PLoS ONE: ADAM-12 som en diagnostisk markør for spredning, migration og invasion i patienter med småcellet Cancer

Abstrakt

Lille celle lungekræft (SCLC) er meget aggressiv og er kendetegnet ved ondartet metastaser . Ca. 90% af patienterne dør på grund af omfattende metastase. Den ekstracellulære matrix (ECM) er en naturlig barriere, der kan forhindre cellulær invasion og metastase. Derfor skal nedbrydning af ECM finde sted, for omfattende metastase at forekomme. En disintegrin og metalloprotease (ADAM) er en multi-domæne protease, som spiller en vigtig rolle i tumorigenese, samt tumorudvikling, invasion og metastase. Imidlertid har der været få rapporter om udtryk og rolle for Adams i SCLC. I den aktuelle undersøgelse, udtryk og rolle Adams live i SCLC spredning, blev invasion og metastase undersøgt. I alt 150 SCLC-vævsprøver blev undersøgt ved immunohistokemi for ADAM’er ekspression. ADAM-12 viste sig at være rigeligt udtrykt i 72,67% prøver og andre ADAM’er fandtes at blive udtrykt i 10% til 40% af prøverne. ADAM-12 niveauer i serum og urin, fra 70 SCLC patienter og 40 normale kontroller, blev også målt ved hjælp af ELISA. ADAM-12-ekspression var signifikant højere i SCLC patienter end hos raske kontrolpersoner og patienter med udbredt sygdom i forhold til dem med mere begrænset sygdom. Silencing ekspressionen af ​​ADAM-12 i H1688-celler ved anvendelse af specifikke siRNA væsentligt reduceret cellulær proliferation, invasion og metastase. Supplering af ekspressionen af ​​ADAM-12-L eller -S i H345 celler, væsentligt forbedret cellulær proliferation, invasion og metastase. Dyremodeller med metastatisk SCLC også udviste forøget ekspression af ADAM-12 langs med forøget invasion og metastase. Kort sagt, ADAM-12 er en uafhængig prognostisk faktor og diagnostisk markør, og er involveret i proliferation, invasion og metastase af SCLC

Henvisning:. Shao S, Li Z, Gao W, Yu G, Liu D , Pan F (2014) ADAM-12 som en diagnostisk markør for spredning, migration og invasion i patienter med småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (1): e85936. doi: 10,1371 /journal.pone.0085936

Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University, Taiwan

Modtaget: September 20, 2013; Accepteret: December 3, 2013; Udgivet: 21 Jan 2014

Copyright: © 2014 Shao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81.302.017). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lille celle lungekræft (SCLC) er den mest ondartede af alle lungekræfttilfælde. De fem-års overlevelse er kun 3-8% på grund af den udbredte metastaser i den tidlige fase og tilbagefald, der opstår, når modstand mod de behandlinger udvikler [1]. Tidligere har nedbrydningen af ​​den ekstracellulære matrix (ECM) været hovedfokus undersøgelser af invasionen og metastase af SCLC [2], [3]. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) er blevet påvist i SCLC, og høje ekspressionsniveauer af MMP-11 og -14 er blevet identificeret som uafhængige negative prognostiske faktorer i SCLC [4]. Af MMP’er er blevet anvendt klinisk til SCLC patienter, men viste sig at være ineffektiv og ikke forbedre de fem-års overlevelse på de [5] patienter. Dette antyder, at nedbrydningen af ​​ECM er en kompleks proces, og at proteaser, andre end MMP’er, bør undersøges for at fastslå, om andre faktorer spiller en rolle i SCLC.

En disintegrin og metalloprotease (ADAM) tilhører protease familie. ADAM’er kan nedbryde ECM og kaste membranbundne forstadier, som modulerer celle-celle- og celle-matrix-interaktioner [6]. ADAMS opdelt i to grupper: membran-forankret ADAM og udskilles typen ADAM. Udskilt typen ADAM indeholder thrombospondin motiver og kaldes også en disintegrindomæne og metalloprotease med thrombospondin Motiver (ADAMTS). Adams og ADAMTS kan forringe ECM og kaste forstadier og dermed fremme invasion og metastase. Forøget ekspression af Adams og ADAMTS er blevet påvist i talrige tumorer. ADAM-8, -12, -15 og -28 er stærkt udtrykt i ikke-småcellet lungecancer [7], [8], [9], [10], ADAM-9, -12, -17 og -23 er højt udtrykt i brystkræft [11], [12], [13], [14] og ADAM-9, -12 og -17 er højt udtrykt i leverkræft [15], [16], [17]. ADAMTS4 og ADAMTS5 er blevet rapporteret at være involveret i den metastatiske proces ved at spalte brevican i glioblastomer [18]. Interessant nok blev ADAMTS1 fuldlængde fundet at fremme invasion og metastase ved kaste heparinbindende epidermisvækstfaktor (HB-EGF) og amphiregulin, men ADAMTS1 fragment viste en anti-metastatisk funktion [19]. SCLC er en stærkt aggressiv tumor. Ca. 90% af patienterne dør som følge af omfattende metastase. Derfor er det vigtigt, at en diagnostisk markør kan identificeres, og en prognostisk faktor vurderes for SCLC patienter. I øjeblikket er der ingen effektiv diagnostisk markør for SCLC. Der har været få undersøgelser der undersøger rolle for Adams udtryk i SCLC, med undtagelse af ADAM-15 [8]. Baseret på den potentielle betydning af den rolle for Adams i at fremme spredning, metastase og angiogenese, vi havde til formål at vurdere ekspressionsniveauerne af Adams og deres forhold til den kliniske prognose i SCLC for at identificere en effektiv diagnostisk markør.

