PLoS ONE: Bezielle selektivt Mål Mitokondrier af kræftceller til at hæmme Glycolysis og OXPHOS

Abstrakt

Bezielle (BZL101) er en kandidat oral medicin, der har vist lovende effekt og fremragende sikkerhed i de kliniske tidlige fase forsøg for avanceret brystkræft. Bezielle er en vandig ekstrakt fra urten

Scutellaria barbata

. Vi har tidligere rapporteret, at Bezielle var selektivt cytotoksisk for kræftceller, mens besparende ikke-transformerede celler. I tumor, men ikke i ikke-transformerede celler, Bezielle inducerede generering af ROS og alvorlig DNA skader efterfulgt af hyperaktivering af PARP, udtynding af cellulære ATP og NAD, og ​​inhibering af glykolyse. Vi viser her, at tumorceller mitochondrier er den primære kilde af reaktive oxygenarter induceret af Bezielle. Behandling med Bezielle inducerer progressivt højere niveauer af mitokondriel superoxid samt peroxid-typen ROS. Hæmning af mitokondrie respiration forhindrer generation af begge typer af ROS og beskytter celler fra Bezielle-induceret død. Foruden glycolyse, Bezielle inhiberer oxidativ phosphorylering i tumorceller og udtømmer mitokondrie reservekapacitet fratager celler af evnen til at producere ATP. Tumorceller, der mangler funktionelle mitokondrier opretholde glykolytisk aktivitet i tilstedeværelse af Bezielle dermed støtte hypotesen om, at mitokondrier er det primære mål for Bezielle. De metaboliske virkninger af Bezielle mod normale celler er ikke signifikant, efter aftale med de lave niveauer af oxidative skader, Bezielle påfører dem. Bezielle er derfor et lægemiddel, der selektivt målretter cancercelle mitokondrier, og adskiller sig fra andre sådanne lægemidler ved dets evne til at inducere ikke kun hæmning af OXPHOS men også af glykolyse. Denne undersøgelse giver en bedre forståelse af mekanismen i Bezielle s cytotoksicitet, og grundlaget for dets selektivitet over for cancerceller

Henvisning:. Chen V, Staub RE, Fong S, Tagliaferri M, Cohen I, Shtivelman E (2012 ) Bezielle selektivt Mål Mitokondrier af kræftceller til at hæmme Glycolysis og OXPHOS. PLoS ONE 7 (2): e30300. doi: 10,1371 /journal.pone.0030300

Redaktør: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Canada

Modtaget: Juli 20, 2011; Accepteret: 12. december, 2011; Publiceret: 3 Feb 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev fuldstændig støttet af BioNovo, Inc. Ingen ekstern finansiering blev modtaget for denne undersøgelse. Den bidragyder spillet en rolle i beslutningen om at forske Bezielle som en anti-cancer middel, men havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser.: forfatterne erkender, at de er betalt medarbejdere og lager indehavere af BioNovo, Inc, og at denne undersøgelse i sin helhed, blev støttet af midler fra BioNovo. Bezielle (BZL101) er Bionovo proprietære botaniske lægemiddelkandidat (FDA-IND: 59.521) til behandling af metastatisk brystkræft. Bionovo s US patent nr 7.700.136 dækker en fremgangsmåde til behandling af brystcancer under anvendelse af en ekstrakt af Scutellaria barbata. Patentet omfatter også anvendelsen af ​​Bionovo proprietære BezielleR formulering som en monoterapi til behandling af brystcancer. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Bezielle (BZL101, FDA IND # 59,521) er et ekstrakt fremstillet fra antennen dele af urt

Scutellaria barbata Hoteller, som har anti-cancer egenskaber.

S. barbata

ekstrakt blev vist at have cytotoksisk aktivitet over for forskellige tumorcellelinjer

in vitro

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7 ], [8], [9], [10] og antitumoraktivitet

in vivo

[11], [12], [13] i modeller af nyre-, hepatocellulært og prostata carcinom. Vigtigere, to tidlige fase kliniske forsøg med Bezielle viste lovende effekt og fremragende sikkerhed til behandling af fremskreden brystkræft [14], [15]. I fase Ia klinisk forsøg seksten patienter, som alle gik gennem flere behandlingsterapier før indskrivning respons kunne evalueres. Fire patienter havde stabil sygdom i 90 dage (25%) og 3/16 havde SD for 180 dage (19%). Fem patienter havde objektiv tumorregression [15]. Efterfølgende lille skala eskalering forsøg med en forbedret formulering af Bezielle viste en tilsvarende lovende effekt [14]. Behovet for nye lægemidler til at bremse morbiditet og mortalitet af metastatiske cancere kan ikke understreges nok. Især er der et akut behov for oralt tilgængelige lægemidler med mindre toksicitet. Bezielle opfylder disse udækkede behov, og større kliniske undersøgelser til mere definitive data vedrørende sikkerhed og effekt er planlagt.

