PLoS ONE: Synergistisk Anti-Cancer Effekt af phenformin og oxamatet

Abstrakt

phenformin (phenethylbiguanide; et anti-diabetisk middel) plus oxamatet [lactatdehydrogenase (LDH) inhibitor] blev testet som en potentiel anti-cancer terapeutiske kombination. I

in vitro

undersøgelser, phenformin var mere potent end metformin, et andet biguanid, for nylig anerkendt at have anti-cancer effekt, til at fremme celledød i området fra 25 gange til 15 millioner gange i forskellige cancercellelinier . Den anti-cancer virkning phenformin var relateret til komplekse I inhibering i mitokondrier og efterfølgende overproduktion af reaktive oxygenarter (ROS). Tilsætning af oxamat inhiberede LDH-aktivitet og lactat-produktion af celler, som er en stor bivirkning af biguanider, og induceret hurtigere celledød ved at sænke ATP-produktion og accelerere ROS-produktion. Phenformin plus oxamat var mere effektivt end phenformin kombineret med LDH knockdown. I en syngen musemodel, phenformin med oxamat øgedes tumor apoptose, reduceret tumorstørrelse og

18F-fluordeoxyglucose (FDG) optagelse på positronemissionstomografi /computertomografi sammenlignet med kontrol. Vi konkluderer, at phenformin er mere cytotoksisk over for cancerceller end metformin. Desuden phenformin og oxamatet har synergistiske anti-cancer virkninger gennem simultane hæmning af kompleks I i mitokondrierne og LDH i cytosolen, henholdsvis

Henvisning:. Miskimins WK, Ahn HJ, Kim JY, Ryu S, Jung YS , Choi JY (2014) Synergistisk Anti-Cancer Effekt af phenformin og oxamatet. PLoS ONE 9 (1): e85576. doi: 10,1371 /journal.pone.0085576

Redaktør: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, Mexico

Modtaget: May 9, 2013; Accepteret: November 29, 2013; Udgivet: 21 Jan 2014

Copyright: © 2014 Miskimins et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev delvist understøttet af Susan G. Komen for Cure award nummer KG100497 (WKM), af National Cancer Institute of National Institutes of Health award nummer 1R01CA180033 (WKM), ved National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health award nummer 015P20GM10358 (WKM) ved Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi award nummer 2011 til 0.013.087, og af Samsung Medical center tildeling af tilskud nummer SMR1120911. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Observationer at metformin (1,1-dimethylbiguanide), den mest almindeligt ordinerede lægemiddel til type II diabetes reducerer kræftrisiko har fremmet en begejstring for metformin som en anti-cancer terapi [1], [2]. Nu kliniske forsøg i brystkræft ved hjælp af metformin alene eller i kombination med andre behandlinger er undervejs [3], [4].

phenformin, anden biguanid (1-phenethylbiguanide) blev indført på samme tid som metformin, i slutningen af ​​1950’erne som en anti-diabetisk medicin. Phenformin er næsten 50 gange så potent som metformin, men var også forbundet med en højere forekomst af laktatacidose, en stor bivirkning af biguanider. Phenformin blev trukket tilbage fra klinisk brug i mange lande i slutningen af ​​1970’erne, hvor en forening med lactacidose og flere fatale case-rapporter blev anerkendt [5]. Følgelig har den virkning, phenformin på cancer sjældent blevet undersøgt.

For at forhindre udviklingen af ​​resistente kræftceller, hurtig og fuldstændig drab af cancerceller ved kemoterapi er vigtig. Det er derfor muligt, at phenformin kan være en bedre anticancermiddel end metformin følge af dets højere potens. I en

in vivo

undersøgelse, etablerede brysttumorer behandlet med metformin viste ikke signifikant hæmning af tumorvækst, mens phenformin viste signifikant hæmning af tumorvækst [6].

De mekanismer, hvorved metformin hæmmer udviklingen af ​​kræft og tumor vækst er ikke helt forstået. Foreslåede mekanismer omfatter aktivering af AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) [7], inhibering af mTOR aktivitet [8], Akt dephosphorylering [9], afbrydelse af UPR transkription [10], og cellecyklusstop [11]. For nylig blev det afsløret, at den anti-diabetisk virkning af metformin er relateret til inhibering af komplekse I i respirationskæden af ​​mitokondrier [12], [13]. Imidlertid har komplekse jeg aldrig blevet undersøgt med hensyn til anti-cancer virkning biguanider.