i nærværende undersøgelse fandt vi, at ekspressionen af ​​ADAM-12 var højere i SCLC end andre ADAM’er via immunhistokemi (IHC). Univariate og multivariate overlevelse analyse viste, at ADAM-12 var en uafhængig prognostisk faktor for SCLC patienter. Ekspressionsniveauet af ADAM-12 i serum og urin var højere hos SCLC patienter sammenlignet med raske kontroller, såvel som i patienter med udbredt sygdom sammenlignet med dem med begrænset sygdom. Dyremodeller demonstrerer høj metastase af SCLC også havde øget ekspression af ADAM-12 og forstærket invasion og metastase. Vores resultater støttede den konklusion, at meget præsenteret ADAM-12 som en uafhængig prognose faktor og diagnostisk markør var involveret i proliferation, invasion og metastase i patienter med SCLC.

Materialer og Metoder

Patienter og celle linjer

formalin-fikserede tumorer vævsprøver fra 150 patienter, der lider af SCLC blev opnået fra Binzhou Medical University Hospital, Kina, mellem januar 2008 og december 2011. af de vævsprøver, blev 140 opnået via biopsi og 10 blev opnået under kirurgi. Grundlæggende patientinformation blev opnået fra patientjournaler og er vist i tabel 1.

Friske serum og urinprøver blev opnået fra 70 patienter med SCLC fra onkologisk afdeling i Binzhou Medical University Hospital, Kina (48 hanner og 22 kvinder med en gennemsnitsalder på 52,3 ± 11,3 år). I alt 45 patienter havde omfattende sygdom defineret som sygdom, der har spredt sig til den kontralaterale lunge eller som har fjernmetastaser) og 25 patienter havde begrænset sygdom defineret som sygdom, der er begrænset til en lunge, mediastinum, og /eller de regionale lymfeknuder . Alle patienter frivilligt underskrevet informeret samtykke. Alle patienter blev diagnosticeret med SCLC af patologiske biopsi prøver og havde gennemgået kemoterapi og strålebehandling. I alt 40 raske frivillige forsøgspersoner (20 mænd og 20 kvinder med en gennemsnitsalder på 38,7 ± 12,1 år) blev også undersøgt. Sunde kontroller havde ingen unormale ændringer i blodets, lever, hjerte, lunge eller nyre funktioner. Denne undersøgelse blev godkendt af Medical Ethics Committee of Binzhou Medical University, Kina (Permit Nummer: BY2010008).

Menneskelig SCLC-cellelinjer, herunder H1688, H446 og H345, blev købt fra Shanghai Cell Bibliotek af den kinesiske Academy of Science. Celler blev dyrket i 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.

Immunhistokemi

paraffinindlejrede prøver blev afvokset i dimethylbenzen og hydreret i gradient alkohol. Snittene blev behandlet i overensstemmelse med følgende protokoller: Endogen peroxidase fjernet (inkubering i 3% H

2O

2 i 30 min), antigen hentet (ca. 95 ° C i 45 minutter), blokering med 10% gedeserum (ved stuetemperatur i 30 min), primære antistof inkubering natten over ved 4 ° C, HRP-konjugeret sekundært antistoffer inkubation i 30 min ved 37 ° C, DAB farvereaktion, hæmatoxylin-farvning, differentiering, dehydrering og gennemsigtighed. Fortyndingen af ​​primære antistoffer var 01:50 til ADAM-8, ADAM-10, ADAM-11 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 1:200 for ADAM-12 (Abgent, Suzhou, Kina), Adam- 15 og ADAM-17 (R

F: 5′-TCCTGTGTCTTCTTGCTGCC-3 ‘,

R: 5′-GCGCACACACCTTAGTTTTTC-3′ for ADAM-12-L,

F: 5′-CCACCCATTCCATCTCCATC-3 ‘

R: 5′-TTCTGCAAACCCTCAAACC-3’for ADAM-12-S

F: 5′-GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3 ‘

R: 5’CGCGGCGATATCATCATCCA-3′ for beta-actin.

