PLoS ONE: Forbedret Påvisning af cirkulerende tumorceller i metastatisk kolorektal cancer, ved kombination af CellSearch® System og AdnaTest®

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de hyppigste årsager til kræft- er et presserende behov dødsfald og pålidelige blod-baserede prognostiske biomarkører. Opregningen og molekylær karakterisering af cirkulerende tumorceller (CTCs) har fået stigende interesse i klinisk praksis. CTC påvisning af CellSearch

® er allerede blevet korreleret til en ugunstig resultat i metastaserende CRC. Men CTC opdagelse sats i mCRC sygdom er lav sammenlignet med andre tumor enheder. Således kan anvendelsen af ​​alternative (eller supplerende) analyser bidrage til at itemize den prognostiske brug af CTCs som blod-baserede biomarkører. I denne undersøgelse blev blodprøver fra 47 FRK patienter screenes for CTCs hjælp af FDA-godkendt CellSearch

® teknologi og /eller AdnaTest

®. 38 prøver kunne behandles parallelt. Vi viser, at en kombineret analyse af CellSearch

® og AdnaTest

® fører til en forbedret detektion af CTCs i vores mCRC patient kohorte (positivitet rate CellSearch

® 33%, AdnaTest

® 30%, kombineret 50%). Mens CTCs detekteret med CellSearch

® systemet var signifikant associeret med progressionsfri overlevelse (p = 0,046), kunne en signifikant sammenhæng med hensyn til samlet overlevelse kun ses, når begge analyser blev kombineret (p = 0,013). Disse resultater kunne bidrage til at skabe bedre redskaber til at opdage CTCs som on-behandling biomarkører for klinisk rutine i fremtidige undersøgelser

Henvisning:. Gorges TM, Stein A, Quidde J, Hauch S, Röck K, Riethdorf S, et al. (2016) Forbedret Påvisning af cirkulerende tumorceller i metastatisk kolorektal cancer, ved kombination af CellSearch

® System og AdnaTest

®. PLoS ONE 11 (5): e0155126. doi: 10,1371 /journal.pone.0155126

Redaktør: Min-Hsien Wu, Chang Gung University, TAIWAN

Modtaget: November 3, 2015; Accepteret dateret 25. april 2016 Udgivet: 16 maj 2016

Copyright: © 2016 Gorges et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: TMG, SR, og KP blev støttet af byen Hamburg, Landesexzellenzinitiative Hamburg (LEXI 2012; Tumor målretning via celleoverflademolekyler væsentlige i kræft progression og formidling).. Disse forfattere blev også støttet af ERC Advanced Investigator Grant dissekere, TRANSCAN ERA-Net: Grant CTC-SCAN. TMG og KP blev også støttet af initiativet om innovative lægemidler fællesforetagende i henhold til tilskudsaftale n ° 115.749, ressourcer som er sammensat af finansielle bidrag fra Den Europæiske Unionens syvende RAMMER Programme (FP7 /2007-2013) og EFPIA selskaber «i naturalier bidrag. De finansieringskilder ydet støtte i form af løn til forfatteren TMG, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion. SH er en fuld tid ansat i AdnaGen GmbH, Langenhagen, Tyskland. Den AdnaGen GmbH ydet støtte i form af løn for forfatterens SH, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Specifikke rolle denne forfatter artikuleres i »forfatter bidrag« afsnittet

Konkurrerende interesser: SH er Site Manager Research . Udvikling af AdnaGen GmbH (Qiagen). Alle andre forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft dødsfald er normalt forårsaget af udvækst af aggressive kræftceller på nye steder i organ (metastase-dannelse), der er formidlet af de primære tumorer. Colorectal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindeligt diagnosticerede maligniteter og en af ​​de førende årsager til kræft dødsfald [1]. Omkring en fjerdedel af patienter med CRC udstille metastaser (FRK) på diagnosetidspunktet (synkron sygdom) og yderligere patienter vil udvikle metastaser i løbet af deres sygdom, hvilket resulterer i relativt høje dødelighed i forbindelse med CRC [2].

Forskellige prognostiske markører kan i dag bruges i mCRC, fx analyser af hvide blodlegemer, laktatdehydrogenase beløb, performance status, lokalisering af primær tumor og metastaser, molekylære markører (fx mutationer i BRAF-genet), eller avanceret integrativ klyngedannelse) [3-7]. Desuden har tumor vækst dynamik vist sig at tilbyde on-behandling oplysninger om den fremtidige prognose [8, 9].