Derfor i denne undersøgelse har vi rettet til første test, om phenformin har en mere potent anti-cancer virkning end metformin og i så fald undersøge anti-cancer mekanisme. Vi antager, at phenformin har en mere potent anti-cancer virkning end metformin og at dens anti-cancer mekanisme involverer hæmning af komplekse I.

Derudover vi kombineret oxamat, en lactat dehydrogenase (LDH) inhibitor, med phenformin at reducere bivirkning for mælkesyreacidose. Oxamat forhindrer omdannelse af pyruvat til lactat i cytosolen og forhindrer dermed mælkesyreacidose. Interessant lactacidose er et almindeligt fænomen i cancer mikromiljø og er relateret til cancercelleproliferation, metastase, og inhibering af immunresponset mod cancerceller [14], [15]. Nylige forsøg viste, at LDH knockdown forhindrede kræft vækst [16], [17], derfor tilsætning af oxamatet ikke blot forbedre den bivirkning af phenformin, men kan også selv hæmme væksten og metastaser af kræftceller.

Nej undersøgelser har testet phenformin i kombination med oxamat, enten

in vitro

eller i immunkompetente syngene mus. I denne undersøgelse undersøger vi, om phenformin og oxamat have en synergistisk anti-cancer effekt ved samtidig inhibering af kompleks I i mitochondrier og LDH i cytosolen gennem både

in vitro

tests og i en syngen musemodel.

Materialer og metoder

Fire grupper blev sammenlignet i denne undersøgelse: kontrolgruppe (gruppe C), phenformin gruppe (gruppe P), oxamat gruppe (gruppe O), og en kombination gruppe af phenformin og oxamat (gruppe PO). Alle målinger i

in vitro

blev udført 1 dag efter lægemiddelbehandling medmindre andet er angivet.

Kemikalier og Cell Culture

Metformin (1,1-dimethylbiguanide), phenformin ( 1-phenethylbiguanide), og natrium oxamat blev indkøbt fra Sigma Chemicals og blev fortyndet med sterilt vand til forskellige koncentrationer. PARP-inhibitor (INH2BP, 5-iod-6-amino-1,2-benzopyron) blev indkøbt fra Calbiochem og caspaseinhibitor (Q-Val-Asp-OPh) blev købt fra MP Biomedicals. Cellelinierne MCF7 (brystkræft), B16F10 (melanom), CT26 (tyktarmskræft), A549 (lungecancer), og DU145 (prostatacancer) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC). Den E6E7Ras (tonsil cancer) blev opnået fra Dr. J. Lee (Sanford Research, Cancer Biology Research Center) [18], [19]. Alle celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum og suppleret med 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en befugtet inkubator med 5% CO

2. Lægemidler blev indgivet ved en cellekonfluens på 70%.

Bestemmelse af lægemiddeldosering

CT26, en coloncancercellelinie fra BALB /c-mus, blev valgt som det primære system af undersøgelsen, fordi CT26 celler er relativt resistente over for phenformin men viste en dramatisk synergistisk virkning ved tilsætning af oxamat. Derudover blev udført vores syngene mus eksperimenter i BALB /c-mus.

MCF10A celler, en ikke-transformeret human mammae epitelcellelinje, forblev upåvirket i nærværelse af op til 1 mM phenformin plus 40 mM oxamat i 1 uge. Men højere doser celledød (data ikke vist). Derfor brugte vi 1 mM phenformin, 40 mM oxamatet, og 1 mM phenformin plus 40 mM oxamatet til yderligere forsøg.

Måling af celledød ved trypanblåteksklusion Analyser og flowcytometri

Celler var udpladet i 35 mm skåle og behandlet med eller uden stoffer. For trypan blå-udelukkelse assay blev en cellesuspension farvet med 0,02% trypanblåt. Trypanblåt positive og negative celler blev talt under anvendelse af et hæmacytometer. Til flowcytometri målinger, 7-aminoactinomycin D (7AAD; 5 pi) blev tilsat til 500 pi cellesuspension og inkuberet i 20 minutter på is. Alle flowcytometri målinger blev udført ved anvendelse af en BD Accuri C6 flowcytometer (BD Biosciences).

