PLoS ONE: Meta-analyse Identificerer NF-KB som terapeutisk target i Renal Cancer

Abstrakt

Målsætning

For at bestemme udtrykket mønstre af NF-KB lovgivere og target gener i klar celle renalcellecarcinom (ccRCC), deres sammenhæng med von Hippel Lindau (VHL) mutations status, og deres forbindelse med overlevelse resultater.

Metoder

Meta-analyser blev udført på offentliggjorte ccRCC genekspression datasæt ved RankProd, en ikke-parametrisk statistisk metode. Degs med et falsk Discovery Rate af 0.05 ved denne metode blev betragtet betydelige, og gennemskåret med en kurateret liste over NF-KB regulatorer og mål for at bestemme arten og omfanget af NF-KB-deregulering i ccRCC.

Resultater

En meget -disproportionate fraktion (~ 40%,

s

0,001) af NF-KB regulatorer og målgener blev fundet at være opreguleret i ccRCC, tegn på forhøjet NF-KB-aktivitet i denne kræftform. En undergruppe af disse gener, der omfatter en central NF-KB regulator (

IKBKB

) og etablerede formidlere af den NF-KB-celle-overlevelse og pro-inflammatoriske reaktioner (

MMP9

,

PSMB9

, og

SOD2

), korreleret med højere relativ risiko, dårligere prognose, og reduceret den samlede patient overlevelse. Overraskende niveauer af flere interferon regulatoriske faktorer (IRFS) og interferon målgener blev også forhøjet i ccRCC, hvilket indikerer, at en “interferon underskrift« kan repræsentere en hidtil ukendt træk ved denne sygdom. Tab af VHL-genekspression korrelerede stærkt med fremkomsten af ​​NF-κB- og interferon-gen-signaturer i både familiære og sporadiske tilfælde af ccRCC. Som NF-KB kontrollerer ekspressionen af ​​vigtige interferon signalering noder, vores resultater tyder på en årsagssammenhæng mellem VHL tab, forhøjet NF-KB-aktivitet, og fremkomsten af ​​en interferon signatur under ccRCC tumorigenese.

Konklusioner

Disse resultater identificerer NF-KB og interferon signaturer som kliniske funktioner i ccRCC, giver god grund til inkorporering af NF-KB-hæmmere og /eller og udnyttelse af interferon-signalering i behandlingen af ​​ccRCC, og levere nye NF-KB-mål for potentiel terapeutisk intervention i dette aktuelt uhelbredelig malignitet

Henvisning:. Peri S, Devarajan K, Yang DH, Knudson AG, Balachandran S (2013) metaanalyse Identificerer NF-KB som terapeutisk target i nyrekræft . PLoS ONE 8 (10): e76746. doi: 10,1371 /journal.pone.0076746

Redaktør: Edward W. Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 22, 2013; Accepteret: August 23, 2013; Udgivet: 7 okt 2013

Copyright: © 2013 Peri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en American Cancer Society Research Scholar Grant (RSG-09-195-01-MPC) til SB. Yderligere midler blev tilvejebragt af Fox Chase Cancer Center via institutionel støtte af nyrekræft Keystone Program, og ved NIH tilskud N01 CN-95037 og P30 CA 06927. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nyrer celle carcinomer (RCC) tegner sig for omkring 3% af alle voksne kræftformer, og forårsage ~ 116.000 årlige dødsfald på verdensplan [1]. Adskillige histologiske undertyper af RCC er blevet beskrevet, herunder kromofobt, papillær og klar celle, hvoraf den klare celle variant (ccRCC) tegner sig for ~ 85% af alle RCC tilfælde [2,3]. Tidlige fase ccRCC er normalt helbredes ved operation, og patienter diagnosticeret med lokaliserede renale masser af 4 cm. har fremragende prognose [4]. ccRCC er imidlertid et stort set asymptomatisk sygdom, og cirka en tredjedel af alle patienter stede med lokalt fremskreden eller metastatisk cancer på tidspunktet for diagnosen. I modsætning til lokaliseret tidlige fase ccRCC, avanceret ccRCC er en dødelig, kemoterapi-resistent cancer [1,5].

