PLoS ONE: Målretning ikke-småcellet lungekræft celler ved Dual Hæmning af insulinreceptoren og insulin-lignende vækstfaktor-1 Receptor

Abstrakt

fase III forsøg med anti-insulin-lignende vækstfaktor -1 receptor (IGF1R) antistof figitumumab i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter er blevet afbrudt på grund af manglende overlevelse. Vi undersøgte, om inhibering af stærkt homologe insulinreceptoren (IR) i tillæg til den IGF1R ville være mere effektiv end inhibering af IGF1R alene at forhindre spredning af NSCLC-celler. Signalering gennem IGF1R og IR i NSCLC cellelinier A549 og Hcc193 blev stimuleret af en kombination af IGF1, IGF2 og insulin. Det blev inhiberet af antistoffer, der blokerer ligandbinding, αIR3 (IGF1R) og IR47-9 (IR), og af de ATP-kompetitive små molekyle tyrosinkinaseinhibitorer AZ12253801 og NVPAWD742 som inhiberer både IGF1R og IR tyrosinkinaser. Virkningen af ​​inhibitorer blev bestemt ved en forankringsuafhængig proliferation assay og ved analyse af Akt phosphorylering. I Hcc193 celler reduktionen i celleproliferation og Akt phosphorylering grund anti-IGF1R antistof blev styrket ved antistof-medieret inhibering af IR henviser i A549-celler, med et relativt lavt IR: IGF1R udtryk ratio, var det ikke. I hver celle linie proliferation og Akt fosforylering blev mere effektivt hæmmet af AZ12253801 og NVPAWD742 end ved kombineret αIR3 og IR47-9. Når alene det IGF1R inhiberes, kan uhindret signalering gennem IR bidrage til fortsat NSCLC celleproliferation. Vi konkluderer, at inhibitorer med små molekyler rettet mod både IR og IGF1R mere effektivt at reducere NSCLC celledeling på en måde, uafhængigt af IR:. IGF1R udtryk ratio, hvilket giver en terapeutisk begrundelse for behandlingen af ​​denne sygdom

Henvisning: Vincent EE, ældste DJE, Curwen J, Kilgour E, Hers i, Tavare JM (2013) Målretning ikke-småcellet lungekræft celler ved Dual Hæmning af insulinreceptoren og insulin-lignende vækstfaktor-1 receptor. PLoS ONE 8 (6): e66963. doi: 10,1371 /journal.pone.0066963

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Februar 25, 2013; Accepteret: 14 maj 2013; Udgivet: 24 juni 2013

Copyright: © 2013 Vincent et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet beskrevet blev finansieret af tilskud fra Medical Research Council og AstraZeneca til JMT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Jon Curwen og Elaine Kilgour, er medarbejdere i AstraZeneca og egne aktier i AstraZeneca. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død på verdensplan med ikke-småcellet carcinom (NSCLC) tegner sig for ca. 80% af alle tilfælde. Den samlede fem år overlevelsesraten i Europa er 8% [1] og den mediane overlevelse efter diagnosen er 4-5 måneder, hvis venstre ubehandlet [2]. Standard kemoterapi i fremskreden NSCLC giver kun marginal forbedring i samlet overlevelse, men EGFR tyrosinkinasehæmmere forbedre overlevelsen hos patienter, der bærer aktiverende mutationer i EGFR-genet [3]. Andre lovende terapeutiske mål i NSCLC omfatter anaplastisk lymfom kinase (ALK), histondeacetylering (HDAC) og IGF (insulin-lignende vækstfaktor) [4].