Western blotting

Celler blev lyseret med SDS lysis buffer indeholdende en proteaseinhibitor-blanding. De kvantitative proteiner blev separeret ved SDS-PAGE elektroforese og proteinerne blev overført til NC medlemmer. Medlemmet blev blokeret med 5% fedtfri mælk i 1 time med svag rysten og inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C (1:500 for ADAM-12, Abgent, Suzhou, Kina, 1: 3000 for beta-actin, Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA), derefter inkuberet med HRP-konjugerede sekundære antistoffer i 40 minutter ved stuetemperatur. Immunblot bånd blev visualiseret ved anvendelse af ECL-systemet (Millipore, Billerica, MA, USA) og røntgenfilm.

Transwell eksperimenter

Transwell eksperimenter blev udført i overensstemmelse med producentens vejledning (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Matrigel blev fortyndet med medierne fri serum (1: 2). Et volumen på 60 pi gel blev udpladet i det øverste kammer og størknet ved inkubering ved 37 ° C i 3 timer. 1 × 10

4-celler blev udpladet i kammeret, filtreret ind i det nedre kammer og indføres i serum. Derefter blev celler farvet ved anvendelse af Giemsa Dye, og antallet af celler i 3 felter blev talt under et lysmikroskop.

Cellecyklusanalyse

Celler blev sultet i 24 timer efter serum tilbagetrækning. H1688 og H345 celler blev behandlet. Celler blev opsamlet, fikseret og inkuberet med RNase A (Thermo Scientific) i 30 minutter ved 4 ° C. Derefter blev cellerne derefter inkuberet med propidiumiodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 30 min. DNA-indhold blev påvist via flowcytometri [23].

Dyreforsøg

H1688 celler (en klassisk småcellet lungecancer-cellelinje) blev dyrket i 1640 medium og 10

6 celler administreret subkutant i nøgne mus. Tumorstørrelsen blev overvåget hver uge. Når tumoren diameter nåede ca. 1 cm, blev musene aflivet under bedøvelse og tumorer blev udskåret. Udskårne tumorer (kaldet parentale celler) blev skåret i halve. Den ene halvdel blev opbevaret ved -80 ° C, og den anden blev skåret i stykker, spaltet (0,25% trypsin inkubation i 15 min) og filtreret. Filtrerede celler blev dyrket igen i normalt medium. Tre dage senere blev celler injiceret i immunsvækkede mus via halevenen. Ti uger senere blev musene aflivet under bedøvelse. Af de 10 mus, som blev injiceret, 5 mus havde synlige tumorer (diameter 0,5 cm) i maven lunge og lever, og den anden 5 mus havde ingen synlige tumorer. Sammenlignet med tumorer skyldes subkutan injektion, tumorer som følge af haleveneinjektion havde højere niveauer af infiltration og invasion [24]. Således blev en stærkt metastatisk dyremodel simulerer tumormetastase hos patienter med succes konstrueret. Medicinsk etik Komité Binzhou Medical University godkendt denne undersøgelse (Permit Nummer: BY2013001).

Statistisk analyse

Alle data blev analyseret ved hjælp af SPSS 17.0 software. Kaplan-Meier-metoden og Log-Rank-test blev anvendt til at vurdere den univariate overlevelsesrate. Cox regression blev anvendt til at udføre den multivariate overlevelse analyse. En modtager opererer egenskaber (ROC) kurve analyse blev udført for at vurdere cut-off for serum og urin niveauer af ADAM-12 hos patienter med SCLC og raske frivillige. Arealet under kurven (AUC) og p-værdier blev evalueret. Ekspressionsniveauerne forskelle mellem forskellige grupper blev analyseret under anvendelse parrede

t

test.

