PLoS ONE: RY10-4 Hæmmer spredning af menneskelige leverkræft HepG2 celler ved at inducere apoptose in vitro og in vivo

Abstrakt

Denne undersøgelse havde til formål at undersøge den anti-tumor aktivitet RY10-4, en lille molekylær der er designet og syntetiseret baseret på strukturen af ​​protoapigenone. En tidligere screening undersøgelse viste, at RY10-4 besad antiproliferative virkninger mod HepG2 humane hepatocellulære carcinomceller. Imidlertid har det fulde sortiment af RY10-4 anti-cancer effekter på levertumorer og de underliggende mekanismer ikke blevet identificeret. Heri, anvender flowcytometri, og Western blot-analyse, viser vi, at RY10-4 kan inducere standsning af cellens cyklus, intracellulære reaktive oxygenarter (ROS) produktion og apoptose i HepG2-celler. I HepG2-celle xenograft tumor model, RY10-4 inhiberede signifikant væksten af ​​tumorer og induceret apoptose i tumorceller, med lidt bivirkninger. Desuden RY10-4 forårsagede undertrykkelse af STAT3-aktivering, som kan være involveret i apoptose induktion. Desuden RY10-4 inhiberede proliferationen af ​​Hep3B og HuH-7 humane hepatocellulære carcinomceller i en koncentrationsafhængig måde. Tilsammen vores resultater tyder på, at RY10-4 har et stort potentiale til at udvikle sig som kemoterapeutisk middel til leverkræft

Henvisning:. Zhang X, Wang Y, Han S, Xiang H, Peng Y, Wu Y, et al. (2016) RY10-4 Hæmmer spredning af menneskelige leverkræft HepG2 celler ved at inducere apoptose

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 11 (3): e0151679. doi: 10,1371 /journal.pone.0151679

Redaktør: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Oktober 20, 2015; Accepteret: 2. marts, 2016 Udgivet: 14. marts 2016

Copyright: © 2016 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 31.270.390, til YYW) og Natural Science Foundation i Hubei-provinsen (nr 2015CFC852, til XZ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ifølge den seneste globale kræft statistik, hepatocellulært carcinom er den tredje højeste årsag til kræft dødsfald på verdensplan [1]. Som en af ​​de store modaliteter kræftbehandling, kemoterapi har effektivitet i forlænge og forbedre livskvaliteten for patienterne [2]. Forskning af små molekylære forbindelser med anti-tumor aktivitet har store fordele for udvikling af nye kemoterapeutiske stoffer. Nogle små molekylære forbindelser, såsom piperlongumine [3] og obtusaquinone [4], målrettet og selektivt dræber kræftceller, kunne være lovende cancer terapeutiske midler.

Ved hjælp af naturlige produkter som ledende forbindelse er en nyttig og praktisk metode i lægemiddeludvikling. Baseret på strukturen af ​​et naturligt produkt protoapigenone blev RY10-4 designet og syntetiseret af Yuan

et al

. i vores laboratorium, og det viste potent anti-tumor aktiviteter mod multiple humane cancercellelinier [5]. Dens kemiske struktur var tæt på protoapigenone, mens dens anti-tumor-aktivitet blev forbedret og bivirkninger blev reduceret. De mekanismer, der medierer den anti-tumor aktiviteten af ​​RY10-4 inkluderet induktion af autofagi eller apoptose i human bryst- eller lungekræft cellelinier, henholdsvis [6,7]. I en tidligere screening undersøgelse viste RY10-4 bemærkelsesværdige anti-proliferative virkninger på HepG2 humane hepatocellulære kræftceller

in vitro

, og hæmmede væksten af ​​musen hepatocellulær H22 tumor

in vivo

[5] . Men yderligere forskning er nødvendig for fuldt ud at forstå de anti-tumor effekt af RY10-4 i leverkræft og dens potentielle virkningsmekanisme. Her vil vi vise, at RY10-4induces apoptose i HepG2 liver kræftceller både

in vitro

in vivo

, og derved har evnen til at undertrykke levertumorer.