Liste og molekylær karakterisering af tumorceller fanget fra en minimalt invasiv blodprøve (cirkulerende tumorceller, CTCs) anvendes i stigende grad i klinisk praksis til overvågning og opdage prognostisk relevans [10] sygdom. CTCs er let at opnå med mindre invasiv perifert blodprøver tillader en kontinuerlig “real-time overvågning” af tumor progression. Hidtil har CellSearch

® system er det eneste metode, som er blevet godkendt af USA amerikanske FDA (Food and Drug Administration) til CTC påvisning i metastatisk bryst-, tyktarms-, og prostatakræft [11-13]. Påvisning af CTCs hjælp CellSearch

® er for nylig blevet korreleret til en ugunstig resultat i mCRC [14]. Men undersøgelser foretaget i FRK patienter ved hjælp CellSearch

® viste en meget lavere udbytte af CTCs i denne tumor varetype med bryst- eller prostatacancer [11-13]. Det forventes, at “kun” 30-40% af patienter med mCRC havn 3 eller flere CTCs pr 7,5 ml blod [15]. Derfor kan brugen af ​​andre (eller supplerende) assays forbedre vores forståelse af de mekanismer i kræft biologi og itemize brugen af ​​CTCs som kræft biomarkører i mCRC. For eksempel, en betydelig uoverensstemmelse mellem CellSearch

® og AdnaTest

® i påvisning af CTCs fra FRK patienter er allerede blevet observeret [16]. Den CellSearch

® system bruger immunfarvning og definerer CTCs som celler, der udtrykker både EpCAM og pankeratins og ikke udtrykker CD45, samt at have en kerne farvet med DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol). I modsætning hertil AdnaTest

® bruger en RT-PCR-platform rettet mod tre forskellige udskrifter (

EpCAM

,

EGFR

,

CEA

) for at identificere tumorcellerne inden EpCAM-berigede cellefraktion.

En kombineret analyse af begge analyser kunne derfor forbedre følsomheden af ​​CTC påvisning ved at anvende to metodiske tilgange (immunhistokemi og RT-PCR) og fremstilling af flere CTC markører. Dette er en vigtig fordel i betragtning af den velkendte fænotypiske heterogenitet CTCs [10]. Formålet med denne undersøgelse var at analysere den kliniske relevans af CTCs ved at sammenligne og kombinere to forskellige assays for CTC påvisning i en lille gruppe af FRK patienter (n = 47). Til dette mål, den AdnaTest

® og CellSearch

® systemet blev anvendt parallelt. Vores data viser, at en kombineret analyse af begge analyser fører til øgede afsløring satser CTCs med yderligere prognostisk information. Disse resultater kunne bidrage til at etablere nye diagnostiske redskaber til brug af CTCs som on-behandling biomarkører for klinisk rutine i fremtidige studier.

Materiale og metoder

Patient serie

konsekutive patienter planlagt til palliativ kemoterapi for CRC fra ambulatorium fra Institut for Onkologi og Hematology ved University Medical center Hamburg-Eppendorf blev rekrutteret. Patientkarakteristika er opsummeret i tabel 1. Størstedelen af ​​patienterne var allerede udførligt forbehandlet, modtager 3

rd (median) linje behandling (interval: 1-8). Samlet set mere end 80% af patienterne fik fluorpyrimidiner, oxaliplatin, irinotecan og bevacizumab og ca. 40% af patienterne EGFR-antistoffer. De demografi og mønstre af metastaser var som forventet, selv om den samlede befolkning var lidt yngre end medianen metastaserende CRC befolkning, sandsynligvis relateret til universitetshospitalet baggrunden. Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med World Medical Association Helsinki-deklarationen og retningslinjerne for eksperimenter med mennesker ved advokat Læger i staten Hamburg ( “Hamburger Ärztekammer”). Den eksperimentelle protokol blev godkendt (Godkendelse nr PVN-3779) fra den etiske komité i advokatfirmaet Læger i staten Hamburg ( “Hamburger Ärztekammer”). Alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke før undersøgelsen begyndte. I alt blev blodprøver (5 ml og 7,5 ml) fra 47 patienter indsamlet i AdnaCollect

® blodopsamlingsrør (AdnaGen

®) eller CellSave

® konservering rør (Janssen Diagnostics), og behandles inden 24 h (AdnaTest

®) eller 96 h (CellSearch

®) i henhold til retningslinjerne for sælgerne.