En dosisresponskurve, EF

50, og kombinationen (CI) blev opnået ved anvendelse CalcuSyn software (Version 2.1 , BIOSOFT).

Måling af pH og laktat

pH kulturmedier blev målt ved hjælp af et pH-meter (Accumet AB15 Basic og BioBasic pH /mV /° C måler, Fisher Scientific). Lactat i dyrkningsmedier blev målt under anvendelse af et lactat assaykit (Eton Bioscience, Inc.) og mikropladelæser (absorbans 490 nm, SpectraMax Plus

584, Molecular Devices) på en kvantitativ måde med lactat standarder. Lactatproduktion blev standardiseret pr 10

5-celler.

kompleks I Activity

Kompleks I-aktivitet blev bestemt ud fra oxidationshastigheden af ​​NADH (Fluka) pr mg protein. Cellepellets blev sonikeret i 20 sekunder på is i IME buffer (50 mM imidazol, 2 mM MgC

2, 1 mM EDTA, proteaseinhibitorer) og 80 ug celleekstrakt blev tilsat til reaktionspuffer [1 mM EDTA, 50 mM KCI , 1 mM KCN, 1,2 uM antimycin A, 10 mM Tris-HCI (pH 7,4)]. Lige før målingen, 150 pM NADH og 100 uM coenzym Q1 (Sigma), som en elektronacceptor, blev tilsat. Absorbans ved 340 nm blev målt over 2 minutter under anvendelse af et spektrofotometer ved 30 ° C. NADH oxidation ikke er blokeret af rotenon (en kompleks I-inhibitor, 2,5 uM) blev fjernet fra beregningen for at måle NADH oxidation forekommer i komplekse jeg kun.

For at validere en rolle for kompleks I hæmning af phenformin, 0,5 mM methyl succinat (Sigma) blev tilsat for at fuldføre vækstmedier med phenformin samtidig at observere om phenformin anti-cancer-celle virkninger blev tilbageført. Methyl succinat tjener som en alternativ energikilde, der omgår kompleks I i elektrontransportkæden. Celledød blev målt 24 timer efter behandling.

LDH aktivitet

LDH-aktivitet blev bestemt ved at overvåge hastigheden af ​​NADH forbrug ved tilsætning af pyruvat. Cellepellets blev resuspenderet i 0,1 M KH

2PO

4 (pH 7,2), 2 mM EDTA og 1 mM dithiothreitol (DTT), sonikeret i 300 pi assaypuffer (50 mmol /l kaliumphosphat, pH 7,4) og centrifugeret ved 10.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev sat til 50 mM kaliumphosphat (pH 7,4), 2 mM pyruvat, og 20 uM NADH. Absorbans blev målt over 10 minutter ved anvendelse af et spektrofotometer ved excitation 340 nm og 30 ° C. LDH aktivitet blev standardiseret pr 10

5 celler.

Oxygen Forbrug Rate (OCR) og ekstracellulær Forsuring Rate (ECAR)

OCR og ECAR blev målt ved hjælp af Seahorse XF24 ekstracellulære flux analysator ( Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA). Denne enhed bruger en engangs sensor patron, som er indlejret med fluorescens-baserede optiske biosensorer (ilt og protoner), der giver mulighed for samtidige ekstracellulære tidstro målinger af intakte celler, der vokser som monolag. CT26 blev podet ved 40.000 celler per brønd på XF24 V7 multibrøndsplader og blev præ-inkuberet i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO

2. Den følgende dag blev celler skyllet med assaymedier, og derefter inkuberet uden CO

2 ved 37 ° C i en time i analysepuffer (DMEM base, 4 mM glutamin, 143 mM NaCl, 25 mM glucose ved en pH på 7,4 ). Efter etablering af to baseline OCR og ECAR aflæsninger, blev undersøgt narkotika injiceres og målinger fortsatte i 70 min. Efter halvfjerds minutter blev 10 mM glucose injiceres og OCR og ECAR blev målt i yderligere 20 minutter. Forsøg blev kørt firdobbelt.