IGF-systemet spiller en afgørende rolle i reguleringen af stofskiftet energi og vækst [5]. Der er to parentale receptorer i IGF-systemet, der er aktive i signalering; Den IGF1R og insulinreceptoren (IR), der begge eksisterer som homodimerer omfattende to “halve receptorer«. På grund af høj sekvenshomologi de er også til stede som hybride receptorer dannet af en insulin halv receptor og en IGF1 halv receptor i celler, der udtrykker begge receptorgener [6], [7]. IR og IGF1R aktiveres af insulin og IGF-1 henholdsvis imidlertid en tredje ligand, IGF-2, binder både IGF1R og en splejsningsvariant af IR kaldes IR-A [8]. En tredje receptor, IGF2R, har ingen kendte signaltransduktionsegenskaberne og tjener som en clearing receptor for IGF-2 [9]. IGF-bindende proteiner (IGFBP’er 1-6) spiller også en vigtig rolle at spille ved reguleringen af ​​koncentrationen af ​​fri ligand og eksponeringen af ​​en ligand til dens receptor [10]. I serum, er størstedelen af ​​cirkulerende IGF-1/2 kompleksdannet med IGFBP3. Dette beskytter vækstfaktorerne mod nedbrydning, men kan også hæmme deres binding til receptorer [11]. Når de aktiveres af ligandbinding receptorerne initiere signaltransduktion gennem deres tyrosinkinase-aktivitet downstream kaskader såsom RAS /RAF /MAPK-vejen og PI3K /Akt pathway. Disse veje er ansvarlig for at regulere processorer såsom fosterudvikling, vævsvækst og metabolisme [12].

Som centralt regulator af vækst og overlevelse, deregulering af IGF-systemet er almindelig i human cancer (oversigt i [13 ]. Overskydende autokrin /parakrin produktion af IGF-1 og IGF-2 og /eller lave IGFBP3 niveauer er forbundet med en øget risiko for kræft for flere kræftformer, herunder bryst- [14], endometriske [15] og blære [16]. Studier på område har primært undersøgt rolle IGF1R. Hæmning af IGF1R hjælp inhiberende antistoffer resulterer i en betydelig reduktion i proliferation af tumorcellelinier [17], og det har vist sig at være overaktiv i cancere, herunder prostatacancer [18], bryst [19 ..], kolon [20] og galdeblære karcinom [21] Liget af beviser er sådan, at det har ført til undersøgelse af IGF1R inhibitorer i mere end 70 onkologiske forsøg [22] Disse inhibitorer falder i to klasser; monoklonale antistoffer rettet mod det ekstracellulære domæne og små molekyler ATP-kompetitive tyrosinkinaseinhibitorer til formål at selektivt inhibere IGF1R over IR men besidder aktivitet mod begge receptorer.

Bekymringer, at samtidig inhibering af IR ved små molekyler IGF1R kinaseinhibitorer ville have uønskede metaboliske konsekvenser har ført til IGF1R-selektive monoklonale antistoffer bliver begunstiget for udvikling og anvendelse i kliniske forsøg. Ikke desto mindre har det været kendt i nogen tid, at insulin kan stimulere væksten af ​​humane cancercellelinier [23] – [26], og at 80% af brystcancere overeksprimerer IR sammenlignet med normalt brystvæv [27]. Desuden ekspression af fostrets isoform af IR, IR-A, er forhøjet i flere humane maligniteter og i modsætning til signaler medieret af IR-B, som har en overvejende metabolisk virkning, IR-A har en overvejende proliferative virkning [ ,,,0],28]. Zhang et al har vist, at nedregulering af IR inhiberede metastase af brystcancerceller i en athymisk musemodel [29], og de seneste undersøgelser er begyndt at betragte fordelen af ​​dobbelt inhibering af IGF1R og IR i modeller for osteosarkom [30] og i bugspytkirtlen neuroendokrine carcinogenese [31]. I hvert tilfælde bidrog IR til celleoverlevelse virkning af IGF-systemet og forbedret flertrins tumorprogression i pancreas neuroendokrine system. Disse undersøgelser antyder en rolle for IR i tumorigenese.

I NSCLC inddragelse af IGF-systemet støttes af en række undersøgelser. Den IGF1R ofte udtryk [32] – [34], og høj IGF-1 og lave IGFBP3 niveauer er forbundet med højere risiko og øget sværhedsgrad af lungekræft [35], [36]. IGF1 har mitogene virkninger på nogle NSCLC cellelinier [37], [38], og fibroblast-afledte IGF2 fremmer væksten af ​​NSCLC-celler in vivo [39]. Derfor har man i NSCLC det blevet begrundet, at IGF1R kan være en levedygtig terapeutisk mål. I et fase-II undersøgelse af avanceret NSCLC, førstevalgsbehandling med fuldt humaniseret monoklonalt IGF1R antistof figitumumab (CP-751.871) øgede responsrate og progressionsfri overlevelse gavn af paclitaxel og carboplatin [40]. seneste NSCLC fase III-forsøg test figitumumab med enten kemoterapi eller EGFR inhibitor erlotinib blev imidlertid suspenderet på grund af mangel på overlevelse fordel [41]. I betragtning af den ny dokumentation for en rolle af IR ved andre tumorer, er det muligt, at denne mangel på klinisk fordel af figitumumab i NSCLC skyldtes, i det mindste delvist, fra uhindret signalering gennem IR.