Materialer og Metoder

Regents og antistoffer

RY10-4 ( 95%), som tidligere var forberedt i vores laboratorium, som beskrevet af Yuan et al. [5]. Sulforhodamin B (SRB) blev købt fra J K Scientific (Beijing, Kina). Dimethylsulfoxid (DMSO) og N-acetylcystein (NAC) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hoechst 33342, propidiumiodid (PI), reaktive oxygenspecies assaykit (DCFH-DA), RIPA-lysepuffer, BCA proteinassaykit, og BeyoECL plus kemiluminescenskittet blev opnået fra Beyotime Inc. (Shanghai, Kina). Annexin V-FITC /PI apoptose afsløring kits blev købt fra Keygen Biotech (Nanjing, Kina). Specifikke antistoffer mod Bcl-2, Bax, p53, cyclin E, CDK2, spaltet caspase3, actin, STAT3, p-STAT3, p21, GAPDH og tilsvarende sekundære antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).

Cellelinie og cellekultur

Humant hepatocellulær cancer HepG2, Hep3B og HuH-7 cellelinier blev indkøbt fra Kina center for Type Culture Collection, CCTCC). Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Hyclone) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS, Hyclone) og antibiotika (100 ug /ml streptomycin og 100 IU /ml penicillin), i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

SRB-assay

cellelevedygtigheden blev målt ved SRB-assay som beskrevet tidligere [6]. Kort fortalt blev HepG2-celler podet i 96-brønds dyrkningsplader (5000 celler per brønd), og behandles med en række koncentrationer af RY10-4. Efter behandlingen blev cellerne fikseret med 10% trichloreddikesyre i 1 time ved 4 ° C, og vasket med 1% eddikesyre. De fikserede celler blev farvet med 0,4% SRB i 15 minutter, vasket fire gange og efterladt til tørring ved stuetemperatur. Det bundne farvestof blev opløseliggjort med Tris-base-opløsning, og absorbansen ved 540 nm blev registreret ved anvendelse af en mikropladelæser (BioTek Instruments, Inc. USA). At undersøge rollen af ​​ROS i RY10-4-induceret celledød blev HepG2-celler forbehandlet med ROS scavenger NAC (5 mM) i 2 timer efterfulgt af behandling med RY10-4 og cellelevedygtigheden blev målt.

klongenicitetsassayet

HepG2 celler i eksponentiel vækstfase blev podet i plader med 6 brønde (1000 celler per brønd), og fik lov til at klæbe. Efter behandling med serielle koncentrationer af RY10-4 i 24 timer, blev cellerne dyrket i frisk medium uden stoffer indtil synlige kolonier dannet. Cellen kolonier blev derefter fikseret med 4% paraformaldehyd og farves med 0,5% krystalviolet farvning løsning.

Cell cyklus analyse

For cellecyklus analyse fase distribution af DNA-indholdet blev bestemt ved anvendelse af PI farvning. Efter behandling med 0, 0,9, 1,8, og 2.7μM af RY10-4 i 24 timer, HepG2-celler blev høstet og fikseret med 70% ethanol natten over ved -20 ° C. Derefter blev cellerne vasket og farvet med PI-farvning (50 ug /ml PI og 10 ug /ml RNase) i 30 minutter i mørke. Fordelingen cellecyklus blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse Cell-Quest software (Becton Dickinson, USA).

Måling af intracellulær ROS produktion

DCFH-DA blev anvendt som en fluorescerende probe til måling af intracellulær ROS-produktion ved flowcytometri. Kort fortalt blev HepG2-celler udsået i 6-brønds plader. Efter adhæsion, blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af RY10-4. Derefter blev mediet fjernet, og cellerne blev inkuberet med 10 pM DCFH-DA i 20 minutter i mørke. De farvede celler blev opsamlet og analyseret ved flowcytometri (Becton Dickinson, USA). I nogle forsøg blev cellerne forbehandlet med ROS scavenger NAC.