Avanceret ccRCC primært behandles af små molekyler farmakologiske tilgange. Frontline muligheder omfatter tyrosinkinaseinhibitorer sunitinib og sorafenib, og mTOR-hæmmere temsirolimus og everolimus. Disse midler er imidlertid kun give kortvarig fordel ved at forsinke sygdommens progression, og er ikke helbredende [6-8]. Desuden er sådanne midler kræver kontinuerlig indgivelse, udsætter patienterne til betydelige bivirkninger [7,9]. Behandling af metastatisk RCC er derfor stadig en terapeutisk udfordring i behov for nye.

En genetisk kendetegnende for ccRCC er inaktivering af von Hippel Lindau (VHL) tumorsuppressorgen [10].

VHL

gen inaktiveres ved enten mutation eller hypermethylering i op til 90% af sporadiske ccRCC sager [10-12]. I sin bedste beskrevne rolle, pVHL, produktet af

VHL

gen, fungerer som en del af en nedbrydende E3 ubiquitin ligase kompleks, der stramt styrer proteinniveauer hypoxi inducible factor (HIF), en transkriptionsfaktor og mester regulator af cellulære respons på hypoxi [11,13]. Når pVHL er fraværende, HIF akkumuleres selv under normoxiske betingelser, og uhensigtsmæssigt transaktiverer ekspression af dets målgener. Da mange HIF-mål er potent tumorgene, mis-ekspressionen af ​​HIF målgener der betragtes som de primære Dirigenter af

VHL

deficiente ccRCC tumor progression, og målretning veje nedstrøms for HIF (f.eks VEGF signalering) repræsenterer en primær farmakologisk tilgang til behandling af RCC [11].

Udover at regulere HIF, pVHL er blevet vist i flere studier af cellekulturer til også styre aktiviteten af ​​transkriptionsfaktoren NF-KB [14]. Når pVHL udtryk er tabt (eller poleres af RNAi), er NF-KB-aktivitet forhøjet; omvendt, re-introduktion af pVHL i

VHL

-null RCC celler sænker NF-KB-aktivitet [15-17]. Disse observationer har vigtige kliniske udløbere. Først da NF-KB (ligesom HIF) er en central regulator af inflammatoriske og celle-overlevelse reaktioner, er det meget sandsynligt, at forhøjet NF-KB-signalering efter pVHL tab vil bidrage til trin i tilblivelsen, progression, overlevelse, og /eller spredning af ccRCC. For det andet, hvis NF-KB er faktisk forhøjet i ccRCC tumorer – og ikke kun i RCC-cellelinjer – så målrettet NF-KB giver en spændende ny behandlingsmulighed for avanceret ccRCC. I denne henseende har indledende studier vist, at små-molekyle inhibering af NF-KB sensibiliserer ellers resistente ccRCC celler til (1) den tumordræbende aktivitet af EGFR-hæmmere, (2) apoptose af anti-tumor-cytokin TRAIL, og (3) onkolyse af encephalomyocarditisvirus [14,18-21]. Af disse grunde opnå indsigt i arten og omfanget af NF-KB de-regulering i ccRCC tumorer bliver et vigtigt mål.

Vi indledte denne undersøgelse for at afgøre, gennem storstilet bioinformatiske nærmer forekomsten af ​​NF-KB transkriptom deregulering i patient-afledte ccRCC prøver. Ud fra disse analyser, har vi fundet, at NF-KB synes at være konstitutivt aktive i en høj procentdel af ccRCC sager, og at et uforholdsmæssigt stort antal NF-KB regulatorer og mål (den ccRCC ‘NF-KB-signatur “) display konsekvent forhøjet udtryk i ccRCC, sammenlignet med normale nyrevæv. Yderligere undersøgelser afslørede også tilstedeværelsen af ​​en robust ‘interferon (IFN) signatur “i ccRCC. Vi viser, at forekomsten af ​​både NF-KB og IFN signaturer er godt korreleret med VHL mutationsstatus, og identificere en vigtig delmængde af NF-KB regulatorer og mål, hvis forhøjet udtryk korrelerer med højere relativ risiko, dårligere prognose, og samlet reduceret overlevelse i ccRCC. Tilsammen indikerer disse resultater, at forhøjet NF-KB og IFN signalering kan repræsentere fælles træk ved pVHL-negative ccRCC, og give rationale for målretning NF-KB i denne sygdom.

Materialer og metoder Salg

Etik erklæring

brugen af ​​humane vævsprøver fra patienter på Fox Chase Cancer center blev godkendt af Fox Chase Institutional Review Board. Skriftligt informeret samtykke, der er godkendt af den etiske komité, blev opnået for brugen af ​​disse prøver.