I den foreliggende undersøgelse har vi afgjort, om signalering gennem IR understøtter NSCLC tumorcelleproliferation når IGF1R inhiberes. Vi udnyttede neutraliserende monoklonale antistoffer, der selektivt binder IGF1R eller IR foruden ATP-kompetitive inhibitorer med små molekyler, der samtidigt inhiberer begge receptorer. Denne fremgangsmåde også muliggjort en sammenligning af virkningsfuldheden af ​​antistoffer og småmolekylære inhibitorer er målrettet mod IGF-signalering akse ved inhibering af tumorcelleproliferation.

Materialer og metoder

Materialer

AZ12253801 (Astra Zeneca, Macclesfield, Cheshire, UK), NVP-ADW742 (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) og Akti-1/2 (Merck, Darmstadt, Tyskland) blev fremstillet i DMSO (slutkoncentration i forsøg var 0,5% ( v /v)). αIR3 (Merck Chemicals Ltd., Nottingham) og IR47-9 (venligt leveret af Ken Siddle (University of Cambridge, UK)) fremstillet i PBS. Insulin (Sigma, Poole, UK), IGF1 (Gro-Pep, Adelaide, Australien) og IGF2 (R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

AZ12253801 Hæmmer Downstream Signalering fra IGF1R og IR med lige Styrke mens Hæmmende monoklonale antistoffer (αIR3 og IR47-9) er specifikke for deres mål receptor.

i denne undersøgelse anvendte vi de hæmmende monoklonale antistoffer αIR3 og IR47-9, målrettet til IGF1R [46] og IR [7] henholdsvis og ATP konkurrencedygtig lille molekyle kinase inhibitor AZ12253801 der har hæmmende aktivitet over for begge receptorer . Indledende forsøg blev udført for at vurdere effekten og specificitet αIR3, IR47-9 og AZ12253801 i Hcc193 NSCLC cellelinje. 24 timer efter podning blev celler behandlet med αIR3, IR47-9 (0,5-10 ug /ml) eller AZ12253801 (2-100 nM) og derefter stimuleret med vækstfaktor. En lav koncentration (5 nM) af vækstfaktor anvendtes så de faktorer kun aktiveres deres beslægtede receptor. Phosphorylering af den nedstrøms serin /threonin-kinase, Akt, på serin-473 (S473) blev anvendt som et mål for insulin- og IGF1-induceret signaleringsaktivitet.

Stimulering med enten insulin eller IGF-1 forårsagede forøget phosphorylering af Akt på S473 (figur 1A). Den IGF1R inhiberende monoklonale antistof, αIR3, inhiberede IGF-1, men ikke insulin-medieret Akt phosphorylering. Omvendt IR inhiberende monoklonale antistof, IR47-9, inhiberede insulin, men ikke IGF-1, medieret Akt phosphorylering (figur 1B). Dette bekræftede, at disse antistoffer inhiberer kun deres respektive receptorer ved de antistof-koncentrationer anvendt i denne undersøgelse. Behandling med αIR3 reducerede ekspressionsniveauet af IGF1R (figur 1A, højre panel), hvilket stemmer overens med tidligere observationer i MCF7-cellelinie ([47] DJEE, EK, JMT publicerede observationer).

Hcc193 celler blev behandlet enten αIR3 (A), IR47-9 (B) eller AZ12253801 (C) i de angivne doser i 2 timer før 10 minutters inkubation med enten 5 nM insulin eller 5 nM IGF-1. Phosphorylering af Akt om S473 og udtryk for IGFRβ og IRβ blev bestemt ved western blotting hjælp af specifikke antistoffer. En anti-α-tubulin antistof blev anvendt som en kontrol for protein loading. Alle primære antistoffer anvendt her detektere en fremtrædende bånd ved den forudsagte molekylvægt af proteinet antistoffet dannet mod. Scannede billeder af immunblots beskæres til funktionen denne fremtrædende bånd.