Apoptose detektion

HepG2 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af RY10-4 og analyseret for apoptose ved anvendelse af enten Hoechst 33342-farvning eller Annexin V-FITC /PI. Kort fortalt, efter behandlingen blev celler farvet med Hoechst 33342 i 10 minutter ved stuetemperatur, derefter vasket og observeret under et fluorescerende omvendt mikroskop (Nikon Eclipse, Japan). Alternativt blev cellerne opsamlet og farvet med Annexin V-FITC /PI apoptose detektion kit ifølge producentens protokol; De apoptotiske celler blev påvist ved flow cytomety (Becton Dickinson, USA).

Western blot assay

Proteinekspression blev bestemt ved Western blot. Kort fortalt blev totale proteiner ekstraheret ved RIPA lysebuffer indeholdende 1% phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) og 1% cocktail. Proteinerne blev separeret ved SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran (Bio-Rad). Membranen blev blokeret med 5% fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet med et specifikt primært antistof natten over ved 4 ° C. Membranen blev derefter vasket og inkuberet med et tilsvarende sekundære antistof i 2 timer ved stuetemperatur. Det specifikke protein-antistof-kompleks blev visualiseret ved ECL plus kemiluminescenskittet.

Nude mus xenograftmodel

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Etisk Komité Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi, Kina . Alle forsøgsdyr modtog pleje i overensstemmelse med de af Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Fire- til fem uger gamle BALB /c nøgne mus (nr 4304701485) blev købt fra Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Hunan, Kina). Musene blev huset under specifikke patogenfrie betingelser med fri adgang til gnaverfoder og vand ved 20-22 ° C med 12 timers lys-mørke-cyklus, og akklimatiseret i en uge før eksperimentet. Derefter HepG2-celler (2 x 10

6) injiceret subkutant i hver mus. Når mængden af ​​etablerede tumorer nåede 100-200 mm

3, musene blev randomiseret i følgende grupper: saltvand kontrol, lavdosis RY10-4 (5 mg /kg) behandlede gruppe, og højdosis RY10-4 (50 mg /kg) behandlede gruppe. Kropsvægt og tumorvolumen af ​​dyrene blev målt en gang om ugen. blev observeret Musene dagligt for sårdannelse, abdominal hævelse, afmagring og /eller andre tegn på nød. Når en mus præsenterede ovennævnte symptom (er) og man mente, at musen ikke ville overleve, var aflivet, og dødstidspunktet blev registreret. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af formlen: V =

ab

2/2 (

en

,

b

er tumor længde og bredde, henholdsvis). Den relative tumor volumen (RTV) = V

t /V

0, hvor V

0 er tumor volumen målt på tidspunktet for det første lægemiddel administration og V

t repræsenterer hver tumor måling efter behandlingen. Ved den eksperimentelle endpoint blev alle musene aflivet ved cervikal dislokation under etherbedøvelse.

Histopatologi og immunhistokemi analyse

En del af tumorvævet prøven blev fikseret med 4% paraformaldehyd og indlejret i paraffin. Vævssnit (4 mm) blev fremstillet og farvet med hematoxylin /eosin (H cellevækstinhibering forholdet blev bestemt ved SRB-assay, og IC

50 værdien var 1,88 uM. (B) HepG2-celler blev podet i en meget lav densitet, og behandlet med RY10-4 i 24 timer. Derefter blev cellerne dyrket i frisk medium uden stoffer til at danne kolonier. Kolonien dannelse ratio (% af kontrol) blev beregnet.

RY10-4 induceret cellecyklusstop i HepG2-celler

cellecyklus distribution af HepG2 celler efter RY10-4 behandling var vurderet ved analyse af DNA-indhold ved hjælp af PI farvning. Som vist i fig 2A og 2B, RY10-4 ved koncentrationer på 0,9, 1,8, og 2,7 uM inducerede en signifikant stigning i procentdelen af ​​celler i S-fase. Også 2,7 uM RY10-4 inducerede en bemærkelsesværdig stigning i G2 /M-fase (

P

= 0,0127). Western blot analyse viste, at ekspressionen af ​​cellecyklus-relaterede proteiner cyclin E og CDK2 i HepG2-celler blev reduceret med RY10-4 behandling (fig 2C).

