev tilføjet på 2 s og derefter YFP fluorescens blev registreret for 6 s. Initial iodid tilstrømning blev bestemt fra den oprindelige hældning af fluorescens fald, ved ikke-lineær regression, efter infusion af iodid med ATP.

Ussing Chamber undersøgelse Salg

Snapwell inserter indeholdende ANO1- eller CFTR-udtrykkende FRT celler blev monteret i Ussing kamre (Fysiologisk Instruments, San Diego, CA). Den basolaterale bad var fyldt med HCO

3

– bufferopløsning, der indeholder (i mM): 120 NaCl, 5 KCI, 1 MgCI

2, 1 CaClz

2, 10 D-glucose, 2,5 HEPES, og 25 NaHCO

3 (pH 7,4), og den apikale bad var fyldt med en halv-CI

– opløsning. I den halve Cl

– løsning 65 mM NaCl i den HCO

3

– bufferopløsning blev erstattet af Na-gluconat. Den basolaterale membran blev permeabiliseret med 250 ug /ml amphotericin B. Celler blev badet i en 20 min stabiliseringsperiode og beluftet med 95% O

2/5% CO

2 ved 37 ° C. ATP blev påført den apikale badopløsningen at inducere intracellulært calcium forhøjelse; idebenon, forskolin og CFTR

inh-172 blev tilsat til det apikale og basolaterale badopløsningen. Apikale membran strømme blev målt med en EVC4000 Multi-Channel V /I Clamp (Verden Precision Instruments, Sarasota, FL) og registreres ved hjælp PowerLab 4/35 (AD Instruments, Castle Hill, Australien). Data blev indsamlet og analyseret med ADInstruments erhvervelse software Labchart Pro 7-softwaren. Stikprøveforholdet var 4 Hz.

Patch-clamp

Hele-celle patch-clamp optagelser blev udført på ANO1-udtrykkende FRT celler og PC3 celler. Badet opløsning indeholdt (i mM): 140 NMDG-CI, 1 CaClz

2, 1 MgCl

2, 10 glucose og 10 HEPES (pH 7,4). Pipetten opløsningen indeholdt (i mM): 130 CsCI, 0,5 EGTA, 1 MgCl

2, 1 Tris-ATP og 10 HEPES (pH 7,2). Pipetter blev trukket fra borosilikatglas og havde modstande på 3-5 MQ efter brand polering. Efter oprettelse af hel-celle konfiguration, blev ANO1 aktiveret af ATP (100 uM). Whole-celle strømme blev udløst ved at anvende hyperpolarisering og depolariserende spændingspulser fra en bedrift potentiale 0 mV til potentialer mellem -80 mV og 80 mV i trin på 20 mV. Optagelser blev foretaget ved stuetemperatur ved hjælp af en Axopatch-200B (Axon Instruments, Union City, CA). Strømme blev digitaliseret og analyseret ved anvendelse af en Digidata 1440A konverter (Axon Instruments), og pCLAMP 10,2 software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Strømme blev lavpas filtreret ved 1 kHz og samples ved 5 kHz.

Immunblot

Celleekstrakter og immunoblotting blev fremstillet som tidligere [23] beskrevne. FRT-ANO1, PC3, blev CFPAC-1 og A549-celler lyseret med cellelyse-buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,25% natriumdeoxycholat, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM na

3VO

4, og proteasehæmmer blanding). Hele cellelysater blev centrifugeret ved 15.000 g i 10 minutter ved 4 ° C for at fjerne cellerester, og lige store mængder (80 ug protein /bane) af supernatant protein blev separeret ved 4-12% Tris-glycin færdigstøbte gel (KOMA BIOTECH, Seoul, Korea) og derefter overført på PVDF membran (Millipore, Billerica, MA). Membranen blev blokeret med 5% fedtfri skummetmælk i Tris-saltvand (50 mM Tris-CI, pH 7,5, 150 mM NaCl), herunder 0,1% Tween 20 i 1 time ved stuetemperatur. Denne membran blev derefter inkuberet natten over med primært ANO1 antistof (en generøs gave fra Young Duk Yang, CHA University). Efter vask med 0,1% Tween 20 i Tris-pufret saltvand (TBST), blottet blev yderligere inkuberet i 45 minutter ved stuetemperatur med et anti-kanin sekundært antistof (Cell Signaling). Membranen blev derefter vasket tre gange med TBST i 5 minutter og derefter visualiseret ved anvendelse af ECL Plus western blotting påvisning systemet (GE Healthcare Amersham, Piscataway, NJ).