Immunhistokemi

En nyrevævet microarray (TMA), der indeholder dublerede skiver fra 20 ccRCC tumorer og 8 normal nyrer, blev konstrueret fra arkivering formalin fikseret, paraffinindlejrede Fox Chase Cancer center patientprøver. TMA vævssnit blev skåret med en tykkelse på 5 mikron, deparaffineret af xylen og rehydreret i faldende koncentration af ethanol. Antigen genfinding blev opnået ved kogning sektioner på 10 mM citratbuffer i 20 minutter. Efter blokering af endogen peroxidase med 3% hydrogenperoxidase i methanol blev snit inkuberet med Baggrund Sniper (Biocare Medical) ved stuetemperatur i 30 minutter. Snittene blev næste inkuberet med primære antistoffer, NF-KB (Cell Signaling) ved fortynding på 1: 500, og STAT1 (BD Biosciences) i en fortynding på 1: 100, ved 4 ° C natten over. Efter vask i PBS blev snit inkuberet med mærkede Polymer-HRP-anti-kanin og anti-muse (DAKO) sekundært antistof ved stuetemperatur i 1 time, udsættes for diaminobenzidintetrahydrochlorid opløsning, og modfarvet med hæmatoxylin. Efter dehydrering i stigende koncentrationer af ethanol og clearing i xylen blev snit monteret i Permount. Billeder blev taget på et Nikon Eclipse E600 mikroskop med NIS Elements D3.0 software.

Meta-analyse

For metaanalyser, vi samlet en liste over offentliggjorte RCC studier fra Genekspression Omnibus ( GEO) eller ArrayExpress (tabel S1), hvis data var (i), der genereres ved hjælp af Affymetrix platforme U133A, U133B, og U133Plus2; (Ii) præcist kommenteret når deponeret i databaser; og (iii) indeholdt normale kontroller væv. For undersøgelser under anvendelse af U133A og U133B chips, vi kun betragtet dem, der profilerede prøver på

både

chips; dette maksimeret antallet af gener er tilgængelige til efterfølgende meta-analyse. Rådata blev normaliseret ved hjælp Robust Multi array Average (RMA) [22]. I tilfælde, hvor prøverne blev profileret på to forskellige platforme (fx Affymetrix U133A og U133B), sonde sæt med højere betyde udtryk værdier blev valgt, hvis flere probesæt mappet til samme gen. De datasæt blev derefter fusionerede baseret på gen-symbol ved hjælp af MergeMaid pakken (https://astor.som.jhmi.edu/MergeMaid) tilgængelige via BioConductor [23]. Meta-analyser blev udført under anvendelse af RankProd metoden [24], en ikke-parametrisk statistisk metode, der utlilzes rækker af differentielt udtrykte gener (DEGS) blandt de forskellige undersøgelser for at generere en liste over DEGS mellem to tilstande (f.eks ccRCC vs. normal). Betydningen af ​​differentiel genekspression beregnes derefter baseret på procentdelen af ​​falske positive forudsigelser (dvs. den False Discovery Rate eller FDR). Til denne undersøgelse valgte vi vores lister over DEGS baseret på en FDR på 0,05 (5%) beregnet på grundlag af 10.000 permutationer. At definere NF-KB og IFN signaturer, kurateret NF-KB og IFN generne blev gennemskåret med opreguleret degs. For at undersøge NF-KB og IFN signaturer i prøver med mono- eller biallel inaktivering af

VHL

blev DEGS beregnet ved anvendelse LIMMA [25] og RMA-normaliserede data. Vores metode er sammenfattet i rutediagrammet præsenteret i figur S1