AdnaTest

®

for berigelse og analyse af cirkulerende tumorceller (CTC) den AdnaTest ColonCancerSelect og AdnaTest ColonCancerDetect, (AdnaGen GmbH, Langenhagen) blev anvendt til fremstilling mRNA, efterfulgt af en RT-PCR for en senere multiplex PCR i overensstemmelse med producentens anvisninger [16]. Alle nødvendige oplysninger om prøve behandling kan findes på websiden https://www.adnagen.com. Kort beskrevet blev 5 ml blod udtaget til en berigelse af CTC ved anvendelse af antistof-overtrukne magnetiske partikler bestående af en blanding af antistoffer mod forskellige EpCAM epitoper De berigede celler blev efterfølgende lyseret og mRNA blev oprenset ved hjælp af oligo-dT-perler indeholdt i kit efterfulgt af revers transkription (Sensiscript, Qiagen, Hilden). Det resulterende cDNA blev behandlet i en multiplex-PCR for tumorassocierede transkripter (

epidermal vækstfaktorreceptor

(

EGFR

),

carcinoembryonisk antigen

(

CEA

) og

EpCAM

) samt

Actin

som husholdning kontrol. PCR blev udført under anvendelse af HotStarTaq Master Mix (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland). Visualisering af PCR-fragmenterne blev udført med en 2100 Bioanalyzer using den DNA1000 assayet (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland). CTCs blev positivt identificeret hvis der blev detekteret mindst ét ​​af de multiplex PCR markører.

CellSearch

®

Til isolering af CTCs hjælp CellSearch

®, CTC detektion blev udført som beskrevet andetsteds [17]. Kriterierne for en begivenhed, der skal defineres som CTC var: en runde til ovale morfologi, en synlig kerne (DAPI-positiv), og en positiv farvning mønster for en epitelial bestemt celle (Keratin-positive og CD45-negative). For EGFR bestemmelse om CTCs, den CellSearch

® Tumor Fænotype Reagent EGFR blev anvendt i den fjerde kanal i systemet [18].

Statistisk analyse

For at sammenligne resultaterne af den CellSearch

® systemet og AdnaTest

® eksperimenter, CTC tæller fra CellSearch

® data blev transformeret til positive (≥3 CTCs) eller negativ ( 3 CTCs) siden ≥3 CTCs /7,5 ml blod er blevet forbundet til dårlig klinisk resultat [13]. CTC status (positiv /negativ) og korrelation med metastaser placering blev testet med 2×2 Fishers eksakte test [19], og korrigeret for multipel testning. McNemar test med Yate korrektion for kontinuitet blev udført for at finde aftalen mellem de to metoder. Progressionsfri og samlet overlevelse (PFS og OS) anslår, for begge metoder blev beregnet ved Kaplan-Meyer kurver og sammenlignet ved log-rank test [20].

Resultater

Klinisk prøve analyse ved hjælp den AdnaTest

® og CellSearch

®

Brug af AdnaTest

®, 13 ud af 43 (30%) analyserede patienterne var positive for CTCs. CTCs blev positivt identificeret, hvis mindst en af ​​de multiplex-PCR-markører blev detekteret. CTCs fra 8 patienter udviste positive signaler for

EpCAM

. Fire ud af de patienter, derudover viste signaler for

CEA

, mens én patient var positiv for

EpCAM

,

CEA

, og

EGFR

. Fem patienter viste udelukkende signalerer til

CEA

uden udtryk signaler for enhver anden markør (Fig 1A). For CellSearch

® analyser, kun patienter med ≥3 CTCs blev klassificeret som “CTC-positive”, fordi denne cut-off var korreleret til en ugunstig resultat i mCRC [13, 21]. Fjorten ud af 42 (33%) analyserede prøver var positive for CTCs (område: 3-44 celler). EGFR-positive celler (moderat til stærk ekspression) blev fundet i seks ud af de 14 patienter (interval fra 1-4 EGFR-positive celler i CTC-positive kohorte) (Fig 1B). I denne undersøgelse kunne 38 kliniske blodprøver analyseres parallelt. Kombinere AdnaTest

® og CellSearch

® 19 ud af 38 (50%) analyserede prøver blev positiv for CTCs (Fig 1C). Inden for denne gruppe,

EGFR-service /EGFR-signaler korrelerede ikke da kun én patient var

EGFR

-positiv med AdnaTest

®, men havde EGFR-negative CTCs med CellSearch

® (patient 42). Et detaljeret resumé af CTC-analyser er anført i tabel 2. Femten prøver CTC-negative i både CTC analyser og 5 patienter var CTC-positive i begge analyser. Syv prøver var positive i CellSearch

® og negativ for AdnaTest

®, mens syv sager var udelukkende positive for AdnaTest

®. Resultaterne af begge analyser korrelerede ikke signifikant (Cohens kappa = 0,1066, p = 0,51) (Fig 1D).