Forbehandling af celler med AZ blokeret insulin- og IGF1-induceret Akt fosforylering i en dosisafhængig måde og med samme styrke (figur 1C ). I modsætning forbehandling med inhibitoriske monoklonale antistoffer, AZ12253801 (ved 25 nM og derover) inhiberede Akt phosphorylering til niveauer under det i ubehandlede celler (figur 1C). Hverken αIR3 eller IR47-9 opnået dette selv ved den højeste anvendte koncentration (10 ug /ml), eller når forbehandling tid (ved 2 ug /ml) blev forlænget til 24 timer (figur 1A, B og data ikke vist). I modsætning til αIR3, havde AZ12253801 ikke formindske udtryk niveau IGF1R.

Kombineret Hæmning af IGF1R og IR Blocks Cell Growth mere potent end Hæmning af IGF1R alene Hcc193 Celler

Til undersøge en mulig bidrag af IR støtte tumorcelleproliferation når IGF1R inhiberes blev Hcc193 NSCLC-celler dyrket under forankringsuafhængige betingelser i nærvær af IGF1, IGF2 (ved koncentrationer, som samtidigt aktiverer begge receptorer) og insulin (3GF, se Materialer og metoder). Virkningerne på proliferation af inhibere IGF1R og IR, alene og i kombination, blev bestemt. Maksimalt effektive koncentrationer af inhibitor blev udvalgt baseret på dataene i figur 1.

Figur 2A illustrerer spredning data for Hcc193 celler i forankringsuafhængig kultur. 3GF forstærkede proliferation af Hcc193 celler med 1,6 gange sammenlignet med den observeret med bærer alene. Hæmning af IGF1R ved αIR3 eller IR ved IR47-9 reduceret spredning observeret i tilstedeværelse af 3GF (3GF proliferation) med 22% (

s

0,0001) og 17% (

p

0,01) henholdsvis. Blokering både IGF1R og IR med αIR3 og IR47-9 resulterede i en reduktion i 3GF spredning, en signifikant større effekt end opnået ved blokade af enten receptor alene (

s

1 × 10

-5 i hvert tilfælde). Konstateringen af, at IR47-9 blokerede proliferation induceret af 3GF enten alene eller i kombination med αIR3 tyder på, at insulin-receptoren er direkte i stand til at fremme udbredelsen af ​​Hcc193 celler.

(A) Hcc193 celler blev dyrket under anchorage- uafhængige forhold i 0,1% serum i nærværelse af 3GF (1 nM insulin, 50 nM IGF-1, 50 nM IGF-2) alene og i kombination med αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml) , αIR3 (2 ug /ml) og IR47-9 (2 ug /ml), og AZ12253801 (50 nM) som angivet. Efter 5 dage blev levedygtige celler estimeret ved fluorescensen af ​​det metaboliske reduktion produkt af Alamar blue. Hver søjle repræsenterer middelværdien fluorescens af fire gentagne fordybninger ± standardafvigelse fra et enkelt eksperiment. De viste resultater er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. ***,

s

1 × 10

-5; **,

s

0,0001; *,

s

0,01 (gældende for alle gentagelser); tosidede uparrede

t

test. (B) Hcc193 celler blev behandlet med αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml) og IR47-9 (2 ug /ml), og AZ12253801 (50 nM) som angivet i 2 timer før 10 min inkubation med køretøj eller 3GF. Phosphorylering af Akt på S473 og ekspression af IGFRβ og IRβ blev bestemt ved western blotting. En anti-α-tubulin antistof blev anvendt som en kontrol for protein loading. Alle primære antistoffer anvendt her detektere en fremtrædende bånd ved den forudsagte molekylvægt af proteinet antistoffet dannet mod. Scannede billeder af immunblots beskæres til funktionen denne fremtrædende bånd.