Survival analyse

Genekspression og overlevelsesdata rådighed for 55 ccRCC patienter i TCGA databasen (https:. //tcga-data.nci .nih.gov /TCGA /) blev anvendt til at overleve analyser ved hjælp af univariate Cox proportional hazard (PH) og Accelerated Manglende Time (AFT) modeller [26]. En goodness-of-fit (GOF) test af Cox PH-modellen blev udført [27]. Mens Cox PH modellen implicit antager, at faren og overlevelseskurverne svarende til to forskellige værdier af en kovariat ikke krydser, AFT model tillader passage af kurver [28,29] og tegner sig for ikke-proportionalitet farer (eller risiko for død ) i de to grupper. Alle tests var to-sidede og anvendt en type I fejl på 0,05 for at bestemme statistisk signifikans. Ud over den

s

-værdier for hver model-fit, estimater af relative risiko (RR) fra Cox PH og koefficient (β) fra den agterste modeller henholdsvis blev anvendt til at bestemme størrelsen af ​​foreningen mellem genekspression og samlet overlevelse. En RR estimat på over 1 eller negativt skøn over β angiver dårlig prognose med stigende ekspression. For at visualisere sammenslutningen af ​​genekspression niveauer med samlet overlevelse, blev individuel genekspression profiler dikotomiseret af median opdelt i “høj” eller “lav” udtryk grupper og Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev afbildet for hver gruppe. Beregninger blev udført ved hjælp af pakkerne

overlevelse

og

lss

i F statistiske sprog og miljø (https://www.r-project.org).

Resultater

Meta-analyse identificerer NF-KB-deregulering i ccRCC

Mens behandlingen af ​​en offentligt tilgængelig mikromatrice datasæt af ccRCC og parrede normale prøver [30,31], vi har bemærket, at flere etablerede NF-KB target gen mRNA blev overudtrykt i ccRCC prøver, i forhold til deres normale kontroller. I betragtning af de terapeutiske udløbere af disse observationer, vi søgte at afgøre, om NF-KB er konstitutivt aktiv i ccRCC. Vi undersøgte derfor patient-afledte ccRCC prøver for nuklear lokalisering af den klassiske NF-KB-sub-enhed RelA /p65. Vi fokuserede på RelA /p65, som tidligere undersøgelser har vist, at RelA-indeholdende dimere komplekser er den dominerende form for NF-KB i ccRCC cellelinier, og at disse komplekser igen lokalisere fra cytoplasmaet til cellekernen, når aktiv [32-34 ]. Ud af 20 distinkte ccRCC prøver undersøgt, 16 (80%) viste robust nuklear farvning af RelA i 50% af celler, indikerer konstitutiv NF-KB-aktivitet i disse celler. Yderligere to sager viste svag kernefarvning i 20% af cellerne, og to andre manifesteret intet påviseligt RelA signal i kernen. Derimod undersøgte ingen (0/8) af de normale nyre sektioner vises påviselig nukleare RelA farvning. Et typisk eksempel på intens nukleare RelA farvning i ccRCC – men ikke normale nyrevæv – er vist i figur 1a; bemærke, at normale celler i proksimale tubulære epitel, hvorfra ccRCC menes at opstå, viser tegn på

cytoplasmatisk

RelA (figur 1a, pile). Disse resultater antyder, konstitutivt aktive nukleare NF-KB kan være et fælles træk i ccRCC, måske som følge af NF-KB-aktivering i den rørformede epitel under RCC tumorigenese.

(a) immunhistokemisk farvede viser fremtrædende nukleare RelA signal i ccRCC prøver, men ikke i normalt nyrevæv. Pilen angiver cytoplasmatisk RelA farvning i celler fra den proksimale tubulære epitel. Scale bar = 100 uM. (B) Up-regulerede gener (X-akse) fra meta-analyse af de fire ccRCC datasæt blev plottet mod falsk-discovery sats (FDR, Y-akse). Opreguleret gener med FDR 0,05, vist med rødt, blev anvendt til at definere NF-KB og IFN signaturer. (C) Heatmaps viser ekspression af NF-KB signatur gener i hver af de fire angivne undersøgelser. N = normal, T = tumor. Heat bar = ekspressionsniveauerne (log

2 skala).

For at undersøge omfanget af NF-KB-target-gen deregulering i ccRCC, vi først fastlagt en liste med gener, hvis udtryk er kendt for at regulere og /eller reguleres af NF-KB. Ræsonnement, at afvigende NF-KB-aktivitet vil blive afspejlet i den ændrede udtryk for disse gener, vi kombineret et offentligt tilgængelig liste over kommenterede NF-KB målgener [(HUhttp: //bioinfolifl.fr/NF-KBUH, hovedsageligt baseret på [ ,,,0],35]] med vores egne datasæt [36,37] for at kuratere alt 137 gener (tabel S2), der vides at regulere NF-KB, hvis promotorer indeholder putative /valideret NF-KB-bindingssteder, og /eller hvis ekspression har blevet vist at stole på NF-KB-aktivitet i forskellige sammenhænge.