(A) Opsummeret markør analyser af CTCs detekteret med AdnaTest

®. CTCs blev positivt identificeret, hvis mindst én af de multiplex PCR markører (

EpCAM

,

CEA

, eller

EGFR

) blev opdaget. (B) CTC tælling af CellSearch

® herunder EGFR beslutsomhed. (C) CTC positivitet satsen for AdnaTest

®, CellSearch

®, eller begge assay i kombination. (D) Sammenligning mellem AdnaTest

® og CellSearch

® system.

Korrelation af CTC resultater til metastatisk websted og terapi

Brug af AdnaTest

®, blev ingen korrelation fundet vedrørende CTC-positivitet og placeringen af ​​metastaser (p 0,05). Lignende resultater blev observeret ved brug af CellSearch

® (p 0,05). Kombinere begge analyser også resulterede ikke i en signifikant sammenhæng mellem metastase placering og CTC status (p 0,05). CTC status blev ikke korreleret med at have en eller flere metastaser (p 0,05) i nogen af ​​CTC påvisningsmetoder. Interessant nok blev CTC positivitet sats forbundet med en højere linje af behandlingen, median 2

nd linje i tilfælde af CTC negativitet i forhold til medianen 4

th linje i tilfælde af CTC positivitet.

Korrelation af CTC resultater til kliniske resultat

Kaplan-Meyer kurver og log-rank statistik for CTC-negative og CTC-positive tilfælde viste ingen signifikant sammenhæng med hensyn progressionsfri overlevelse (PFS), når du bruger AdnaTest

® (p = 0,43) (fig 2A). For CellSearch

® en signifikant sammenhæng mellem PFS og CTC status blev observeret (p = 0,0467) (fig 2B). En kombination af begge analyser igen viste ikke en signifikant sammenhæng til PFS, men viste en tendens (p = 0,084) (figur 2C).

Vi har også testet, om tilstedeværelsen af ​​CTCs af AdnaTest

®, CellSearch

® eller de kombinerede resultater blev forbundet med reduceret samlet overlevelse (OS) i vores mCRC patient kohorte. Brug af Kaplan-Meier-analyse en signifikant sammenhæng kunne kun ses, når begge assays blev kombineret (p = 0,013), mens de enkelte assays alene gav ingen signifikant prognostisk information (AdnaTest

®: p = 0,31, CellSearch

®: p = 0,080) (fig 3A-3C).

diskussion

Tyktarmskræft er en af ​​de vigtigste årsager til kræft dødsfald og pålidelige blod-baserede biomarkører er et presserende behov for at forbedre upfront behandling udvælgelse og modifikationer under behandlingen. Til dato den mest udbredte blod-baserede markør i CRC er CEA at få prognostisk information ved baseline og intelligent information under behandlingen [22-24]. På trods af den udbredte brug af CEA som en blod biomarkør det hverken sygdomsspecifikke, påvirket af andre faktorer, og ikke så pålidelig som andre nyere blod baserede biomarkører (f.eks CTCs) [25].

OS er den mest pålidelige endpoint i kliniske undersøgelser og påvisning af CTCs er allerede blevet vist at have en prognostisk effekt i mange tumor enheder, herunder mCRC [11, 12, 21, 26-28]. I vores kohorte, kunne vi observere højere CTC afsløring priser og bedre prognostisk information om OS når kæmning to forskellige CTC detektionssystemer-FDA-ryddet CellSearch

® teknologi og AdnaTest

®. Prognosen for PFS signifikant korreleret med CTC detektion ved brug af CellSearch

® alene (p-værdi 0,046 vs. 0,43, når du bruger AdnaTest

® og 0,084 til kombinerede analyser af begge analyser). Men PFS ved definition henviser til den dato, hvor der registreres progression og afhænger desuden af ​​radiologisk evaluering af en kliniker, hvilket gør PFS en mere upålidelige endpoint.

Væsentlige discordances mellem CellSearch

® og AdnaTest

® i påvisning af CTCs allerede offentliggjort [16, 29, 30]. Ingen af ​​disse undersøgelser korreleret incidensen af ​​CTCs til kliniske resultater. I nærværende undersøgelse, en kombination af de CellSearch

® systemet og AdnaTest

® steg opdagelse sats fra 30% til 50% (30% ved brug af AdnaTest

®, 33% ved brug af CellSearch

® (≥3 CTCs); 50%, hvis begge assays blev kombineret). CTC positivitet sats synes at være forbundet med avancerede linje i behandling (tabel 2), hvilket taler for den antagelse, at højere CTC tæller give patienterne mulighed for at erhverve resistens over for systemiske behandlinger. I betragtning af den markante heterogenitet CTCs i CRC [31], bør tilstedeværelsen af ​​flere CTCs øge chancen til havnen resistente kloner.