Mitochondrial reaktive oxygenarter (ROS)

mitokondrie ROS blev påvist under anvendelse rødt mitokondrie superoxid indikator (MitoSOX ™, Molecular Probes). MitoSOX ™ er et fluorogent farvestof for stærkt selektiv detektering af superoxid i mitokondrier af levende celler. Når i mitokondrierne, er MitoSOX ™ Red reagens oxideres af superoxid og udviser rød fluorescens. Celler dyrket i en 35-mm glasbund dyrkningsskålen (Mat Tak Corporation) blev inkuberet med 5 uM MitoSOX ™ og 100 nM MitoTracker Green ® (Molecular Probes) for mitokondrier farvning for 10 minutter ved 37 ° C beskyttet mod lys. Celler blev forsigtigt vasket tre gange med varm puffer og monteret i varm puffer til billeddannelse. Olympus FV1000 konfokal mikroskopi blev udført ved Ex /Em:. 510/580 nm

For at validere betydningen af ​​ROS produktion, ROS scavenger, N acetylcystein (NAC, Sigma, 1 mM) blev tilsat for at fuldføre vækst medium 6 timer før test lægemiddeladministrering. Celledød blev målt 24 timer efter behandling.

ATP-niveauer

ATP-niveauer blev bestemt ved en luciferin-luciferase-assay med en ATP bioluminscensassayet kit (Molecular Probes, Invitrogen). Assayet bygger på kravet om luciferase for ATP til at producere lys. Målinger blev opnået ved anvendelse af et luminometer (GloMax® 96 Microplate luminometeret, Promega) ved en maksimal emission på ca. 560 nm til 300 sek. ATP standarder blev kørt sideløbende med hvert forsøg til at producere en standard kurve, og beregningerne blev foretaget mod kurven for at bestemme cellulære ATP-niveauer. ATP blev udtrykt pr 10

5 celler.

DNA Damage

DNA-skader blev kvantitativt målt ved 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) i medier, kerner og mitokondrier. 8-OHdG er en meget specifik biprodukt af oxidativ beskadigelse af DNA og afspejler intracellulær oxidativ stress. Celler blev dyrket i 35 mm-skåle for 8-OHdG detektion i medier og kerner, og i 100 mm skåle for mitokondrie 8-OHdG. Nuclei og mitokondrier blev separeret ved differentiel centrifugering. DNA blev ekstraheret fra kerner og mitokondrier bruger kommercielt DNA-ekstraktion kit. DNA blev omdannet til enkeltstrenget DNA ved inkubering ved 95 ° C i 5 minutter og hurtigt afkølet på is. Det denaturerede DNA-prøve blev derefter fordøjet til nukleosider ved inkubation med 10 enheder nuclease P1 i 2 timer ved 37 ° C i 20 mM natriumacetat (pH 5,2), efterfulgt af behandling med 10 enheder alkalisk phosphatase i 1 time ved 37 ° C i 100 mM Tris (pH 7,5). Reaktionsblandingen blev centrifugeret i 5 minutter ved 6.000 g, og supernatanten blev anvendt til ELISA 8-OHdG kit (OxiSelect ™, Cell Biolabs). Den resterende procedure blev udført ifølge protokollen leveret af producenten af ​​ELISA 8-OHdG kit. DNA-skader blev standardiseret pr 10

6 celler.

LDH Knock Down

Angivelse af IdhA blev slået ned af siRNA. Målet sekvens af IdhA var CAACUGCAGGCUUCGAUUA. Thermo Scientific DharmaFECT transfektionsreagenser blev anvendt ifølge producentens. Ubehandlede celler og celler transficeret med negativ kontrol siRNA (ikke-targeting) eller test siRNA blev forberedt i tre eksemplarer. 165.000 celler blev inkuberet i 35 mm brønde i 1 dag og transficeret med 15 pi siRNA og 6,8 pi Dharmafect i 2 dage. Lægemiddelbehandling blev startet efter 24 timers transfektion. LDH knockdown blev bekræftet ved Western blot-analyse efter 2 dages transfektion (anti-IdhA antistof, 1:1000, # ab47010, Abcam®).

cancercelledød

Western blotting og konfokal mikroskopi blev udført for at detektere spaltet PARP [poly (ADP-ribose) polymerase] og apoptoseinducerende faktor (AIF). PARP er et substrat for caspaser og spaltet PARP (cPARP) er kendetegnende for caspase-afhængig apoptose. AIF er kendetegnende for PARP-afhængig celledød. Vi brugte også caspaseinhibitor og PARP-inhibitor for at teste, om disse hæmmere blokerer kræft celledød.