Vi næste undersøgt ved metaanalyse udtrykket profiler af disse 137 NF-KB målgener i hel-genom transkriptomisk data fra 61 ccRCC og 34 normale prøver på tværs af fire uafhængige undersøgelser, som vi refererer til her ved navnene på deres første forfattere:.. Cifola, Gumz, burg og Yusenko [31,38-40] Kriterier for udvælgelse af disse undersøgelser er opsummeret i figur S1 til denne meta-analyse, vi bruges RankProd, en ikke-parametrisk statistisk metode stand til ikke blot at integrere data fra en række forskellige platforme, men også håndtere eksperimentel variabilitet mellem datasæt [24]. Af ~ 18.000 samlede gener undersøges, 3.560 fandtes at være ensartet opreguleret i ccRCC (figur 1b), mens 2.797 gener var konsekvent nedreguleres, ved en falsk opdagelse sats (FDR) på ≤ 0,05. Af disse 58 gener (~ 42% af alle kurateret NF-KB-mål) var opreguleret i ccRCC prøver, sammenlignet med normale kontroller. Forholdet mellem NF-KB-gener opreguleret i ccRCC (58/137) er af stor betydning, (

s

-værdi 0,001 ensidigt andel

Z

-test), sammenlignet med den procentdel af alle gener opreguleret i ccRCC (3560/17997; ~ 20%). Derimod tre gange færre NF-KB target gener (18 gener, der repræsenterer 13% af NF-KB-mål) blev nedreguleret i ccRCC; dette viste sig ikke at være signifikant (p-værdi = 0,74). Resultaterne fra denne analyse indikerer, at ccRCC prøver viser selektiv, ensartet forhøjet ekspression af en undergruppe af NF-KB målgener. Vi udpeger disse gener i ccRCC ‘NF-KB-gen signatur «. Figur 1C viser udtrykket profiler af NF-KB-gen signatur i hvert af de fire studier

ccRCC NF-KB-gen signatur var sorteres i fire forskellige kategorier:. Proinflammatorisk, celle-overlevelse, NF KB lovgivere, og, overraskende, interferon regulatorer (tabel S3). Hovedparten af ​​opreguleret NF-KB-mål var proinflammatorisk (43/58). Af de resterende gener, blev syv involveret i celle overlevelse, og fem blev foder frem eller feed-back regulatorer af NF-KB respons selv. Uventet, tre NF-KB-mål (

IRF1, IRF2

, og

IRF7

) konsekvent opreguleret på tværs af alle ccRCC prøver kodet interferon regulatoriske faktorer (IRFS), en familie af transkriptionsfaktorer typisk er forbundet med interferon-medierede medfødte-immunrespons på mikrobielle infektioner [41]. Individuelle udtryk profiler af to repræsentative gener fra hver kategori er vist i figur 2. Disse resultater identificerer i ccRCC NF-KB signatur flere veletablerede formidlere af den NF-KB proinflammatoriske og celle-overlevelse responser, samt en uventet delmængde af IFN regulatorer.

(a) Cell-overlevelse gener

BCL2

SOD2

, (b) pro-inflammatoriske gener

CCL5

ICAM1

, (c) NF-KB regulatorer

NFKB1

og

TNFAIP3

og (d) interferon regulatoriske faktorer

IRF1

IRF7

. Data blev normaliseret ved hjælp RMA. Fold-ændringer for Tumor (T) versus Normal (N) sammenligning blev opnået ved LIMMA. Y-aksen viser RMA-normaliseret ekspressionsniveau (på log

2 skala) af hvert mRNA. Blå kasser repræsenterer genekspression niveauer i normalt væv, og rød viser udtryk i ccRCC. Den hvide linje inden for hver kasse er medianen, og afstanden mellem kasse og whiskers indikerer interkvartile intervaller. Hver af de fire grafer pr gen repræsenterer udtryk profiler i arrays genereret af (fra venstre til højre) de Cifola, Gumz, burg, og Yusenko studier.