Vi har tidligere rapporteret, at Bezielle dræber selektivt tumorceller, mens besparende ikke-transformerede celler

in vitro

[8], [15]. Denne selektivitet kan redegøre for sin overlegne sikkerhedsprofil påvist i tidlige kliniske forsøg sammenlignet med andre godkendte cytotoksiske midler. Til dato analyser af de cellulære effekter af Bezielle har afsløret, at grundlaget for Bezielle selektivitet er induktionen af ​​høje niveauer af reaktive oxygenarter (ROS) i tumorceller, der er stærkt svækket i normale celler. ROS induceret af Bezielle forårsage omfattende DNA-skader og hyper aktivering af PARP-1 i tumorceller. Betydeligt, Bezielle inducerede et beskedent DNA-skader i ikke-transformerede celler, der blev repareret og ikke involverer en hyper aktivering af PARP [8]. I tumorceller, aktivering af PARP depleteret NAD + og ATP, der anvendes til at syntetisere poly-ADP ribose for PAR-ylation af et antal cellulære proteiner involveret i DNA beskadigelse reparation, transkriptionel styring og regulering af cellecyklussen [16], [17] , [18]. Udtømning af cytosoliske NAD + er mest sandsynligt årsagen til den efterfølgende selektiv hæmning af glykolyse [19], [20], [21], der er observeret i Bezielle behandlede tumor, men ikke i normale celler [8]. Inhibering af glykolyse og kollaps af redox-status (manifesteret i udtømning af NADPH og GSH i tumorceller behandlet med Bezielle) er den sandsynlige årsag til celledød udløst af Bezielle. Faktisk viser vores resultater, at Bezielle inducerer hovedsageligt nekrotisk død [8], som vides at være forbundet med hyperaktivering af PARP-1 [21], [22], [23]. En nylig detaljeret kombineret proteomisk og metabolomiske analyse af brystkræftceller behandlet med Bezielle afslørede induktion af oxidativt stress skader efterfulgt af omfordeling af metaboliske flux [24]. Specifikt blev tre familier af enzymer involveret i vedligeholdelse af redoxpotentiale påvirket af Bezielle: glutathion- og thioredoxin-relaterede proteiner og peroxiredoxins. Den største delmængde af proteiner, der berøres af Bezielle var dem involveret i metaboliske veje, herunder glykolysen, Krebs cyklus og fedtsyre stofskiftet. Disse data understøtter den hypotese, at Bezielle kritisk påvirker tumorceller metabolisme gennem oxidativ skade.

I denne undersøgelse har vi yderligere analyseret mekanismerne i Bezielle celledød og dens selektivitet. Vi rapporterer, at mitokondrier er den primære cellulære mål for Bezielle, og de tidligere beskrevne cellulære konsekvenser af behandling med Bezielle udløses gennem virkningerne af denne botanisk ekstrakt på mitokondrier. Ved at undersøge de metaboliske virkninger af Bezielle har vi fundet, at Bezielle hæmmer ikke kun glykolyse men også oxidativ fosforylering, hvilket kompromittere både cellulære energiproduktion veje.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

Bezielle ekstrakt blev fremstillet som beskrevet tidligere for den klinisk kvalitet materiale [15]. Kort fortalt blev tørret rå urt formalet til et fint pulver, tilsættes ved en 1:10 (vægt til volumen) for at forvarmet vand og kogt ved 80 ° C i 30 minutter. Supernatanten var adskilt fra de uopløselige faste stoffer ved centrifugering ved 5000 omdrejninger i minuttet, og genstand for en frysetørring. Det resulterende pulver blev opløst i vand ved 50 mg /ml og sterilfiltreret inden anvendelse.

diphenylen iodonium (DPI), N-acetyl-cystein, apocynin, FCCP (p-trifluormethoxy carbonyl cyanid phenyl hydrazon), antimycin A og andre kemikalier blev indkøbt fra Sigma. Fluorescerende indikatorer for ROS CM-H

2DCFDA og MitoSox Red var fra Molecular Probes /InVitrogen. Antistoffer mod PAR var fra Becton-Dickinson, til NOX4 fra Epitomics, at subunit 2 i mitokondrie kompleks IV fra Mitosciences, at LC3 fra Abgent, og at SQSTM fra Cell Signaling.