Selvom vi klart kunne påvise, at begge metoder i kombination forbedre positivitet sats for CTCs , 50% af patienterne var stadig negativ på trods af tilstedeværelsen af ​​åbenlyse metastaser. Udover tekniske begrænsninger analyserne (se næste afsnit) der kan være en interessant biologi bag den iagttagelse, at CTC niveauer i CRC er lavere end i brystkræft. Man kunne argumentere for, at tumor celle spredning i CRC er mindre udtalt, hvilket også ville forklare, hvorfor CRC patienter med levermetastaser kan helbredes ved kirurgi i ca. 20%, mens en sådan kur er sjældent opnået ved den samme behandling i brystkræft.

Begge analyser anvendes i vores undersøgelser er afhængige af ekspressionen af ​​epitel celleoverflademarkører og er derfor tilbøjelige til at gå glip af CTC befolkninger, der har undergået en fuldstændig epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) [32-34]. Men seneste arbejde har vist, at kræftceller med en mellemliggende fænotype er nok den mest aggressive dem i stand til at formidle og vokser på fjerne steder på grund af deres høje plasticitet [35, 36]. Den CellSearch

® systemet og AdnaTest

® er begge i stand til at opdage EMT-associerede CTCs [37, 38]. Således er de CTC analyser, der anvendes i denne undersøgelse target epitelial og mellemliggende CTCs, mens rene mesenkymale CTCs (mangler ethvert udtryk for epitelial markører) sandsynligvis tabt. Påvisningen af ​​rene mesenkyme CTCs er alligevel meget vanskeligt, fordi selv hvis etiket-fri (dvs. EpCAM-uafhængig) capture systemer anvendes (f.eks filtre) epiteliale markører, såsom keratiner anvendes normalt til påvisning af CTCs grund af manglende mesenchymal markører, som ikke udtrykkes på de omgivende blodlegemer. I denne sammenhæng plastin-3, en actin-bundling proteinet ikke nedreguleret under EMT på CRC og brystcancerceller-og ikke udtrykkes på leukocytter-kunne være et stort fremskridt [33, 34].

Cellefri nukleinsyrer (f.eks celle-fri tumor DNA eller miRNA) er også i øjeblikket drøftes at være egnet som nye blod-baserede biomarkører [39]. Ændringer i deres koncentration samt DNA ændringer var allerede vist at blive brugt til diagnostisk, behandling overvågning, intelligent eller prognostiske formål [40-43]. Imidlertid er størstedelen af ​​ctDNA afledt af apoptotiske tumorceller, mens CTC analyse har den fordel at studere levedygtige tumorceller, og som også kan forbedre vores nuværende forståelse af udbredelse af tumorceller hos cancerpatienter. Desuden hidtil ingen standardiseret assay /protokol til påvisning af cellefrie nukleinsyrer eller miRNA kunne etableres i mCRC sygdom og forskellige tilgange til opdagelsen af ​​disse biomarkører anvendes i laboratorierne over hele verden. For nylig blev en standardiseret arbejdsgang strategi foreslået til en normalisering af miRNA udtryk data som en ny udgangspunkt for standardiserede procedurer for at tillade data sammenligning på tværs af forskellige laboratorier [44]. Udviklingen af ​​standardiserede assys, der kan bruges til companion diagnostics er i fokus for den nyetablerede EU-IMI konsortium kaldet CANCER-ID (www.Cancer-id.eu).

Masser af debat pågår, om CTCs kan anvendes som flydende biopsier vejledende individualiserede behandling beslutninger [10]. Brug af AdnaTest

® og CellSearch

® vi var i stand til at opdage relevante terapeutiske mål såsom

EGFR-service /EGFR. Signaler for

EGFR-service /EGFR på CTCs korrelerede ikke i vores undersøgelse mellem AdnaTest

® og CellSearch

® (tabel 2), hvilket sandsynligvis skyldes de forskellige CTC populationer taget med vores analyser . Dette viser igen komplementariteten af ​​begge analyser.

Opsummering, vi kunne vise, at en kombination af forskellige CTC analyser øger forekomsten af ​​CTCs i en umarkeret gruppe af FRK patienter. En signifikant korrelation til OS kunne kun ses, når begge assays blev kombineret (p = 0,013). Disse resultater kunne bidrage til at etablere CTCs som on-behandling biomarkører for klinisk rutine i fremtidige studier.