En interferon signatur i ccRCC

Fascineret af den iagttagelse, at IRF-kodende gener var opreguleret i ccRCC, hypotese vi, at der ud for forhøjet NF-KB-aktivitet, ccRCC celler sandsynligvis display øget tonic type i (α /β) IFN signalering. Tre publicerede observationer ligger til grund denne hypotese. Første, de gener, der koder IRFS 1,2, og 7, ud over at være NF-KB-mål, er også velbeskrevne IFN-stimulerede gener (ISGs) [42,43]. For det andet er de fleste celler opretholder lave niveauer af autokrin type I (α /β) IFN signalering, angiveligt som forberedelse til akutte virusinfektioner [44-46]. Tredje, har vi tidligere rapporteret, at konstitutiv NF-KB-signalering er nødvendig for opretholdelse af autokrine IFN signalering [36,44]. Tilsammen udgør disse observationer giver os mulighed for at foreslå en model, hvor forhøjede NF-KB-signalering “ramper op ‘tonic type I IFN signalering, som derefter øger ekspressionen af ​​ISGs (såsom

IRFS

) i ccRCC.

for at teste denne model, vi undersøgte RCC prøver til hyperaktive tonic type i IFN signalering. Som direkte måling af tonic type I IFN niveauer i inficerede væv er udfordrende og upålidelige [36], vi i stedet gennemgået en nedstrøms konsekvens af aktiv IFN: nuklear lokalisering af nøglen IFN-responsive transskription faktor STAT1. Ligesom NF-KB selv, STAT1 normalt cytoplasmatisk når den er inaktiv, men hurtigt translokerer til kernen til at drive ISG ekspression på IFN-stimulering [47]. Hvis IFN signalering konstitutivt er forhøjet i RCC vil STAT1 forventes at lokalisere til kernen i RCC – men ikke normal – væv. Vi fandt, at 16/20 RCC prøver, men ingen af ​​de normale nyre enheder (0/8) – vises stærk STAT1 farvning nukleare (figur 3a). Bemærkelsesværdigt, og efter aftale med en årsagssammenhæng mellem forhøjet NF-KB-signalering og øget tonic IFN aktivitet, fuldt 100% af RelA-positive ccRCC prøver nukleare var også positive for nuklear STAT1.

(a) Immuno-histokemiske farvning viser robust nuklear STAT1 signal i ccRCC prøver, men ikke i normalt nyrevæv. (B) Heatmap viser ekspression af IFN signatur gener efter IFN-stimulering af murine fibroblaster. Heat bar = fold-ændring (log

2 skala). Ekspressionsniveauer af ubehandlede celler blev arbitrært sat til 1 (beige). (C) Heatmaps viser ekspression af IFN signatur gener i hver af de fire angivne undersøgelser. N = normal, T = tumor. Heat bar = ekspressionsniveauer (log

2 skala).

Vi identificerede fra vores tidligere arbejde [36] i alt ~ 400 gener, der induceres i det mindste to gange ved type I IFN’er (figur 3b), for hvilke udtryk data var også til stede i de fire ccRCC undersøgelser. Når vi undersøgte udtryk for disse ISGs i ccRCC datasæt, blev fundet i alt 164 ISGs at være opreguleret i ccRCC (~ 40% af alle testede ISGs, p-værdi 0,001 ved ensidet andel Z-test) , mens kun 51 ISGs ned var reguleret [~ 13%, p-værdi = 0,94]. Disse resultater indikerer, at ligesom med NF-KB, konstitutivt-forhøjet type I IFN signalering forekommer i ccRCC. Den 164-gen “IFN-gen underskrift« vises i Tabel S4, og dets ekspression profil i hver af de fire enkelte studier er vist i figur 3c.

Vi næste brugte Opfindsomt Pathways analyse til at konstruere et netværk, der ville identificere intermolekylære forbindelser mellem NF-KB og IFN gen signaturer. Denne analyse afslørede robust forbindelse mellem NF-KB og IFN signaturer via IFN-β (kodet af

IFNB1

) og IRF knudepunkter (figur 4). Forventeligt, pro-inflammatorisk og celle-overlevelse klynger blev observeret inden for NF-KB arm af nettet, mens adskillige veletablerede medfødte-immune mediatorer var repræsenteret i IFN signatur arm (figur 4). Tilsammen disse resultater understøtter en årsagssammenhæng mellem NF-KB og IFN signaturer medieret af autokrine IFN /IRF signalering

Netværket blev bygget af Ingenuity Pathway Analysis software (Ingenuity® Systems, HUhttp:. //Www. ingenuity.comUH) ved hjælp af alle gener i NF-KB og IFN signaturer. Vigtige klynger i NF-KB (brun) og IFN (blå) våben er identificeret, og regulatoriske molekyler kontrollerer gen-netværksknuder er vist som store cirkler.