(A) Celler blev behandlet med 0, 0,9, 1,8 og 2.7μM RY10-4 i 24 timer, og DNA-indholdet blev analyseret ved anvendelse propidiumiodidfarvning og flowcytometri. (B) cellecyklus distributioner, præsenteret som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. (C) Efter behandlingen med RY10-4, udtryk for cellecyklus-relaterede proteiner cyklin E og CDK2 blev analyseret ved Western blot.

RY10-4 induceret intracellulær ROS produktion i HepG2-celler

Den intracellulære ROS produktionen blev detekteret ved anvendelse oxidation følsomme fluorescerende probe DCFH-DA. Som vist i fig 3A, efter behandling med angivne koncentrationer af RY10-4, det intracellulære ROS-produktion blev dramatisk forøget i HepG2-celler. Der blev set en koncentrationsafhængig måde, og forbehandling med NAC (5 mM) i 2 h næsten fuldstændig vendt RY10-4-induceret ROS produktion i HepG2-celler (Fig 3B). Konsekvent, forbehandling med NAC også forhindret cellelevedygtigheden fald induceret af RY10-4 (Fig 3C).

(A) HepG2-celler blev behandlet med angivne koncentrationer af RY10-4, og den intracellulære ROS-produktionen var detekteret som beskrevet i Methods. (B) De intracellulære ROS niveauer (% af kontrol), der præsenteres som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. (C) HepG2-celler blev behandlet med RY10-4 i fravær eller nærvær af NAC forbehandling; cellelevedygtigheden blev bestemt ved SRB-assay.

RY10-4 induceret apoptose i HepG2-celler

fluorescens farvning af kerner og Annexin V-FITC /PI-farvning blev udført for at påvise apoptose i HepG2-celler. Fig 4A viste, at efter blev observeret behandling med angivne koncentrationer af RY10-4, kondenserede kerner og apoptotiske legemer i HepG2-celler ved farvning med Hoechst 33342. Annexin V-FITC /PI-farvning viste også, at RY10-4 induceret apoptose i en koncentrationsafhængig måde (fig 4B). Sammenligning med kontrolgruppen, blev procentdelen af ​​apoptotiske celler signifikant forøget i RY10-4-behandlede grupper (fig 4C). Desuden apoptose-relaterede proteiner p53, Bcl-2, Bax, og spaltes caspase-3 blev analyseret ved Western blot. Som vist i fig 4D, ekspressionen af ​​anti-apoptotiske protein Bcl-2 faldt efter behandling med RY10-4, mens ekspressionen af ​​p53, Bax og spaltes caspase-3 steg på en koncentrationsafhængig måde. Taget sammen antyder disse resultater, at RY10-4 kan inducere apoptose i HepG2-celler. Salg

(A) Celler blev behandlet med angivne koncentrationer af RY10-4 i 24 timer, og kernerne blev farvet af Hoechst 33342. Pile angiver kondenseret og fragmenterede kerner. (B) Flowcytometri assay til påvisning apoptose i HepG2-celler ved anvendelse af Annexin V /PI-farvning. Repræsentative flowcytometri profiler er vist. (C) Procentdelen af ​​apoptotiske celler, præsenteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. (D) Ekspression af apoptose-relaterede proteiner blev analyseret ved Western blot i HepG2-celler ubehandlede eller behandlet med RY10-4.

Anti-tumor aktiviteten af ​​RY10-4 i HepG2 celle xenograftmodel

antitumorvirkning af RY10-4

in vivo

blev evalueret under anvendelse af en nøgen mus xenograft model. Alle mus overlevede gennem hele forsøget periode, og de blev aflivet under etherbedøvelse på forsøgsstadiet endepunkt. Som vist i fig 5A, behandling med RY10-4 resulterede i bemærkelsesværdig vækstinhibering af HepG2-celle xenotransplantattumorer sammenlignet med saltvandsbehandlede kontrolgruppe. Ved afslutningen af ​​forsøget, tumorvolumen var 1326 ± 407 mm