Samtidig blokade af IGF1R og IR hjælp AZ12253801 resulterede i en større hæmning af spredning (75%) end opnået med αIR3 og IR47-9 i kombination (

s

1 × 10

-5) (figur 2A). Dette kan forklares ved den øgede effektivitet i AZ12253801 hæmme 3GF-induceret Akt fosforylering (figur 2B). Desuden vil de kombinerede antistoffer var mere effektive til at inhibere Akt phosphorylering end var hvert antistof alene (figur 2B). Således er effekten af ​​inhibitorer på 3GF-induceret Akt phosphorylering, når de tilsættes alene eller i kombination, parallelt deres virkning på 3GF-induceret proliferation.

The IGFR IR Expression Ratio kan tippe Afhængigheden af ​​celler på IR for Survival

Vi næste undersøgt, om den relative ekspression af IGF1R og IR-receptorer påvirket evne IR47-9 at hæmme tumorcelleproliferation eller den komparative effekt af AZ12253801 og de kombinerede neutraliserende antistoffer. Til dette formål en anden NSCLC linje, blev A549 anvendt som det udtrykker omtrent lige mange IR som Hcc193 celler, men betydeligt mere IGF1R, som bestemt ved Western blot lige mængder af lysat (figur 3A). Densitometrisk analyse indikerede, at Hcc193 celler har en IR:. IGF1R ekspression forholdet -15 gange den for A549-celler

(A) Sammenligning af ekspression af IGF1Rβ og IRβ i Hcc193 og A549-cellelinier blev bestemt ved western blotting under anvendelse af 15 ug protein ekstraheret fra hver cellelinje. (B) A549-celler blev dyrket under forankringsuafhængige betingelser i 0,1% serum i nærværelse af 3GF alene og i kombination med αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml ) og IR47-9 (2 ug /ml), og AZ12253801 (50 nM) som angivet. Efter 5 dage blev levedygtige celler estimeret ved fluorescensen af ​​det metaboliske reduktion produkt af Alamar blue. Hver søjle repræsenterer middelværdien fluorescens af fire gentagne fordybninger ± standardafvigelse fra et enkelt eksperiment. De viste resultater er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. ***,

s

1 × 10

-6; **,

s

0,0001; *,

s

0,05 (gældende for alle gentagelser); tosidede uparrede

t

test. (C) A549-celler blev behandlet med αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml) og IR47-9 (2 ug /ml), og AZ12253801 (50 nM) som angivet i 2 timer før 10 min inkubation med køretøj eller 3GF. Phosphorylering af Akt på S473 og ekspression af IGFRβ og IRβ blev bestemt ved western blotting. En anti-α-tubulin antistof blev anvendt som en kontrol for protein loading. Scannede billeder af immunblots beskæres til funktionen den fremtrædende bandet.

A549 celler blev dyrket under de betingelser, der er beskrevet for Hcc193 (figur 2). 3GF forstærkede proliferation af A549-celler ved 2 gange i forhold, der blev observeret for køretøjet kontrol (figur 3B). Hæmning af IGF1R ved αIR3 reducerede 3GF-stimuleret proliferation med 40% (

s

1 × 10

-6) ca. 2 gange reduktionen ses i Hcc193 celler. I modsætning hertil inhibering af IR ved IR47-9 havde en beskeden effekt reducerende 3GF proliferation med 10% (

s Restaurant 0,05), og i modsætning med Hcc193 celler, tilstedeværelsen af ​​IR47-9 undladt at øge virkning αIR3 på 3GF proliferation (figur 3B). Således i A549-celler IR er meget mindre effektiv til at støtte forankringsuafhængig proliferation end der observeres med Hcc193 celler. Men som observeret med Hcc193 celler, graden af ​​inhibering af A549 celleproliferation med AZ12253801 var signifikant større end observeret i nærvær af antistoffet kombination (p 0,0001, figur 3B).

Virkningen af inhibitorerne i A549 forankringsuafhængig assay var igen i overensstemmelse med deres virkning på Akt phosphorylering (figur 3C); αIR3 hæmmede 3GF-induceret Akt fosforylering, sås ingen yderligere virkning, når IR47-9 blev kombineret med αIR3, og AZ12253801 var mere effektivt end αIR3 (eller kombineret αIR3 og IR47-9). αIR3 forårsagede en reduktion i ekspression af IGF1Rβ men ikke af IRβ i A549-celler (figur 3C), som tidligere observeret i Hcc193 celler (figur 1 og 2).