intracellulært calcium måling

FRT og HT-29 celler blev dyrket i 96-brønds sorte-walled mikroplader og fyldt med Fluo-4 NW pr fabrikantens protokol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kort fortalt blev cellerne inkuberet med 100 pi assaypuffer (1X Hanks balancerede saltopløsning med 2,5 mM probenecid og 20 mM HEPES), herunder Fluo-4 NW. Efter 1 times inkubation blev 96-brønds pladerne overført til en pladelæser til fluorescens-assay. Fluo-4 fluorescens blev målt med et Fluostar Omega mikropladelæser (BMG Labtech) udstyret med sprøjtepumper og tilpassede fluo-4 excitation /emission filtre (485/538 nm). Intracellulært calcium var stigning ved anvendelse af 100 pM ATP.

celleproliferation assays Salg

PC3, CFPAC-1 og A549-celler blev udpladet på 96-brønds mikroplader. Efter 24 timers inkubation blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af idebenon (3, 10, 30 uM), coenzym Q10 (100 uM) og T16A

inh-A01 (10 uM), og derefter blev de inkuberet i 2 dage. En tilsvarende mængde DMSO sattes til alle kontrol. Dyrkningsmediet, og forbindelserne blev ændret hver 12 h. For at vurdere celleproliferation, efter 48 timers inkubation med forbindelserne, BrdU (slutkoncentration: 10 pM) blev tilsat, og cellerne inkuberes igen i yderligere 2 timer. BrdU inkorporering blev bestemt ved Cell Proliferation ELISA, BrdU (kolorimetrisk) kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). For MTS assay efter 48 timers inkubation blev cellerne inkuberes igen med MTS i 1 time. Det opløselige produceret formazan ved cellulær reduktion af MTS blev kvantificeret ved måling af absorbansen ved 490 nm med Infinite M200 (Tecan, Grödig, Østrig) mikropladelæser. MTS assay blev udført ved hjælp af CellTiter 96 vandig One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI, USA).

sårheling assay

Cell mobilitet blev vurderet ved hjælp af en ridse sår assay. PC3-celler blev dyrket i en 96-brønds plade, indtil det var sammenflydende. Cellelaget blev såret ved anvendelse af en 96-Well WoundMaker (Essen BioScience, Michigan, USA) og vasket to gange med frisk serumfrit medium. Cellerne blev inkuberet med serumfrit medium, og billeder af sårene blev automatisk taget hver 2 timer i 48 timer ved hjælp af IncuCyte zoom (Essen BioScience). Billederne blev analyseret af IncuCyte softwarepakke (Essen BioScience).

TUNEL analyser

PC3 blev CFPAC-1 og A549 celler udsået på 96-godt sort-walled mikroplader. Efter 24 timers inkubation blev celler behandlet med idebenon (30 uM) og derefter inkuberet i 2 dage. Cellerne blev fikseret og farvet med TUNEL (terminal deoxynukleotidtransferase-medieret dUTP nick-endemærkning, grøn) ved hjælp af ApopTag Fluorescein Direkte in situ Apoptosis Detection Kit (Millipore, Billerica, MA, USA), og derefter nucleus blev farvet med DAPI ( 4,6-diamidino-2-phenylindol, blå).

Statistisk analyse

resultaterne af flere forsøg er vist som middel ± SE Statistisk analyse blev udført med t-test eller ved variansanalyse efter behov. En værdi på

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Identifikation af ANO1 /TMEM16A hæmmere

En celle-baserede screening af en samling af naturlige produkter og narkotika-lignende forbindelser blev gjort for identifikationen af ​​ANO1 inhibitorer. ANO1 chlorid kanal aktivitet blev målt ved hjælp af Fischer rotte skjoldbruskkirtlen (FRT) celler stabilt udtrykker human ANO1 og genetisk kodet iodid-sensing fluorescerende protein, YFP-F46L /H148Q /I152L. Som vist i fig 1A, til screening for at identificere ANO1 inhibitorer, FRT-celler blev præinkuberet med testforbindelser i PBS før tilsætning af et iodid og ATP, en agonist for P2 purinergisk receptor, der forårsager en stigning i intracellulær calciumkoncentration, opløsning. I nærvær af ANO1 inhibitor, vil YFP fluorescens quenching af iodid indtagelse gennem ANO1 inhiberes.