3, 530 ± 201 mm

3 og 411 ± 108 mm

3 i kontrolgruppen, lavdosis-RY10-4 behandlingsgruppe og højdosis RY10-4 behandlingsgruppen hhv. Den gennemsnitlige tumorvolumen i kontrolgruppen nåede næsten syv gange af den oprindelige mængde, mens tumorerne i behandlingsgrupperne blev forhøjet kun omkring to gange i forhold til det oprindelige volumen (Fig 5B). Vi analyserede også ekspressionen af ​​apoptose-relaterede proteiner bcl-2 og Bax i tumor vævsprøver fra hver gruppe ved immunhistokemi og Western blot. Som vist i fig 5C og 5D, sammenlignet med kontrolgruppen, ekspression af det anti-apoptotiske protein Bcl-2 faldet, mens pro-apoptotisk protein Bax steg både ved lave og høje doser af RY10-4. HE-farvning viste også store områder af tumorcelledød i behandlingsgrupperne (Fig 5e). Disse resultater antydede, at RY10-4 kunne fremkalde hepatocellulær tumor apoptose

in vivo

. Kroppen vægt i hver gruppe ikke ændre sig væsentligt i løbet af forsøget (Fig 5F), og RY10-4 behandling påvirkede ikke blod biokemiske indekser af tumor-bærende nøgne mus (S1 Table), hvilket tyder på, at RY10-4 formentlig har lidt side effekter

in vivo

.

(A) Repræsentative xenotransplantattumorer opnået fra kontrol mus og mus behandlet med RY10-4. (B) Den relative tumorvolumen (RTV) blev beregnet ifølge formlen i Methods. (C og D) Ekspression af Bcl-2 og Bax i tumorvæv blev analyseret ved immunfluorescensfarvning og Western blot. (E) HE-farvning blev udført for patologisk undersøgelse af tumorvæv i forskellige grupper. (F) De gennemsnitlige kropsvægt af mus i hver gruppe blev evalueret.

De molekylære mekanismer apoptose induktion ved RY10-4 i HepG2-celler

Siden STAT3 regulerer ekspressionen af ​​forskellige tumorvækst relateret onkogene gener og spiller en central rolle i celleproliferation [9], undersøgte vi, om RY10-4 kan regulere konstitutiv STAT3-aktivering i HepG2-celler. Som vist i figur 6A, RY10-4 inhiberede konstitutiv phosphorylering af STAT3 (Tyrosin 705) i HepG2-celler. RY10-4 opreguleret ekspression af p21, som kan være involveret RY10-4-induceret cellecyklusstandsning. Desuden IL-6 (10 ng /ml) omvendt RY10-4-induceret STAT3 inaktivering, efterfulgt af en stigning i cyclin E-ekspression i RY10-4-behandlede HepG2-celler (figur 6B). Desuden forbehandling med NAC inhiberede STAT3 ophævelsen og p53 stigning skyldes RY10-4 i HepG2-celler (figur 6C).

(A) HepG2-celler blev behandlet med angivne koncentrationer af RY10-4, og udtrykket p-STAT3 og p21 blev analyseret ved Western blot. (B) HepG2-celler blev behandlet med RY10-4 med eller uden IL-6-stimulering; ekspression af p-STAT3 og cyclin E blev analyseret ved Western blot. (C) HepG2-celler blev behandlet med RY10-4 i fravær eller nærvær af NAC forbehandling. Udtrykket af p-STAT3 og p53 blev analyseret ved Western blot.

Anti-proliferative virkninger af RY10-4 på andre hepatocellulært carcinom cellelinjer

For at observere anti-proliferative virkninger af RY10-4 imod andre menneskelige leverkræft cellelinjer, vi vælger Hep3B og HuH-7 hepatocellulært carcinom cellelinjer. Som vist i fig 7A, RY10-4 inhiberede proliferationen af ​​Hep3B og HuH-7-celler i en koncentrationsafhængig måde, og Hep3B celler var mere følsomme. Dernæst vi påvises udtryk for apoptose-relaterede proteiner i RY10-4-behandlede Hep3B celler. Som vist i fig 7B, efter behandling med RY10-4, ekspressionen af ​​p53 og Bax steget, mens ekspressionen af ​​Bcl-2 faldt.