Effektiv inhibering af celleproliferation med et lille molekyle IR /IGF1R Inhibitor strukturelt forskellige til AZ12253801

I både Hcc193 og A549 cellelinier AZ12253801 har en større hæmmende effekt på forankringsuafhængig spredning end kombineret αIR3 og IR47-9. For at undersøge om ATP-kompetitive inhibitorer af IGF1R /IR tilvejebringe en mere effektiv form for inhibering vækst-faktor-induceret celleproliferation end neutraliserende antistoffer, virkningen af ​​et strukturelt forskellige ATP-kompetitiv lille molekyle IGF1R /IR-inhibitor NVP-ADW742 på vækst af Hcc193 og A549 blev også vurderet. NVP-ADW742 dosisafhængigt reduceret 5 nM IGF-1 og 5 nM insulinstimuleret Akt phosphorylering i Hcc193 og A549-celler med en maksimal effektiv koncentration opnået ved 1 uM (figur 4A).

(A) Hcc193 og A549-celler blev behandlet med NVP-ADW742 (0,1 til 3 uM) i 2 timer før 10 minutters inkubation med 5 nM insulin eller 5 nM IGF-1. Phosphorylering af Akt på S473 blev bestemt ved western blotting. En anti-α-tubulin antistof blev anvendt som en kontrol for protein loading. (B) Hcc193 og A549-celler blev dyrket under forankringsuafhængige betingelser i 0,1% serum i nærværelse af 3GF alene og i kombination med αIR3 (2 ug /ml) og IR47-9 (2 ug /ml), AZ12253801 (50 nM ), NVP-ADW742 (1 uM), eller Akti-1/2 (10 uM) som angivet. Efter 5 dage blev levedygtige celler estimeret ved fluorescensen af ​​det metaboliske reduktion produkt af Alamar blue. Hver søjle repræsenterer middelværdien fluorescens af fire gentagne fordybninger ± standardafvigelse fra et enkelt eksperiment. De viste resultater er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter. ***,

s

0,001; **, P 0,01 (gældende for hvert forsøg); tosidede uparrede

t

test. (C) Hcc193 og A549-celler blev behandlet med αIR3 (2 ug /ml) og IR47-9 (2 ug /ml) AZ12253801 (50 nM), NVP-ADW742 (1 uM) eller Akti (10 uM) som angivet i 2 h før 10 min inkubation med køretøj eller 3GF. Phosphorylering af Akt om S473 og udtryk for IGFRβ og IRβ blev bestemt ved western blotting hjælp af specifikke antistoffer. En anti-α-tubulin antistof blev anvendt som en kontrol for protein lastning.

Figur 4B illustrerer forankringsuafhængig proliferation af Hcc193 og A549-celler henholdsvis i nærvær af 3GF og virkningen af ​​αIR3 og IR47-9, AZ12253801 og NVP-ADW742 på dette. NVP-ADW742 inhiberede 3GF-induceret Hcc193 og A549 celleproliferation til en tilsvarende grad til AZ12253801 og i større grad end observeret med en kombination af αIR3 og IR47-9. Dette blev afspejlet i den større grad af hæmning af Akt phosphorylering med ATP-kompetitive hæmmere sammenlignet med αIR3 /IR47-9 (figur 4C).

Den tætte sammenhæng mellem effekten af ​​AZ12253801, NVP-ADW742, αIR3 og IR47-9 på celleproliferation og på Akt phosphorylering foreslog, at Akt kan bidrage til 3GF-stimuleret proliferation af cellerne. For at udforske dette yderligere brugte vi en selektiv allosterisk inhibitor af Akt, Akti-1/2 om Hcc193 og A549 celler. Akti-1/2 var lige så effektivt som AZ12253801 og NVP-ADW742 at inhibere forankringsuafhængig celleproliferation (figur 4B) og tilsvarende effektiv til at hæmme Akt phosphorylering (figur 4C). Dette resultat er i overensstemmelse med Akt mediering forankringsuafhængig proliferation af disse cellelinjer nedstrøms for IGF1R og IR.