Cell kultur og behandlinger

Alle cellelinier blev opnået fra ATCC. MDAMB231 blev opformeret i RPMI med 10% FCS. MCF10A blev opformeret i DME /F12 med 5% FCS, 50 ug /ml hypofyse ekstrakt, 10 ug /ml insulin, 0,5 ug /ml hydrocortison og 0,02 ug /ml EGF (Sigma). Hs578T og SKBR3 celler blev dyrket i DMEM med 10% FCS. Fremstilling af den vandige ekstrakt af Bezielle blev beskrevet tidligere [8]. Celler blev behandlet med Bezielle ved 250 ug /ml (tørvægt per volumen), medmindre andet er angivet i de Figurtekster, eller med vand (mærket som “ubehandlet” i hele papir). Alle behandlinger med Bezielle blev udført i fuld vækst medier mangler pyruvat.

Måling af ROS

Friske lagre af ROS indikatorer CM-H

2DCFDA og MitoSox Red udarbejdet i DMSO ved en koncentration på 0,5 mM og fortyndet i varmt vækstmedier til koncentration på 2,5 uM. Mediet indeholder et af de indikatorfarvestoffer blev tilsat til cellerne. Efter inkubering af kulturerne med proberne i 20 minutter blev cellerne vasket med PBS, behandlet med trypsin og høstet til analyse ved FACS. Fluorescens fra CM-H

2DCFDA blev opsamlet på FL1 kanal, og for MitoSox Red på FL2 kanal. Hvert forsøg omfattede celler, som ikke blev udsat for behandling med Bezielle. Fluorescens niveauer af disse ubehandlede celler blev tildelt en arbitrær værdi på 1, og fluorescens af Bezielle behandlede celler er vist i figur som “fold forøgelse” i forhold til ubehandlede celler

lentivirus -. Medieret siRNA og genekspression

for NOX4 lyddæmpning, seks shRNA konstruerer i LKO plasmidvektoren blev købt fra Open Biosystems /Thermo. Vira blev produceret i HEK293 celler i overensstemmelse med producentens anvisninger og anvendes til at transducere celler, efterfulgt af udvælgelse i forudbestemte koncentrationer af puromycin.

Målinger af cellelevedygtighed, celletal og apoptose

Cell levedygtighed blev bestemt under anvendelse CCK-8 kit (Dojindo). Celledød analyse blev udført under anvendelse af Annexin V /propidiumiodidfarvning efterfulgt af flowcytometri. Cellerne blev opsamlet ved trypsinering i deres dyrkningsmedier, vasket med PBS og farvet med Annexin V- FITC (BioVision) og propidiumiodid (PI), og analyseret umiddelbart efter en 5 minutters inkubation ved hjælp af CellQuest software på FACScan (Becton Dickinson). ATP-niveauer blev kvantificeret med ATP bioluminscensassayet kit HS II (Roche Applied Science).

Kvantificering af reduceret glutathion med fluorescerende probe monobrombiman

Celler i plader med 96 brønde blev behandlet som ønsket behandling medier blev fjernet og substitueret med medier indeholdende 8 uM monobrombiman (MBB). Fluorescens blev læst på en pladelæser med filtre sat til excitation af 360 nm og emission ved 460 nm.

Western blot-analyse

Hele cellelysater blev elektroforeret på SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner . Membraner blev blottet med antistoffer ved de anbefalede koncentrationer natten over ved 4 ° C og blev påvist de bundne primære antistoffer ved anvendelse peroxidasekonjugerede sekundære antistoffer. Blots blev udviklet ved anvendelse SuperSignal forøget kemiluminescens-kit (Pierce) og afbildes på Kodak Imager ISR2000.