(A) Princippet om cellebaserede, fluorescens højkapacitetsscreening assay. (B) Kemiske strukturer af ANO1 inhibitorer. (C) YFP fluorescens målt i enkelte brønde i plader med 96 brønde, der viser inhibitorisk virkning af idebenon, miconazol og plumbagin på ANO1 kanalaktivitet. Angivne koncentrationer af idebenon, miconazol og plumbagin blev sat 20min før ANO1 aktivering med 100 uM ATP

Screening af 2320 forbindelser gav 24 forbindelser, der blokerede iodid tilstrømning af 70% ved 25 uM. Vi fandt tre nye ANO hæmmere, idebenon, plumbagin og miconazol, fra de primære hit forbindelser. Idebenone, plumbagin og miconazol hæmmede markant ANO1 klorid kanal aktivitet på en dosisafhængig måde og fuldt hæmmede ANO1 ved 30 uM (Fig 1C).

Karakterisering idebenon

Idebenone blev yderligere undersøgt, fordi idebenon , en syntetisk analog af coenzym Q10 (CoQ10), viser potent og selektiv inhibering af ANO1, og er almindeligt anvendt som en kraftig antioxidant. Apikale membranstrømme måling i ANO1-udtrykkende FRT-celler gav en IC

50 på 9,2 uM for idebenon og viser næsten fuldstændig inhibering af ANO1 chloridstrømme med 30 pM idebenon (Fig 2A og 2B). For at undersøge virkningen af ​​idebenon på intracellulært calcium signalering, blev HT-29 og FRT-celler fyldt med Fluo-4 NW, en fluorescerende calcium sensor. Cellerne blev forbehandlet med 30 pM idebenon og derefter ATP påført ved en koncentration på 100 pM inducerede forbigående stigning i cytosolisk calciumkoncentration. ATP-induceret cytosolisk stigning calcium blev ikke signifikant påvirket af idebenon (fig 2C). At belyse, om idebenon ændrer de andre chloridkanaler, cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) og ANO2 (TMEM16B), som deler en høj aminosyrehomologi til ANO1 målte vi apikale membran strømme i FRT celler, der udtrykker human vildtype CFTR og mus ANO2 (mANO2). CFTR-kanal aktivitet blev påvirket kun lidt af idebenon. Det hæmmede CFTR med 8,2 ± 0,2% ved 30 uM, en koncentration, der fuldstændigt inhiberer ANO1 (Fig 2D), men ikke overraskende, idebenon stærkt hæmmet 100 uM ATP-induceret aktivering af mANO2 på en dosisafhængig måde i FTR-mANO2 celler ( fig 2E). Vi målte apikale membran strømme at observere effekten af ​​CoQ10 på ANO1 kanal aktivitet i FTR-ANO1 celler, fordi idebenon er en kort kæde analog af CoQ10. Som vist i fig 2F, var 100 uM CoQ10 ikke inhiberer ATP-induceret ANO1 chloridstrømme. For at undersøge om idebenon reversibelt hæmmer ANO1 målte vi apikale membran strømninger i FTR-ANO1 celle med E

handling, en specifik aktivator af ANO1. Forbehandling af 100 uM idebenon fuldstændig hæmmet E

handling-induceret ANO1 aktivering (fig 2G). Som vist i fig 2H, forbehandling af 100 uM idebenon fuldstændig hæmmet ATP-induceret ANO1 aktivering. Men efter udvaskning, det meste af den inhiberende virkning af idebenon på ANO1 aktivering med E

handlingen blev fjernet. Idebenone således reversibelt hæmmer ANO1 uden ændringer i intracellulært calcium signalering.

(A) Apikale membran strømme blev målt i FRT-ANO1 celler. Idebenon blev tilsat 10 minutter før ANO1 aktivering med 100 uM ATP. (B) Sammenfatning af dosis-respons (gennemsnit ± S.E., n = 3-4). (C) koncentration intracellulært calcium blev målt ved anvendelse Fluo-4 i HT-29 og FRT-celler. 30 pM idebenon (IDE), miconazol (MCZ) og plumbagin (PLB) blev forbehandlet i 20 minutter og derefter 100 uM ATP blev påført. (D) Effekt af idebenon på CFTR chlorid kanal-aktivitet blev målt i FRT celler, der udtrykker human vildtype CFTR. CFTR blev aktiveret ved 20 uM forskolin og inhiberet af 10 pM CFTR