VHL mutationsstatus korrelerer med udtryk for NF KB og IFN signaturer

Resultater fra celle-kultur studier tyder en årsagssammenhæng mellem fravær af funktionelt pVHL protein og forhøjet NF-KB-aktivitet i ccRCC [15-17]. På baggrund af disse observationer, vi adspurgte hvis mutationsstatus af

VHL

korreleret med fremkomsten af ​​NF-KB og IFN signaturer i ccRCC. Til denne analyse, vi i forhold til deres respektive normale kontroller (1) epitelial cellekulturer af præ-neoplastiske renale læsioner fra seks familiær tilfælde af VHL patienter huser en funktionel kopi af

VHL

[48], (2) ccRCC væv fra 32 familiær tilfælde af biallelically-inaktiveret

VHL

[49], og (3) ccRCC væv fra 20 sporadiske tilfælde af biallelically-inaktiveret

VHL

[49]. Vi fandt, at hverken NF-KB eller IFN underskrifter var til stede hos patienter med en funktionel kopi af

VHL

. Derimod ccRCC prøver huser biallel tab af VHL (uanset om familiær eller sporadisk oprindelse) viste robust ekspression af begge NF-KB og IFN signaturer (figur 5). Disse data giver stærk støtte til tanken om, at VHL inaktivering sandsynligvis er kausalt forbundet med forekomsten af ​​forhøjet NF-KB og IFN aktivitet i ccRCC.

Heatmaps viser fold-ændringer i ekspressionsniveauer af NF-KB signatur gener ( a) eller IFN signatur gener (b) mellem VHL +/- prøver fra tilfælde af familiær VHL sygdom sammenlignet med

VHL

+ /+ normal renal epitel (kolonne 1); VHL – /- tilfælde af familiær ccRCC sammenlignet med normale nyrevæv (kolonne 2); eller VHL – /- tilfælde af sporadisk ccRCC sammenlignet med normale nyrevæv (kolonne 3). Heat bar = fold-ændring (log

2 skala).

Forhøjet udtryk for delmængde af NF-KB-mål korrelerer med dårligt resultat i ccRCC patienter

For at afgøre, om øget NF-KB-aktivitet var associeret med dårlig overlevelse resultater i ccRCC undersøgte vi sammenhængen mellem ekspression af gener i vores NF-KB-signatur og samlet overlevelse for 55 ccRCC patienter, hvis genekspression og overlevelsesdata var tilgængelige i The Cancer Genome Atlas (TCGA) . Fra denne analyse, fandt vi, at forhøjet udtryk for fire NF-KB regulatorer og target gener (

IKBKB

,

MMP9, PSMB9

, og

SOD2

) var signifikant associeret med højere relativ risiko (RR), dårligere prognose, og reduceret den samlede patient overlevelse af Cox PH model (

s

-værdi 0,05, RR 1) eller af AFT model (

s

-værdi 0,05 eller β koefficienten 0, se Methods). Disse fire gener omfatter en central regulator af NF-KB-signalering selv (

IKBKB

) og etablerede formidlere af den NF-KB-celle-overlevelse og pro-inflammatoriske reaktioner (

MMP9, PSMB9

, og

SOD2

), at hæve den spændende mulighed, at selektivt rettet mod medlemmer af denne delmængde vil have klinisk fordel i ccRCC. Figur 6 viser Kaplan-Meier-kurver for disse gener og tabel S5 opsummerer resultaterne af disse analyser.

Kaplan-Meier-overlevelseskurver for gener i NF-KB signatur, hvis øget ekspressionsniveauer signifikant korrelerer med dårligere samlet overlevelse resultatet er vist. Individuelle genekspression profiler blev dikotomiseret af median opdelt i “høj” (rød) eller »lav« (blå) udtryk grupper. Gene navne er angivet ovenfor hver graf. Se tabel S5 for

s

-værdier.