Comet assay

Comet assays blev udført ved anvendelse af Comet assay kit fra Trevigen ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev cellerne høstet, vasket og resuspenderet med PBS. Cellerne blev kombineret med smeltet, agarose med lavt smeltepunkt ved 37 ° C og pipetteret til Comet slides. Agarosen fik lov til at størkne ved 4 ° C i 30-40 min, og objektglas blev nedsænket i koldt lysis opløsning (Trevigen, Inc.) i 30 minutter ved 4 ° C. Objektglassene blev neddyppet næste i frisk fremstillet alkaliopløsning (300 mM NaOH og 1 mM EDTA) i 20 minutter og underkastet elektroforese i den samme alkalisk puffer ved 15 V (0,5 v /cm) og 300 mA i 25 minutter. Objektglas blev skyllet i vand og fikseret i 70% ethanol i 5 minutter. Efter lufttørring blev kernerne farvet med SYBR green (Trevigen, Inc.) og betragtes under et fluorescensmikroskop. Procenter af celler med kometer blev kvantificeret ved to observatører blindede til identiteten af ​​dias. Kerner blev også fotograferet og analyseret med TriTek CometScore billedanalysesoftware. Olive hale øjeblik, defineret som produktet af procentdelen DNA i halen og forskydning mellem positionen af ​​de gennemsnitlige centre af massen i hoved og hale, blev bestemt i mindst 40 celler pr prøve.

Metabolisk analyser med Seahorse XF96 Ekstracellulær Flux Analyzer

celler blev udpladet natten over på XF96 PET brønde 96 på eksperimentelt forudbestemte numre (10 × 10

3 celler pr for MDAMB231 og 12 × 10

3 celler pr for MCF10A). Metaboliske flusmidler blev analyseret på Seahorse XF96 analysator ifølge producentens instruktioner som beskrevet tidligere [25]. Basal ECAR (ekstracellulær forsuring sats, i mph /min), OCR (iltforbrug satser, i pmol O

2 /min) og PPR (normaliseret proton produktion sats, i nmol H + /min) blev målt i 4 cyklusser. Hver cyklus bestod af en 3 minutter media blandetid og en 5 minutters målinger tid. Efter måling af de basale niveauer af ECAR og OCR i 4 cyklusser blev mitokondrier afkobleren FCCP ved 1 uM automatisk injiceres i de eksperimentelle brønde for at kvantificere den maksimale respiration kapacitet, eller mitokondrisk reserve. Efter en cyklus af målinger inhibitor af mitokondriel kompleks III antimycin på 5 uM blev injiceret i de eksperimentelle brønde, og en anden målecyklus blev udført for at verificere, at oxygenforbruget var af mitokondrie oprindelse. Hvert eksperimentelt punkt var et gennemsnit på 6 til 10 replika brønde i hvert forsøg, og forsøg blev gentaget mindst 3-4 gange. Eksperimentelle data blev anset for acceptabelt, når variationer i pH-værdier mellem mix og måle cyklusser var mindre end 0,05-0,1 pH-enheder. Dette sikrede, at ECAR data ikke var kunstigt ændres ved ændringer i pH-værdier, og i virkeligheden nøje parallel ændringer i PPR-værdier. Normalisering af værdier opnået i XF96 assays blev udført under anvendelse kvantificering af cellulært DNA på eksperimentelle plader med CyQuant assay (Promega). Alle XF96 data er udtrykt som ECAR eller OCR værdier normaliseret til DNA-indholdet.

Resultater

rolle mitokondrier i induktion af ROS og celledød ved Bezielle

Vi har rapporteret tidligere, at Bezielle selektivt cytotoksisk over brystcancercellelinier men ikke til ikke-transformerede celler, såsom immortaliserede brystceller og primære fibroblaster, som er relativt resistent over for dets cytotoksiske virkning [8]. Vi har siden testet Bezielle s cytotoksicitet i over to snesevis af cancer cellelinjer og fire forskellige immortaliserede cellelinjer og primære celler. Vi observerede, at de ikke-transformerede celler i gennemsnit er langt mindre følsomme over for Bezielle at cancercellelinie (manuskript under udarbejdelse). Figur 1A illustrerer disse observationer med to cellelinjer: brystcarcinoma linje MDAMB231 og udødeliggjort epitelial linje MCF10A. Vi har observeret, at følsomheden over for Bezielle generelt ikke korrelerer direkte med proliferationshastighed af cellelinierne (data ikke vist). Således proliferationshastigheden af ​​de ikke-transformerede MCF10A celler er faktisk noget højere end for cancercellelinjer MDAMB231, og er meget højere end den for andre brystcancerceller linjer, der er følsomme over for Bezielle [8].