inh-172. (E) Effekt af idebenon på mus ANO2 (mANO2) blev målt i FRT-mANO2 celler. (F) Effekt af Coenzym Q10 (CoQ10) på ANO1 kanal aktivitet blev observeret i FRT-ANO1 celler. 100 uM CoQ10 blev forbehandlet i 20 min og derefter 100 uM ATP blev påført. (Højre) Sammenfatning af spidsstrøm (middelværdi ± S.E., n = 3-4). (G) Effekt af idebenon på ANO1 aktivering med E

handle i ANO1 udtrykker FRT celler. 100 uM idebenon (grå linie) blev forbehandlet for 20min og ANO1 blev aktiveret ved 10 pM E

handling. De resterende ANO1 strømme blev hæmmet af T16A

inh-A01. (Højre) Sammenfatning af spidsstrøm (middelværdi ± S.E., n = 3). (H) Idebenone reversibilitet. Efter at forsvinde på 100 uM ATP-induceret ANO1 strøm blev cellerne vasket tre gange i 5 min hver og derefter ANO1 blev aktiveret ved 10 uM E

handling. (Højre) Sammenfatning af spidsstrøm (middelværdi ± S.E., n = 3). ** P 0,01, *** P 0,001, Studerendes uparret t-test.

Whole-celle patch clamp i FRT-ANO1 og PC-3 celler

I figur 3, hel-celle patch clamp-analyse blev gjort at bestemme inhibering mekanismer idebenon. I FRT-celler udtrykker ANO1, anvendelse af 10 uM idebenon inhiberede ATP-induceret ANO1 chloridstrømme på alle spændinger, hvilket indikerer, at det har den inhibitoriske virkning gennem en spænding-uafhængig mekanisme (Fig 3A). Patch clamp målinger af hel-celle-strømme i PC-3 (human prostata-adenocarcinom afledt) celler, der udtrykker højt niveau af ANO1 viste, at idebenon ved 10 uM og 30 uM inhiberer ATP-inducerede CaCCs chloridstrømme af ~ 54% og ~ 90%, henholdsvis (fig 3B).

(a) (til venstre) Hele-celle ANO1 strøm indspillet på en bedrift potentiale ved 0 mV og pulserende til spændinger mellem ± 80 mV (i trin på 20 mV) i fravær og nærvær af 10 pM idebenon. ANO1 blev aktiveret ved 100 uM ATP. (I midten) strøm /spænding (I /V) plot af gennemsnitlig strøm på midten af ​​hver spændingsimpuls. (Højre) De søjlediagrammer opsummere aktuelle data densitet målt ved + 80 mV (gennemsnit ± S.E., n = 4). (B) (venstre) helcelle-patch clamp optagelser af PC3-celler. CACC strømme registreres i fravær og nærvær af idebenon. CACC blev stimuleret med 100 uM ATP. (I midten) strøm /spænding (I /V) plot af gennemsnitlig strøm på midten af ​​hver spændingsimpuls. (Højre) De søjlediagrammer opsummere aktuelle data densitet målt ved + 80 mV (gennemsnit ± S.E., n = 4). ** P 0,01, Students ‘uparret t-test.

ANO1 inhibitorer falde celleproliferation og migration i adenokarcinomceller Salg

Tre typer af humane adenocarcinom cellelinjer blev testet for at bestemme virkningen af ​​idebenon på den endogene CaCCs aktivitet og cellevækst og migration. Western blotting viste, at endogent ANO1 udtrykkes i høje niveauer i PC3 og CFPAC-1 (humant pancreatisk duktalt adenokarcinom afledt) celler, men ikke i A549 (human lunge adenocarcinom afledte) celler (figur 4a). YFP fluorescens quenching assay med CFPAC-1-celler, der udtrykker halogenidet sensing mutant YFP afslørede, at idebenon kraftigt blokeret ATP-induceret CACC chlorid kanal-aktivering på en dosis-afhængig måde (figur 4B). For at undersøge om de ANO1 inhibitorer påvirker cellevækst, idebenon, miconazol og plumbagin blev påført PC3-celler, der udtrykker høje niveauer af ANO1 og A549-celler ikke udtrykker ANO1. Resultaterne er vist i figur 4C, og de afslører, at idebenon signifikant inhiberede cellevækst i PC3-celler, men ikke i A549-celler. Miconazol og plumbagin viste stærke hæmning af cellevækst i både PC3 og A549 celler, men det var ikke overraskende, fordi i flere tidligere undersøgelser, blev det vist, at miconazol og plumbagin hæmmede cellevækst af forskellige humane kræftceller gennem forskellige mekanismer [24-29] . Effekten af ​​ANO1 inhibering med idebenon på cellemigrering blev bestemt ved anvendelse af en sårhelende assay PC3-celler. I assayet dækket kontrol PC3-celler 63,6 ± 2,5% (n = 5) af såret, dækket hvorimod T16A

inh-A01 (30 uM) og idebenon (10 og 30 um) behandlede celler 39,6 ± 2,5, 26,1 ± 1,8 og 13,8 ± 0,8% (n = 5) af såret ved 48 timer post-sår, (fig 4D).