Western blotting.

Antistoffer mod PARP (# 9542, der anvendes ved 1:1000), og AIF ( # 4642, der anvendes ved 1:1000) blev købt fra Cell Signaling Technology. cPARP blev detekteret i helcellelysater og AIF blev påvist i kerneekstrakter. At opnå kerner til måling af AIF, blev cellerne vasket i kold PBS og suspenderet i 400 pi iskold hypotonisk buffer [10 mM HEPES /KOH (pH 7,9), 2 mM MgCl

2, 0,1 mM EDTA, 10 mM KCL , 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid) og 1% (v /v) eukaryot proteaseinhibitorcocktail] i 10 minutter på is. Cellepelleten blev forsigtigt resuspenderet i 100 pi iskold saltopløsning-puffer (50 mM HEPES /KOH (pH 7,9), 50 mM KCI, 300 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 1 % (v /v) eukaryot proteaseinhibitorcocktail) og inkuberet på is i 20 minutter. Cellesuspensionen blev hvirvlet og centrifugeret ved 15.000 g i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev taget som den nukleare lysat og underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og Western blot-analyse til måling af AIF.

Konfokal mikroskopi. Salg

Celler blev vasket i PBS og fikseret i 4 % paraformaldehyd i 15 minutter. Til påvisning af endogene proteiner ved immunofluorescens blev celler permeabiliseret i 0,25% Triton X-100 i 5 minutter og derefter vasket i PBS tre gange. Dette blev efterfulgt af blokering i 10% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 30 minutter og inkubering i primært antistof i 2 timer ved 37 ° C. Primært antistof (1:100) blev fremstillet i 3% BSA i PBS. Objektglas blev vasket tre gange i PBS og inkuberet med Alexa Fluor 594-mærket sekundært antistof (1:200, Molecular Probes) i 45 minutter. Endelig blev objektglassene vasket i PBS tre gange og monteres ved hjælp af Vectashield-medium indeholdende 4, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Vector Laboratories). Objektglas blev observeret ved anvendelse af et Olympus FV1000 konfokalt mikroskop.

Inhibitor behandling.

CT26-celler blev forbehandlet med 1 uM caspaseinhibitor (Q-Val-Asp-OPh, MP Biomedicals) eller PARP-inhibitor ( INH2BP, 5-iod-6-amino-1,2-benzopyron, Calbiochem) i 4 timer før behandling med phenformin eller phenformin plus oxamat. Procentdelen af ​​døde celler blev talt 24 timer efter behandling i gruppen P og 12 timer efter behandling i gruppen PO ved flowcytometri under anvendelse 7-AAD.

Mus Salg

Seven uger gamle BALB /c-mus (Orientbio Inc. Korea) blev anvendt. Eksperimenter blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Samsung Biomedical Research Institute og blev udført i overensstemmelse med de ankommer (Dyr i Research: Rapportering in vivo forsøg) retningslinjer [20]. Alle mus blev holdt i et patogenfrit dyr facilitet.

behandlingsregime.

BALB /c mus modtog saltvand (gruppe C, n = 24), oxamat 300 mg /kg (Gruppe O , n = 31), phenformin 17 mg /kg (Group P, n = 31), eller phenformin 17 mg /kg 300 mg /kg oxamat (gruppe PO, n = 31). Mus blev subkutant podet med 1 × 10

7 CT26-celler i 0,2 ml PBS i venstre side. Udpegede lægemidler af hver gruppe blev indgivet intraperitonealt 3 dage efter celleinjektion. Alle lægemidler blev injiceret i et totalt volumen på 0,25 ml fortyndet med sterilt vand. Dyr blev behandlet dagligt i 21 dage. Legemsvægt og tumorstørrelse blev målt 3 gange om ugen. Tumorstørrelse blev målt med eksterne skydelære (Mitutoyo, Japan). Tumorstørrelse blev estimeret ved anvendelse af en formel = (d1 × d2

2) /2, hvor d1 og d2 er den længste og den korteste diametre af tumoren henholdsvis målt i mm.