A. Bezielle inducerer celledød i tumorceller, men er mindre cytotoksisk over for ikke-transformerede brystceller. Brystcancercellelinje MDAMB231 og ikke-transformerede linje MCF10A blev behandlet med Bezielle i de angivne koncentrationer i 24 timer, og cellelevedygtighed blev kvantificeret under anvendelse af CCK-8 assay kit. Resultaterne er middelværdier ± S.E. (N = 4). B. Celler blev behandlet med Bezielle på 250 pg /ml for en halv time eller 6 timer, fyldt med ROS følsomme prober, og analyseret ved flowcytometri for grøn (H

2DCFDA) eller rød (MitoSox) fluorescens. Resultater er udtrykt som fold forøgelse af fluorescens i behandlede celler sammenlignet med ubehandlede probe-loaded celler. Resultaterne er middelværdier ± S.E. (N = 3). Væsentlige forskelle mellem MDAMB231 og MCF10A er angivet (** P 0,01). C. Western blot-analyse af MDAMBRho-0-celler udvalgt i lav koncentration af ethidiumbromid bekræfter fjernelsen af ​​mitokondrier kodet subunit 2 af respiration kompleks IV, og derfor inhibering af OXPHOS. D, Analyse af ROS induktion i Rho-0-celler udført som beskrevet i BE Analyse af celledød induktion ved Bezielle i Rho-0-celler udført som beskrevet i A. Væsentlige forskelle mellem de angivne grupper er angivet (* P 0,05; ** P. 0,01)

induktion af død i cancerceller ved Bezielle er en direkte konsekvens af induktion af ROS og oxidativt stress, fordi co-behandling med antioxidanter N-acetyl-cystein (NAC), eller pyruvat inhiberede DNA-skader og celledød [8]. Vi havde til formål at identificere de cellulære kilder til Bezielle-induceret ROS. Cellelinier blev behandlet med Bezielle for forskellige tidspunkter og fyldt med celle-permeable indikatorer for ROS CM-H

2DCFDA der bliver fluorescerende i afhængighed af peroxid-typen oxygenradikaler [26], eller MitoSox Red, stærkt selektive for mitokondrie superoxid [ ,,,0],27]. Vi har observeret en gradvis tidsafhængig stigning i ROS i brystcancercellelinier MDAMB231 og SKBR3, men ikke i MCF10A celler efter behandling med Bezielle (figur S1). Figur 1B illustrerer ROS-niveauer på 30 minutter og 6 timer efter behandling. Data er udtrykt som fold forøgelse af fluorescens over den, der ses i ubehandlede celler ladet med fluorescerende indikator. MDAMB231 produceret flere ROS end MCF10A celler, der allerede efter de første 30 minutter af inkubation med Bezielle, men med tiden forskellen i ROS-niveauer induceret i to cellelinien blev stadig mere udtalt. På seks timers behandling både peroxid og mitokondrie superoxid blev øget med cirka fem og seks gange, henholdsvis i MDAMB231 celler. Stigningen i ROS-niveauer i MCF10A var meget mere beskedent, og knap oversteget to gange i løbet af de basale ROS niveauer, selv efter 6 timers behandling (figur 1B). Det er muligt, at den kontinuerlige akkumulering af ROS i tumorcellelinier er direkte relevant for deres følsomhed over for Bezielle

Disse resultater stillede et spørgsmål om karakteren af ​​radikaler peroxid typen fremkaldt af Bezielle:. Nemlig ikke Bezielle inducerer både peroxid og superoxid, eller er peroxid blot et omdannelsesprodukt af mitokondrie superoxid? I betragtning af at superoxid er en kort levede arter af reaktive ilt, de høje niveauer af det observeret ved 6 timer sandsynligvis skyldes vedvarende generation af mitokondrier. De tilsvarende høje niveauer af peroxid typen ROS kunne følge af omdannelsen af ​​superoxid til peroxid af superoxiddismutase.