(A) Immunoblot of ANO1 protein i FRT-ANO1, PC3, CFPAC-1 og A549-celler. Repræsentanter for tre sæt af studier er vist. (B) Virkning af idebenon på CaCCs blev målt i CFPAC-1-celler, der udtrykker halogenid mutant YFP. CaCCs blev aktiveret ved 100 uM ATP. (C) PC3 og A549-celler blev behandlet med idebenon (30 uM), miconazol (30 uM) og plumbagin (30 uM), og celleproliferation blev målt efter 2 dage under anvendelse af MTS-assays (middelværdi ± S.E., n = 6). (D) sårheling assay i PC3 celler. Cellerne blev behandlet med T16A

inh-A01 (30 uM) og idebenon. (Venstre side) Den sårlukning blev kvantificeret ved hver 2 timer efter sår (middel ± S.E., n = 5). (Til højre) Repræsentative billeder taget ved 0 timer og 48 timer efter sårdannelse (× 10). ** P 0.01, Studerendes uparret t-test.

For yderligere at bestemme virkningen af ​​idebenon på celleproliferation, vi observerede celledeling som reaktion på idebenon hjælp MTS assay og BrdU assay i PC3, CFPAC-1 og A549-celler (Fig 5). I denne undersøgelse blev coenzym Q10 anvendt som negativ kontrol, fordi det ikke inhiberer ANO1 /CaCCs selvom idebenon er et syntetisk analog af coenzym Q10 (Fig 2F). Cellerne blev behandlet med idebenon (3, 10 og 30 uM), coenzym Q10 (100 uM) og T16A

inh-A01 (10 uM), og celleproliferationen blev kvantitativt estimeret efter 2 dage. I PC3 og CFPAC-1-celler, idebenon inhiberede cellelevedygtighed og BrdU-inkorporering i en dosisafhængig måde, men idebenon og T16A

inh-A01did ikke påvirke cellernes levedygtighed og BrdU-inkorporering i A549-celler (fig 5A-5C). Coenzym Q10 blokerede ikke celleproliferation i alle cellelinier. Nedregulering af ANO1 inducerer apoptose i flere cancercellelinier overudtrykker ANO1 [14, 16, 30]. For at undersøge om idebenon inducerer apoptose i ANO1 udtrykkende celler blev TUNEL-farvning udført i adenocarcinom cellelinjer. PC3 blev CFPAC-1 og A549-celler inkuberet med 30 pM idebenon i 48 timer, og derefter DNA-skader blev overvåget ved anvendelse af TUNEL-assayet. TUNEL-positive celler blev påvist i PC3 og CFPAC-1-celler, men ikke i A549-celler (Fig 5D-5F).

(AC) PC3, blev CFPAC-1 og A549-celler podet i plader med 96 brønde, og efter 24 timers inkubation blev de behandlet med de angivne koncentrationer af idebenon (IDE), 100 uM coenzym Q10 (Q10) og 10 uM T16A

inh-A01 (A01) i MTS-assayet. IDE (30 uM), coenzym Q10 (100 uM) og T16A

inh-A01 (10 uM) blev påført cellerne i BrdU assay. Celleproliferation blev vurderet efter 2 dage via MTS (venstre) eller BrdU (højre) assay (middelværdi ± S.E., n = 6). (D-F) PC3, blev CFPAC-1 og A549-celler behandlet med 30 pM idebenon. Cellerne blev farvet med TUNEL (terminal deoxynukleotidtransferase-medieret dUTP nick-endemærkning, grøn) og DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol, blå). Scale søjler repræsenterer 20 um. * P 0,05, Studerendes uparret t-test.