(A) Hep3B eller Huh-7 celler blev behandlet med serie koncentrationer af RY10-4 blev og cellevækstinhiberingen forhold bestemt af SRB assay. (B) Hep3B celler blev behandlet med RY10-4, og udtrykkene for apoptose-relaterede proteiner p53, blev Bcl-2 og Bax analyseret ved Western-blot.

Discussion

naturprodukt protoapigenone og flere af dets derivater har vist potente anti-tumor effekt mod visse af menneskelige kræftceller [10,11]. Protoapigenone kunne betragtes som et nyttigt blyforbindelse at opdage nye kemoterapimidler. I vores laboratorium blev RY10-4 designet og syntetiseret som et protoapigenone analog, som et forsøg på at udvikle et hidtil ukendt anti-tumor-forbindelse. Ifølge nogle tidligere undersøgelser og rapporter [12,13], RY10-4 havde potente antitumoraktiviteter mod humane brystcancerceller. I en anden rapport, kunne RY10-4 fremkalde autophagic celledød i MCF-7 celler, mens protoapigenone ikke kunne [6]. Desuden Xue

et al

. rapporterede, at RY10-4 inducerer apoptose og inhiberer invasion i humane lungecancer A549-celler ved at hæmme STAT3 signalering [7]. Disse undersøgelser viser, at RY10-4 har et stort potentiale som en ny antitumormiddel.

I den foreliggende undersøgelse vurderede vi den antitumoraktiviteten af ​​RY10-4 i leverkræft. Resultaterne viste, at RY10-4 effektivt inhiberede proliferation af HepG2 liver cancerceller

in vitro

med IC

50 værdi på 1,88 uM. Endvidere blev klongenicitetsassayet udført for at bestemme de langsigtede virkninger af RY10-4 på HepG2-celler. Klongenicitetsassayet korrelerer godt med assayet af tumorigenicitet

in vivo

, og det har vist prædiktiv værdi i kemosensitivitet test af antitumormidler [14]. Vores resultater viste en koncentrationsafhængig hæmning i clonogenicity i RY10-4-behandlede HepG2-celler (figur 1 B), hvilket antyder, at RY10-4 har en helbredende potentiale mod hepatocellulær cancer.

Induktion af cellecyklus og apoptose er de centrale virkningsmekanismer af mange anti-tumor agenter. Det er blevet rapporteret, at protoapigenone og dets analoger samt RY10-4 kan forårsage cellecyklusstop og apoptose i nogle humane cancercellelinier [13,15-17]. Her analyserede vi cellecyklusfordeling og apoptose af HepG2-celler efter behandling med RY10-4. Vi fandt, at RY10-4 kunne inducere standsning af cellecyklus i S og G2 /M-faser, hvilket kan tilskrives nedregulering af cellecyklussen-relaterede proteiner cyclin E og CDK2 (fig 2). Desuden Hoechst 33342-farvning og Annexin V-FITC /PI-farvning viste, at RY10-4 inducerede også koncentrationsafhængig apoptose i HepG2-celler (figur 3). P53 er et af de vigtigste tumorsuppressorer og målretning p53 familie proteiner kan vise sig terapeutisk anvendelige [18,19]. P53 kan stimuleres af hypoxi, kræftfremkaldende stoffer, oxidativt stress og andre stressfaktorer, overtalelse cellecyklusstop eller apoptose

via

flere veje [20]. Bcl-2 familie proteiner, herunder pro- og anti-apoptotiske regulatorer, spiller også en vigtig rolle i apoptose induktion og celleoverlevelse [21,22]. Desuden caspasefamilien proteiner, såsom caspase-3 er udøvere af apoptose og aktivering af caspaser vil initiere apoptose [23]. Efter behandling med RY10-4, ekspressionen af ​​p53, Bax og spaltes caspase-3 steg, mens ekspressionen af ​​Bcl-2 faldt i HepG2-celler (figur 3D). Disse resultater viser, at induktion af apoptose kan være den underliggende mekanisme af antitumoraktivitet for RY10-4 mod humane hepatocellulær cancer HepG2-celler.