For at undersøge, hvilken rolle mitokondrie superoxid i celledød induceret af Bezielle, har vi ansat en velafprøvet metode af invaliderende mitokondrielle respiration ved dyrkning af celler i nærvær af ethidiumbromid. Efter dyrkning af cellerne i lav koncentration af ethidiumbromid i 6 uger, har disse celler (MDAMB231Rho-0) tabt ekspression af mitokondrielle proteiner kodet i mitochondriegenom som det ses i figur 1C, rendering mitokondrier ikke funktionelle. Dette blev også bekræftet ved at undersøge mitokondrie ilt forbrug af MDAMB231 Rho-0-celler, som var stærkt reduceret (se nedenfor, fig. 6). Rho-0-celler blev behandlet med Bezielle, og undersøgt for induktion af ROS og celledød. Figur 1D viser, at MDAMB231 Rho-0-celler, som forventet, ikke skaber mitokondrie superoxid som reaktion på Bezielle, hvilket bekræfter betydningen af ​​mitokondriel elektrontransport i induktionen af ​​ROS ved Bezielle. Niveauer af peroxid genereret i Bezielle behandlede Rho-0-celler blev noget forøget ved 30 minutters inkubation, men viste ingen yderligere stigning over tid (figur 1D), stærkt støtter vores forslag om, at høje peroxid niveauer kan skyldes i høj grad til konvertering af mitokondrie superoxid. Vigtigst blev MDAMB231 Rho-0-celler meget stærkt beskyttet mod celledød induceret af Bezielle (figur 1E), hvilket tyder centrale rolle mitokondrier i døden af ​​tumorceller behandlet med Bezielle.

Potentielle andre cellulære kilder til ROS fremkaldt af Bezielle

de ovenfor beskrevne stærkt implicerer mitokondrier genererede superoxid i Bezielle cytotoksicitet data. Men mens induktion af mitokondriel superoxid ved Bezielle blev fuldstændig forhindret i Rho-0-celler, CM-H

2DCFDA detekterbar peroxid typen ROS, som nævnt ovenfor, blev ikke helt afskaffet (figur 1D). Vi har overvejet muligheden for, at nogle andre cellulære enzymer, der kan producere peroxid eller ekstra-mitokondrie superoxid kan bidrage til oxidativt stress forårsaget af Bezielle. Vi har anvendt inhibitorer af adskillige cellulære enzymer, der producerer ROS: diphenylen iodonium (DPI) og apocynin til inhibering af NADPH oxidaser; allopurinol for at inhibere xantine oxidase, nordihydroguaiaretsyre (NDGA) at inhibere LOX og nitro-L-arginin-methylester (L-NAME) til at inhibere nitrogenoxid-syntase. MDAMB231-celler blev behandlet med Bezielle i nærvær af hver af disse inhibitorer, og omfanget af celledød samt ROS induktion blev kvantificeret i relevante assays. Ingen af ​​inhibitorerne reducerede ROS-niveauer i Bezielle-behandlede celler med undtagelse af DPI (ikke vist og figur 2A). Tilsvarende med undtagelse af DPI, ingen viste nogen beskyttende virkning på celledød (ikke vist).

A. MDAMB231-celler blev inkuberet med Bezielle i fravær eller nærvær af 0,75 uM DPI i 6 timer og undersøgt for ROS-produktion. B. celledød i MDAMB231cells behandlet med Bezielle i 24 timer i fravær eller nærvær af 0,75 uM DPI. Alle resultater i A og B er middelværdi ± S.E. (N = 3). Signifikant forskel (* P 0,05; ** P 0,01) mellem de angivne grupper er vist. C, celledød i brystcarcinomaceller SKBR3 behandlet med Bezielle i 24 timer i fravær eller nærvær af 0,75 uM DPI. Resultaterne er gennemsnit af to forsøg.

Figur 2A viser hæmning af både peroxid typen ROS og mitokondrie superoxid produktion af DPI i Bezielle-behandlede celler. Den observerede stærke hæmning af mitokondrie superoxid af DPI var uventet, da hæmning af NADPH oxidaser (NOX) ikke skal have en dybtgående indvirkning på mitokondrier, selv om nogle publicerede undersøgelser tyder eksistensen af ​​en cross-talk mellem Nox aktivering og mitokondrie produktion af superoxid [28], [29]. Men DPI blev også rapporteret at være en potent inhibitor af mitokondriel superoxidproduktion sandsynligvis gennem den ikke-specifikke inhibering af NADH-ubiquinon oxidoreduktase i mitokondrie kompleks I [30].