På dag 21 efter behandling blev musene bedøvet med 2,5% enfluran i O

2 og tumorer blev fjernet og skåret i halve. Halvdelen af ​​hver tumor blev hurtigt nedfrosset, og den anden halvdel fikseret i 4% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatbuffer natten over ved 4 ° C.

Apoptose assay.

tumorvæv blev snittet med en tykkelse af 10 um ved anvendelse af en kryostat, tø monteret på gelatineovertrukne objektglas og opbevaret ved -20 ° C. For at detektere apoptose blev vævssnit farvet med terminalen deoxynucleotidyltransferase-medieret dUTP nick-end mærkning (TUNEL) metode ved hjælp af Fluorescein

in situ

afsløring celledød kit (deadend ™ Fluorometrisk TUNEL System, Promega). Objektglas blev observeret under et konfokalt mikroskop LSM700 (Zeiss, Tyskland). De FITC-mærkede celler undergår apoptose blev genkendt af kerner med stærk grøn fluorescens. For kvantificering blev TUNEL positive celler tælles i tre sektioner (304 um × 304 um) på × 20.

18F-FDG lille dyr PET /CT.

PET /CT blev udført 24 dage efter CT26 injektion og 21 dage efter initiering medicinsk behandling. En dedikeret lille dyr PET /CT-scanner (Inveon Multimodality System, Siemens Healthcare, Knoxville, TN, USA) blev anvendt til musen billeddannelse. Dens iboende rumlig opløsning og aksial field-of-view var 1,4 mm og 12,5 cm hhv. Først blev musene bedøvet med isofluran. Efter CT-scanning for dæmpning korrektion (rørspænding 60 kVp, rør nuværende 400 uA) blev udført, 7,4 ± 3 MBq

18F-FDG blev injiceret via halevenen. PET emission scanning i 5 min blev udført 60 minutter efter injektionen af ​​

18F-FDG. En mus på et tidspunkt blev afbildet og holdt på en varm palle under billedbehandling procedure. Efter dataopsamling blev tværgående PET billeder rekonstrueret med en ordnet delmængde forventning maksimering 3D algoritme (4 iterationer) med en voxel størrelse på 0,776 × 0,776 × 0,796 mm. CT-billeder blev rekonstrueret ved hjælp af en filtreret tilbage projektion algoritme med en Shepp-Logan-filter.

PET, CT og smeltet PET /CT-billeder blev vist og analyseret med softwaren Inveon Research Arbejdsplads (Siemens Healthcare). Et volumen af ​​interesse (VOI), der dækker hele tumorer blev defineret på grundlag af CT-billeder. Gennemsnitlig standardiseret optagelse værdi (SUV

avg) af tumoren blev opnået ved anvendelse VOI fra CT billedet. SUV blev korrigeret for injiceret dosis af

18F-FDG, musenes kropsvægt og tumorstørrelse. SUVavg data vises som en procentdel af baseline for nemt at vurdere relative ændringer.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført i programmet IBM SPSS statistik (SPSS Inc., Chicago, USA ). Statistiske forskelle mellem midler blev bestemt ved

t-

test eller envejs ANOVA efterfulgt af Tukey HSD s test. Nominelle kategoriske data blev sammenlignet ved Pearsons chi square. Statistisk signifikans blev accepteret til p-værdier for. 0,05

Resultater

phenformin Udstillinger Højere Cancer Cell Cytotoksicitet end Metformin

De fleste tilgængelige data om virkningerne af biguanider om kræft celler, og vores egen tidligere arbejde [21] – [23], har berørt metformin. Vi har tidligere observeret metformin cytotoksicitet til MCF7-celler, men dette krævede højere doser over en længere tidsperiode [21], [22]. På grund af de høje niveauer af metformin kræves og eventuel højere potens af phenformin [24], ville vi direkte sammenligne cytotoksicitet af de to lægemidler i flere cancer cellelinjer. I E6E7Ras celler, en model af HPV + hoved og hals pladecellekræft [18], [19], EF

50 for metformin og phenformin for at fremme kræft celledød var 504 mM og 0,6 mM. EF

50 af metformin var 840 gange højere end for phenformin (Fig. 1A). Phenformin viste fremragende cytotoksicitet på forskellige andre cancercellelinjer, hvor metformin udviste ringe, om nogen, virkning under disse betingelser (fig. 1B-F). EF