Af note, forøget ekspression af et femte gen (

NFKB1

, der koder for NF-KB-sub-enhed P105 /p50) blev også signifikant associeret med dårligere overlevelse på den AFT model (

s

-værdi = 0,041). Men en positiv værdi β koefficient (33,6) og manglende betydning af Cox PH model (p-værdi = 0,41, RR = 0,5) afskåret os fra at tydeliggøre dets forbindelse med ccRCC progression, hvorfor vi fokuseret på

IKBKB

,

MMP9, PSMB9

, og

SOD2

.

diskussion

I denne undersøgelse har vi bestemt, at NF-KB er konstitutivt aktiv i størstedelen af ​​ccRCC undersøgte prøver, og har vist ved metaanalyse, at centrale NF-KB regulatorer og mål er ensartet opreguleret på tværs af fire uafhængige undersøgelser. Vi rapporterer også opdagelsen af ​​en IFN signatur i ccRCC, og tilvejebringe overbevisende bevis for, at tab af VHL funktion er nødvendig for begge NF-KB og IFN signaturer. Endelig har vi identificere en delmængde af potentielt druggable NF-KB regulatorer og mål, hvis forhøjet udtryk korrelerer med dårlig prognose og overlevelse. Notatet utilgængelighed af patientdata afskåret os fra at undersøge, om NF-KB og /eller IFN signaturer korreleret med ccRCC scene /stilling.

Selvom NF-KB-medieret overlevelse signalering sandsynligvis udviklet sig til at beskytte celler fra mitokondrie flux uløseligt forbundet med normale fysiologiske reaktioner (f.eks under cytokin-drevet antimikrobielle svar), flere observationer gør det plausibelt, at NF-KB-celle-overlevelse respons er blevet misbrugt af tumorceller til at fremme deres egen levedygtighed. For eksempel stiftende medlem af NF-KB familie – aviær retroviral gen

v-Rel

– er en

bona fide

onkogen, og gener, der koder NF-KB underenheder, signalpaneler komponenter display aktiverende mutationer i flere tumorer [revideret i [50-52]]. NF-KB-celle-overlevelse mål koder antioxidantenzymer denne buffer mitokondrier i perioder med øget bioenergetic efterspørgsel, samt andre proteiner (såsom Bcl-2-familiemedlemmer Bcl-X

L og Bfl-1), som aktivt forhindrer mitokondrier fra inducere celledød under genotoksisk og metaboliske påvirkninger, der forekommer i processen med tumorigenese [51,52].

Tab af pVHL har vist sig at resultere i øget NF-KB-aktivitet, hvilket indikerer, at aktivering af NF-KB kan udgør en fælles nedstrøms konsekvens af

VHL

-deficiency [15-17,33]. De Kaelin og Rettig laboratorier har givet mekanistisk indsigt i, hvordan pVHL mangel resulterer i øget NF-KB-aktivitet ved at belyse to forskellige veje for pVHL-afhængige NF-KB-regulering. Kaelin og kolleger identificeret NF-KB-aktivator CARD9 som pVHL-interagerende protein, og vist, at pVHL fremmet inhibitorisk phosphorylering af CARD9 af kinasen CK2. Ablation pVHL udtryk øget CARD9-drevet NF-KB-aktivitet, mens afskaffe CARD9 udtryk normaliseret NF-KB-aktivitet i pVHL-mangelfulde RCC indstillinger [17]. Sideløbende, An og Rettig fastslået, at tabet af pVHL gennem en HIF → EGFR autokrine loop, resulterer i øget NF-KB-aktivitet i ccRCC [16]. Begge mekanismer forbinde pVHL mangel for forhøjet NF-KB-aktivitet og tilvejebringer biokemiske forklaringer på vores observation, at forhøjet NF-KB korrelerer godt med VHL mutationsstatus.

En uventet resultat fra denne undersøgelse var den opdagelse, at en IFN signatur karakteriserer ccRCC. Den enkleste forklaring på denne signatur er, at det er den direkte følge af forhøjet NF-KB-aktivitet. Vi foretrækker denne forklaring af de grunde, (1) gener, der koder centrale knudepunkter i IFN-systemet, herunder IFN-β og IRF-7, indeholde funktionelle NF-KB steder i deres promotorer [53,54] og simpel aktivering af NF- KB kan køre disse promotorer [43,54]; (2) en 1: 1 korrelation blev fundet mellem ccRCC prøver, der indeholdt nukleart NF-KB og dem, der viste aktiveret STAT1, og (3) IFN signatur kollapser i celler, der mangler NF-KB-underenhed RelA (figur 7a).