Ikke overraskende inhibering af Bezielle induceret ROS produktion ved DPI havde en beskyttende virkning på Bezielle-induceret celledød (figur 2B). Selvom DPI alene var noget cytotoksiske for celler, det stærkt svækket celledød induceret af Bezielle (figur 1E). For at udelukke muligheden for, at virkningerne af DPI behandling er et særligt træk ved MDAMB231-celler, har vi undersøgt effekterne af DPI på celledød i en yderligere brystcarcinoma-cellelinie SKBR3. De SKBR3-celler viste en endnu stærkere beskyttelse af DPI end MDAMB231, hvilket indikerer, at den beskyttende effekt af DPI mod Bezielle er ikke et isoleret fænomen (Figur 2C).

Vi har derfor undersøgt, om den ikke-fagocytisk NOX kendt udtrykkes i brysttumorer [29], [31] kunne være involveret i Bezielle cytotoksicitet. Resultaterne af disse forsøg er vist i figur S2. Kort fortalt selvom NOX4 synes at være opreguleret af Bezielle i tumorceller, delvis lyddæmpning af dets ekspression i MDAMB231 celler viste, at NOX4 producerede ROS spiller ikke en væsentlig rolle i celledød induceret af Bezielle.

Spørgsmålet, dog stadig forblev om mekanismen for mitokondrie ROS reduktion af DPI. Vi har fundet, at DPI, selv ved den lave koncentration anvendes her, inhiberer mitokondriel respiration (se nedenfor), og således i realiteten fungerer som inhibitor af OXPHOS, svarende til ablation af mitokondriefunktionen i Rho-0-celler.

Induktion af DNA-skader

Bezielle inducerer oxidative DNA-skader, der er afgørende for dens evne til selektivt at dræbe cancerceller [8]. Vi har undersøgt, hvordan mangel på funktionel mitokondrier og behandling med DPI påvirker induktion af DNA-skader ved Bezielle i MDAMB231 celler. Celler behandlet med Bezielle blev analyseret ved Comet assay for to parametre af DNA-skade: Procent af celler med beskadiget DNA, og oliven moment (som afspejler omfanget af DNA-skader i individuelle celler). Som det ses i figur 3A, behandling med Bezielle førte til progressivt stigende antal celler med DNA-skader i op til 6 timer. Efter dette tidspunkt, døde celler med delvist nedbrudt eller alvorligt beskadiget DNA begyndte akkumulering, hvilket gør kometen kvantificering vanskelig. Analyse af komet hale øjeblik (figur 3B) afslørede en stejl stigning i DNA-skade per celle induceret af Bezielle over tid. Den stigende mængde DNA skader per celle i en tidsafhængig måde korrelerer godt med den observerede stigning i ROS-niveauer (figur 2B).

A. MDAMB231 kontrolceller (MM231), MDAMB231 Rho-0 variant (RHO-) eller MDAMB231-celler i nærvær af DPI (+ DPI) blev behandlet med Bezielle for angivne tidspunkter og underkastet alkalisk Comet assay analyse. Resultaterne er vist som procentdele af celler, der danner kometer, middelværdi ± S.E. (N = 3). Signifikante forskelle (* P 0,05; ** P 0,01) mellem Rho-0 og kontrolgrupper, og mellem DPI-behandlede og kontrolgrupper er vist. B. Samme eksperimenter som i A, men de viste resultater er gennemsnitsværdier oliven øjeblikke af kometerne fremkaldt af Bezielle i tre cellepopulationer. Mindst 50 kometer blev analyseret pr hvert tidspunkt i fire separate forsøg. Signifikante forskelle (** P 0,01) blev observeret mellem kontrol celler og både Rho- og DPI-behandlede grupper. C. Procentdelen af ​​MCF10A celler viser DNA beskadigelse på forskellige tidspunkter efter inkubation med Bezielle, resultater er gennemsnit ± S.E. (N = 3). Signifikante forskelle (* P 0,05; ** P 0,01) mellem celler behandlet i 30 minutter sammenlignet med både 2 og 6 timer er vist. D. Western blot-analyse af PARP-aktivering (PAR) i de angivne celler behandlet med Bezielle i 1 time. Også vist er den manglende ekspression af mitokondrier kodede protein (kompleks IV subunit II) i Rho-0-celler, ekspression af mitokondrieprotein VDAC kodet i kerne-DNA, såvel som β-actin som et loading kontrol. E. MDAMB231-celler og MDAMB231-Rho-0-celler blev behandlet med Bezielle til de angivne tidspunkter og analyseret for tilstedeværelse af poly-ADP-ribosyleret proteiner. β-actin tjener som en loading kontrol.