Diskussion

ANO1, et nyligt identificeret CACC, er stærkt overudtrykt i forskellige tumor typer, herunder HNSCC, GIST, bryst- og prostatakræft. Især foreslår Nylig dokumentation stærkt ANO1 involvering i celleproliferation, cellemigration, tumorigenese og cancer progression [12, 13, 16, 31]. Adskillige studier har indikeret, at ANO1 kan anvendes som et terapeutisk mål af tumorer fordi nedregulering af ANO1 viste potentielle terapeutiske fordele på HNSCC, ESCC, GIST, bryst- og prostatacancer [14, 16, 30, 32, 33]. Takket være de seneste identifikation af ANO1, få små molekyler ANO1 inhibitorer er tilgængelige, såsom CACC

inh-A01, garvesyre, T16A

inh-A01, og MONNA [17, 19-21], men den farmakologiske ejendom og de virkningsmekanismer af inhibitorer er stadig uklart. I denne undersøgelse har vi udført en cellebaseret screening for at identificere hidtil ukendte ANO1 inhibitorer med en samling af lægemiddel lignende forbindelser og naturlige produkter. Interessant opdagede vi, at idebenon stærkt inhiberet ANO1.

Idebenone [2,3-dimethoxy-5-methyl-6- (10-hydroxydecyl) -21,4-benzoquinon] er en syntetisk kortkædet benzoquinon som et analoge ubiquinon (Coenzym Q10). Idebenon undersøges i øjeblikket til behandling af en række mitochondriske og neuromuskulære sygdomme, såsom Friedreichs ataksi (FRDA), mitokondriel encephalopati med mælkesyreacidose og slagtilfælde-lignende episode (MELAS) og Duchenne muskeldystrofi (DMD), på grund af sin evne at tjene som en elektron bærer i den mitokondriske elektrontransportkæde og dens kraftfuld antioxidant aktivitet. Gavnlige kliniske virkninger af idebenon er blevet rapporteret i de idebenon behandlede patienter med FRDA (300-2250 mg /dag; 0,5-5 år), MELAS (90-270 mg /dag; 163 dage) og DMD (450 mg /dag; 12 måneder) [34-36]. Desuden resultater af store kliniske undersøgelser viste, at idebenon var sikkert og veltolereret [37, 38].

Vi viste, at idebenon kraftigt inhiberede ANO1 aktivitet i YFP fluorescens quenching assay (Fig 1C) og elektrofysiologiske undersøgelser ( figurerne 2A og 3A). For at finde ud af, om antioxidant og elektron luftfartsselskab aktivitet af idebenon påvirker ANO1 kanal funktion, observerede vi effekten af ​​CoQ10 på ANO1 kanal aktivitet, fordi idebenon og CoQ10 deler samme substitution mønster af quinon-delen og adskiller sig kun i alkyl halen knyttet til C6 carbonatom af deres quinonring. Som vist i fig 2F, forbehandling af 100 uM CoQ10 lidt (men ikke signifikant) øgede ANO1 strømme i stedet for at inhibere ATP-induceret ANO1 strømme i ANO1 udtrykkende FRT-celler. Desuden har CoQ10 ikke blokere cellelevedygtigheden og proliferation i adskillige ANO1 udtrykkende cellelinjer (Fig 5), og idebenon påvirkede ikke CFTR og intracellulært calcium signalering (fig 2C og 2D). Sammen de ovenstående resultater antyder, at virkningsmekanismen af ​​idebenon på ANO1 inhibering kan være direkte i stedet for gennem sin antioxidant og elektron bærer evne. Der er stadig en mulighed for, at idebenon påvirke celledeling og apoptose via andre veje. Men viste idebenon potent hæmning af ANO1 og celledeling i ANO1 udtrykkende celler, og en ANO1 specifik inhibitor T16A

inh-A01 viste lignende reaktion på celleproliferation (figur 5). Dette resultat antyder, at idebenon induceret ANO1 inhibering i det mindste delvist involveret i den cytotoksiske virkning af idebenon. I figur 4D, viste vi, at stærke hæmning af celle migration til et sår område ved idebenon. Ved sårheling assay anvendte vi serumfrie celledyrkningsmedier at reducere cellevækst fordi både celleproliferation og migration påvirke hastigheden af ​​sårheling. Serum deprivation resulterede i ~ 54% vækstinhibering (data ikke vist) og den inhiberende virkning af idebenon på sårheling var stærkere end den af ​​idebenon på celleproliferation (fig 4D og 5A). Disse resultater antyder, at idebenon inhiberer cellemigration selvom vækstinhibering af idebenon kan påvirke resultatet.

I klinisk undersøgelse, patienter er blevet behandlet med idebenon op til 2.250 mg /dag.