Discussion

IGF1-R har en veletableret rolle i tumorigenese imidlertid den nylige svigt af IGF1-R monoklonale antistof figitumumab i NSCLC forsøg har spørgsmålstegn ved, om at målrette denne vej alene vil føre til en terapeutisk fordel. Ny dokumentation antyder, at signalering via relaterede IR tilvejebringer en mekanisme, ved hvilken tumorceller modstå virkningerne af IGF1-R-inhibering i human osteosarkom og brystcancer. I overensstemmelse hermed støtter vores data en potentiel rolle for IR i proliferation af NSCLC-cellelinier med høj IR: IGF1R forhold. Derudover leverer vi bevis for, at dobbelt blokade af IR og IGF-1R ved hjælp af en ATP-konkurrencedygtig lille molekyle IR /IGF-1R inhibitor har forbedret effektivitet ved at hæmme NSCLC celledeling løbet, der opnås ved samtidig hæmning af IR og IGF1-R ved hjælp af selektive monoklonale antistoffer.

i overensstemmelse med den etablerede rolle IGF1 støtte tumorcelleproliferation [17], [30], [31], [38], [48], neutraliserende antistof-rettet blokade af IGF1 -R i hver af de testede NSCLC cellelinier resulterede i en delvis inhibering af proliferation (figur 2-4). A549-celler var mere følsomme end Hcc193 i denne forbindelse muligvis afspejler den højere ekspression af IGF1R i A549 og den resulterende lave IR: IGF1R udtryk ratio. Selektiv blokade af IR under anvendelse af et specifikt antistof også reduceret proliferation i hver cellelinie. I Hcc193 celler, som har et relativt højt IR: IGF1R udtryk ratio, omfanget af denne reduktion var den samme som forårsages af IGF1R inhibering, men i A549-celler reduktionen i proliferation med blokade af IR var markant mindre end det observerede ved IGF1R inhibering. Disse resultater stemmer overens med en tidligere rapport, der viser, at en brystcancer-cellelinie med høj IR: IGF1R ekspression ratio (MDAMB231) var mere følsom over for IR blokade end en cellelinje med en lav IR: IGF1R ekspression ratio (MCF7) [31]. Undertrykkelse af IR-ekspression ved RNA-interferens er også blevet vist at inhibere celleproliferation, i hvilket omfang dette sker varierende med celletype og arten af ​​assayet [29], [30]. IR støtter derfor tumorcelleproliferation af adskillige celletyper uafhængigt af IGF1R, og vi har her udvidet disse observationer til NSCLC-celler.

Kombineret inhibering af IGF1R og IR med monoklonale antistoffer i Hcc193 cellelinien reduceret proliferation i højere grad end inhibering af enten receptoren alene. Dette indikerer, at IR i NSCLC har potentiale til at bidrage til resistens over for IGF1R hæmning ved at støtte celleproliferation. En sådan rolle for IR i forbindelse med målrettet IGF1R er blevet påvist i en transgen musemodel af pancreas neuroendokrine carcinogenese og humane brystcancerceller [31], og i osteosarcom cellelinier [30]. I begge disse undersøgelser IGF2, snarere end IGF1, blev defineret som vækstfaktor signalering gennem IR for at forårsage dette protumorigenic virkning. Det samme kan være tilfældet i NSCLC hvor IGF2 er kendt for at støtte tumorvækst [39], [49]. Desuden er det muligt, at insulin selv kan bidrage i denne henseende, som det har veletableret mitogene egenskaber [23] – [26] og er inkluderet, med IGF1 og IGF2, i vækstmediet i den aktuelle undersøgelse. Blokade af IR undladt at øge virkningen af ​​IGF1R inhibering i A549-celler antyder, at i NSCLC tilfælde, hvor lave forhold af IR: IGF1R udtryk findes, og når disse celler eksponeres for IGF1 foruden IGF2 og insulin, co-målretning IR kan ikke være gavnligt.

småmolekylære tyrosinkinaseinhibitorer såsom AZ12253801, NVP-ADW742 og BMS754807 [50], [51] inhibere både IGF1R og IR- og, som sådan, har potentialet til at være mere effektive antineoplastiske midler end antistoffer mod IGF1R. Faktisk, i den aktuelle undersøgelse virkningen af ​​AZ12253801 på Hcc193 celler var i overensstemmelse med den for dobbelt IGF1R og IR blokade af antistoffer som omfanget af inhibering af proliferation var større end set ved blokade af alene IGF1R.