I MDAMB231 Rho-0-celler, mindre end halvdelen af ​​cellerne i den behandlede population viste tilstedeværelsen af ​​DNA-skader, selv efter 6 timer (figur 3A), og oliven øjeblik analyse detekteret lave niveauer af DNA-skader per celle, der ikke stige over tid (figur 3B). Tilstedeværelse af DPI havde en begrænset effekt på antallet af celler med DNA-skader, men havde en stærk hæmmende effekt på stigningen i DNA-skader per celle over tid. Den svage virkning DPI om antallet af celler med DNA-skade kan være relateret til den svagere beskyttende virkning af DPI mod Bezielle induceret død sammenlignet med beskyttelse i Rho-0-celler (figur 1E og 2B).

Vi har også analyseret Bezielle inducerede DNA-skader i MCF10A celler, og har observeret, at selv i den fortsatte tilstedeværelse af Bezielle i vækstmediet blev DNA-skader i disse celler gradvist reduceres over tid (figur 3C). Vi foreslår, at meget lavere niveauer af ROS induceret i MCF10A celler (Figur 1B) førte til begrænsede niveauer af DNA-skade, der blev repareret med succes. Dette kunne forklare den afhængige reduktion gang i DNA beskadigelse i MCF10A celler.

Vi har dokumenteret hyper aktivering af PARP i tumorceller behandlet med Bezielle, og dets rolle i induktionen af ​​celledød. Vi har undersøgt, om PARP blev aktiveret i MDAMB231 Rho-0-celler eller i DPI-behandlede celler. Som vist i figur 3D, blev PARP kraftigt aktiveret i MDAMB231-celler. I Rho-0-celler, PARP-aktivering var signifikant mindre robust. I DPI-behandlede celler, Bezielle aktiveret PARP til niveauer mellem disse observeret i kontrol versus Rho-0-celler (Figur 3D). PAR-ylation af proteiner i MDAMB231-celler fortsatte i timer efter start af behandling med Bezielle, men i Rho-0-celler aktiveringen af ​​PARP var ikke kun meget svagere, men også forbigående art (figur 3E). I alt ovenstående data viser, at mangel på funktionelle mitokondrier stærkt hæmmet induktion af ROS, DNA skader, aktivering af PARP og celledød ved Bezielle. Vi konkluderer derfor, at mitokondrier er den primære cellulære mål for Bezielle.

Kræftceller behandlet med Bezielle gennemgå en kollaps af oxidativ forsvarssystem

Tidligere offentliggjort analyse af de transkriptionelle forandringer som følge af Bezielle i tumorceller [8] viste, at glutathion redox-systemet er engageret i det cellulære respons på Bezielle, en konklusion understøttes af de seneste proteom og metabolomiske analyser [24]. Således blev der observeret forhøjede ekspression af cystathionin-beta-syntase og glutamat cystein ligase modifier GCLM i Bezielle behandlede tumorceller, men ikke i ikke-transformerede celler. Derfor undersøgte vi niveauer af reduceret glutathion (GSH) i celler behandlet med Bezielle. Resultaterne i figur 4A viser en stærk og hurtigt fald i GSH i MDAMB231-celler. Niveauer af GSH blev noget reduceret i MCF10A, men faldet i GSH var forholdsvis mild og ikke opretholdes. På længere inkubationstider blev GSH næsten helt udtømt i MDAMB231 celler (ikke vist). GSH er en vigtig antioxidant, og konvertering af oxideret GSH (GSSG) til GSH kræver NADPH. Vi har derfor undersøgt niveauer af NADPH i celler behandlet med Bezielle. Selv efter kun 4 timer (figur 4B) var der en omfattende reduktion af NADPH i MDAMB231-celler. af tre uafhængige forsøg.