50 af metformin var 15,200,000 gange, 448 gange, 67 gange, 26 gange og 25 gange højere end phenformin i B16F10 (melanom), MCF7 (brystkræft), CT26 (tyktarmskræft), A549 (lungekræft) og DU145 (prostatacancer), henholdsvis.

celler blev behandlet i 2 (A) eller antallet af levende celler (B-F) blev bestemt. (A) E6E7Ras celler, en musemodel for HPV + hoved og hals pladecellecarcinom, (B) B16F10 musemelanomceller, (C) A549 human lunge-adenocarcinom-celler, (D) MCF7 humane brystcancerceller, (E) CT26 muse colon cancerceller, og (F) DU145 humane prostatacancerceller. *:. P 0,05

phenformin og oxamatet Udstillet en synergistisk effekt på kræft cellecytotoksicitet

biguanider, f.eks metformin og phenformin, er kendte inhibitorer af kompleks I i den mitokondriske elektron transportkæden og vores tidligere undersøgelser viste, at mitokondrier er vigtige mål af metformin i brystkræftceller [22]. Hæmning af mitokondrie stofskifte fremmer glykolytisk stofskifte og laktat produktion og eksport. Vi begrundede derfor, at inhibering af omdannelsen af ​​pyruvat til lactat ville fremme indtrængen af ​​pyruvat til mitokondrie metabolisme og forbedre de cytotoksiske virkninger af phenformin. Oxamat er en kendt inhibitor af LDH [25]. I undersøgelser præsenteres her, oxamat alene viste en svag cytotoksisk virkning i området fra 0-80 mM (fig. 2A). Phenformin alene viste cytotoksiske virkninger, men styrken var forskellige mellem forskellige cancercellelinier (fig. 2B, 2C). Phenformin og oxamatet samtidig administration dog udstillet en stærk synergistisk effekt på kræft celle drab i alle testede cancer cellelinjer. Kombination (CI) blev beregnet under anvendelse af multiple drug-effect ligning af Chou-Talalay [26] i CalcuSyn programmet. CIs afspejler den type samspil mellem samtidigt administrerede lægemidler. Cl-værdier i området 0,9 og 1,1 angiver en additiv virkning, hvorimod Cl-værdier af 0,9 indikerer synergisme og Cl-værdier af 1.1 indikerer antagonisme. Kombinationen index (CI) var 0,494 i E6E7Ras, 0,310 i B16F10, 0,009 i CT26, 0,227 i A549, og 0,067 i DU145, og 0,503 i MCF7 (stærk synergisme) ved samtidig administration sammenlignet med en enkelt administration på ED

50. Længere behandling (Fig. 2B) og højere doser (Fig. 2C) medførte øget cytotoksicitet i phenformin.

(A) E6E7Ras celler blev behandlet i 2 dage med oxamatet ved de angivne koncentrationer (0-80 mM) og derefter døde celler blev talt ved flowcytometri. (B, C) De angivne cellelinier blev behandlet med varierende koncentrationer af phenformin, oxamat eller kombinationer af de to lægemidler. I (B) celler blev behandlet i 1, 2 eller 3 dage før tælling døde celler. I (C) celler blev behandlet i 24 timer før bestemmelse af antallet af døde celler. C: kontrol, P: phenformin, O: oxamatet, PO: phenformin + oxamatet. I (C) tallene under hver bar angiver koncentrationer af hvert lægemiddel i mM (fx P0.5O20 betyder P 0,5 mM + O 20 mm). * Angiver en synergistisk effekt i gruppen PO sammenlignet med de andre grupper.

Effekter af phenformin og oxamatet om Laktat Produktion og pH

Biguanider er kendt for at øge glukoseoptagelse, glykolytisk stofskifte og lactat sekretion. Oxamat, på den anden side, er en inhibitor af LDH og forventes at reducere lactat produktion af cellerne. For at undersøge, om disse forbindelser blev der berører de formodede cellulære mål, blev lactat i dyrkningsmediet målt i CT26. Da lactat transporteres fra cellen sammen med en proton blev mediet pH også målt. Phenformin øget lactat produktionen og faldt medium pH sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket indikerer forhøjede satser af glycolyse. Oxamat faldt lactat produktion og øget pH, hvilket tyder på forventede hæmning af LDH. Tilsætning af oxamat at phenformin vendes både stigningen i lactat produktionen og faldet i pH forårsaget af phenformin behandling (fig. 3A, 3B). Salg