overbevisende beviser tyder på, at ROS er impliceret i en række cellulære programmer og spiller en nøglerolle i humane fysiologiske og patologiske processer [24]. Cancerceller udviser sædvanligvis højere basale niveauer af ROS, der har en anden redox status sammenligning med normale celler, og høje niveauer kan ROS ofte skader cellerne [25,26]. Derfor inducerer ROS produktion i kræftceller kan have en positiv terapeutisk effekt. Forbindelser som piperlongumine, obtusaquinone og psoralidin inducerer ROS produktion og derved hæmme proliferation af humane cancerceller [3,4,27]. I denne undersøgelse har vi påvist, at RY10-4 induceret intracellulær ROS produktion, hvilket kunne vendes ved forbehandling med NAC i HepG2-celler. Også RY10-4-induceret celledød blev delvist forhindres ved forbehandling NAC (figur 4). Disse resultater antyder, at ROS-produktion kan spille en vigtig rolle i RY10-4-induceret HepG2 celledød. Forholdet mellem RY10-4-induceret apoptose og ROS produktionen vil blive yderligere undersøgt i en opfølgende undersøgelse. Talrige vidnesbyrd viser, at STAT3 spiller en central rolle i udviklingen og progressionen af ​​mange humane tumorer, og undertrykkelse af STAT3-aktivering fører til væksthæmning og apoptose i tumorcellelinjer samt muse xenograftmodeller [9,28]. I vores undersøgelse fandt vi, at RY10-4 undertrykt STAT3-aktivering i HepG2-celler, og virkningen var afhængig af ROS-generering (Fig 6). Tilsammen kan ROS afhængige inaktivering af STAT3 være den molekylære mekanisme for RY10-4 for sin anti-levertumor aktivitet.

Generelt kun kliniske forsøg kan i sidste ende afgøre, om en ny agent er effektivt til kræftbehandling i patienter. Men der er mange etiske, medicinske og økonomiske begrænsninger og begrænsninger til kliniske forsøg, og derfor et praktisk eksperimentelt system er af stor betydning for screening anticancer narkotika [29]. Den nøgne mus xenograftmodel normalt anvendes til at vurdere den biologiske aktivitet af anticancermidler

in vivo

[30,31]. Humane kræftceller kan vokse som xenografter i en immundefekte mus. I nogen grad, denne model er nyttig til at forudsige klinisk respons på lægemiddelterapi. Her etablerede vi HepG2 celle xenograftmodel at evaluere antitumoraktivitet af RY10-4. Vi fandt, at RY10-4 apoptose på tumor og signifikant hæmmet dens vækst

in vivo

(figur 5). Desuden RY10-4 sandsynligvis kun har mindre bivirkninger

in vivo

, da det ikke påvirke dyrenes kropsvægt og blod biokemiske indekser.

Som konklusion, dette papir viser, at RY10-4 kan bemærkelsesværdigt hæmme proliferation af humane leverkræft HepG2-celler både

in vitro

in vivo

. Induktion af apoptose kan være den underliggende mekanisme for sin anti-tumor aktivitet. RY10-4 undertrykte liver tumorvækst

in vivo

uden væsentlig hæmatologisk toksicitet, hepatotoksicitet eller nefrotoksicitet. Desuden RY10-4 inhiberede proliferationen af ​​Hep3B og HuH-7 humane hepatocellulære carcinomceller i en koncentrationsafhængig måde. Disse resultater tyder på, at RY10-4 har et stort potentiale som en ny kemoterapeutisk middel til leverkræft.

Støtte Information

S1 Table. Komplet blodtælling og biokemiske profil for den nøgne mus efter behandling med RY10-4 i 4 uger (gennemsnit ± SD, n = 8)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0151679.s001

(DOCX)