CT26-celler blev behandlet med de angivne forbindelser i 1, 2 eller 3 (A) eller medium pH (B) blev bestemt. P: phenformin 1 mM, O: oxamat 40 mM, PO: phenformin 1 mM + oxamat 40 mM, C: ubehandlet kontrol. *: P 0,05 sammenlignet med de andre grupper. †: P 0,05 sammenlignet med den gruppe C og P.

cytotoksiske virkninger af phenformin og oxamatet er relateret til Complex I og LDH Inhibition, Henholdsvis

Som beskrevet ovenfor, den formodede mål for phenformin og oxamatet er komplekse i i mitokondrie elektron transportkæden og LDH, hhv. Ændringerne i laktat som reaktion på disse forbindelser understøtter denne konklusion. De følgende forsøg blev udformet til mere direkte definere virkningerne af forbindelserne på deres formodede targets. Først blev virkningerne af phenformin på komplekse I-aktivitet måles direkte som beskrevet i materialer og metoder. Phenformin behandling af celler stærkt inhiberet mitokondriel kompleks I-aktivitet (fig. 4A). For yderligere at underbygge dette resultat, var mitokondrie oxidativ metabolisme målt ved Seahorse XF24-3 ekstracellulære flux analysator efter behandling af CT26 celler med forbindelser. Phenformin faldt oxygenforbrugshastigheden (OCR) som forventet for en kompleks I-inhibitor. I modsætning hertil oxamat øget OCR. Dette forventes også fordi pyruvat vil blive omdirigeret til mitokondrie oxidativ metabolisme hvis LDH hæmmes. Interessant, OCR var lavest i phenformin plus oxamatet gruppe (fig. 4B). Methyl succinat kan omgå elektrontransport gennem kompleks I, fordi den donerer elektroner direkte til kompleks II i den mitokondrielle elektrontransportkæden. Tilsætning af methyl succinat at phenformin reduceret den cytotoksiske virkning af phenformin (fig. 4C), hvilket igen antyder, at komplekse jeg hæmning er et vigtigt mål for lægemidlet.

(A) CT26-celler blev behandlet med eller uden phenformin for 24 timer og derefter ekstrakter blev fremstillet for at måle kompleks i-aktivitet som beskrevet i Materialer og Metoder. Y-aksen er% af kompleks I-aktivitet, når aktiviteten af ​​komplekset I i kontrolgruppen betragtes som 100%. (B) Virkninger af de angivne forbindelser på iltforbrug af CT26-celler blev bestemt som en indikator for mitochondrial oxidative metabolisme. (C) Celler blev behandlet med eller uden phenformin i nærvær eller fravær af methyl succinat, der omgår kompleks I i elektrontransportkæden. Efter 24 timer blev antallet af levende celler i kulturerne blev bestemt. MS: methyl succinat. C: kontrol, P: phenformin 1 mM, O: oxamatet 40 mM, PO: phenformin 1 mM + oxamatet 40 Mm. *: P 0,05

De direkte effekter af phenformin og oxamatet på LDH aktivitet blev også målt.. Behandling af celler med phenformin forøget LDH-aktivitet og behandling med oxamat inhiberede LDH-aktivitet (fig. 5A). Dette er i overensstemmelse med de kendte cellulære aktiviteter af de to lægemidler. Vigtigere, oxamat også stærkt inhiberede LDH-aktivitet i phenformin behandlede celler, hvilket indikerer, at phenformin ikke er i stand til at vende de inhiberende virkninger af oxamat på enzymet.

(A) CT26-celler blev behandlet med forbindelser, som angivet nedenfor hvert bar, i 24 dage. Ekstrakter blev derefter fremstillet til bestemmelse af LDH enzymaktivitet. Y-aksen er% af LDH-aktivitet, når aktiviteten af ​​LDH for kontrolgruppen betragtes som 100%. (B) Ekstracellulær forsuringshastighed i nærvær af de angivne lægemidler blev målt under anvendelse af et Seahorse XF24 instrument som beskrevet i Materialer og Metoder.