P

0.05

blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

Udtrykket for Adams i SCLC prøver ved IHC

ekspressionen af ​​ADAM-8,. – 10, -11, -12, -15 og -17 blev bedømt ved IHC i 150 SCLC-prøver. Niveauet for positivt udtryk (snesevis af kvaliteter 2 og 3) i ADAM-8, -10, -11, -15 og -17 var 31,33% (47/150), 34,66% (52/150), 19,33% (29 /150), 39.33% (59/150) og 10% (15/150), henholdsvis (fig S1). Den positive udtryk for ADAM-12 var den højeste på 72,67% (109/150) og den stærke positive udtryk (grad 3) i ADAM-12 var signifikant større sammenlignet med de andre Adams (

P

0,001 ). Som vist i figur 1, fandt vi, at ADAM-12 blev udtrykt i SCLC og blev placeret i cytoplasmaet, men ikke i kernen. HE farvning indikerede, at tumorvævet typen havde typiske SCLC klinisk-patologiske karakteristika (større kerner og næsten ingen cytoplasma). Vævsprøver, der blev inkuberet natten over med PBS, i stedet for primært antistof, blev anvendt som negative kontroller. ADAM-12 blev udtrykt væsentligt mere i SCLC vævsprøver sammenlignet med ekspressionen af ​​andre Adams (

P

0,001), hvilket indikerer, at ADAM-12 kan spille en vigtig rolle i processen med proliferation, invasion og metastase i SCLC.

ADAM-12 blev påvist i småcellet lungekræft væv ved immunhistokemi farvning. Fortyndingsforholdet af primært antistof var 1: 200 for ADAM-12. (A) Normal lungevæv; (B) HE farvning i SCLC væv; (C) Negativ kontrol (inkuberet med PBS i stedet for primært antistof natten over ved 4 ° C); (D) farvning for ADAM-12 i SCLC væv.

ADAM-12 er en uafhængig prognostisk faktor i SCLC patienter

Siden ADAM-12 blev stærkt udtrykt i SCLC, vi undersøgte forholdet mellem ADAM-12 og sygdomsprognose. Alle patienter havde accepteret systemisk terapi og 15 ud af 150 patienter var stadig i live i januar 2013 (sidste frist for undersøgelsen). Den gennemsnitlige overlevelsestid for patienter var 12.59 måneder og 2-årige overlevelsesrate var 16%. Ifølge ICH farvede scoringer, blev de med kvaliteter 0 og 1 for at være i den negative gruppe og dem med kvaliteter 2 og 3 blev anset for at være i den positive gruppe. Univariate overlevelse analyse viste, at de betydelige kliniske faktorer, der påvirkede overlevelse var omfattende sygdom (

P

0,001). Hverken rygning (

P

= 0,882), køn (

P

= 0,396) var en betydelig prognostisk faktor heller ikke var niveauer af ADAM-8 (

P

= 0,903), ADAM-10 (

P

= 0,075), ADAM-11 (

P

= 0,317), ADAM-15 (

P

= 0,349) eller ADAM-17 (

P

= 0,427). Men ADAM-12 (

P

= 0,022) var en betydelig negativ prognostisk faktor (figur 2). Multivariat overlevelse analyse blev udført for at vurdere den prognostiske indflydelsen af ​​forskellige faktorer. Resultaterne var i overensstemmelse med den univariate overlevelse analyse. Klinisk fase (

P

= 0,001, HR = 2,003, 95% CI: 1,330-3,015) og niveauet af ADAM-12-ekspression (

P

= 0,049, HR = 0,443, 95% CI : 0,197-0,995) var signifikante uafhængige prognostiske faktorer (tabel 2) og ADAM-12 blev tæt forbundet med den kliniske fase (

P

0,001). Kliniske karakteristika af patienter, der var positive for ADAM-12 blev sammenlignet med dem, der var negative for ADAM-12 for yderligere at præcisere, hvilken rolle ADAM-12 som en uafhængig prognostisk faktor i SCLC. Resultaterne viste, at den patologiske etape var statistisk signifikant (

P

= 0,037), mens andre faktorer, herunder alder ( 65 i forhold til ≥ 65,

P

= 0,325), køn (

P

= 0,975), rygning (

P

= 0,743) og tumorstørrelse (

P

= 0,511) var ikke signifikant.

Patient overlevelsestid blev opnås ved opfølgning. Univariate overlevelse analyse blev udført for at vurdere, om ADAM-8, -10, -11, -12, -15 og -17 kunne betragtes som uafhængige prognostiske faktorer. Resultatet viste ADAM-12 at være en uafhængig og negativ faktor (

P

= 0,022).

serum og urin ADAM-12 niveauer i SCLC patienter

IHC-farvning demonstrerede ADAM-12 at være stærkt udtrykt i mucussekretioner, bortset SCLC celler (figur 3A). Vi derefter udledes, at ADAM-12 sandsynligvis blev udskilles i blodet og udskilles gennem urinen. Således undersøgte vi niveauerne af ADAM-12 i serum og urin fra SCLC patienter. Serum og urin fra 70 SCLC-patienter og 40 raske frivillige blev opsamlet, centrifugeret og opbevaret ved -80 ° C. Et ELISA-kit blev anvendt til at detektere ekspressionen af ​​ADAM-12. ROC kurver gav en højere AUC for 0,899 (

P

0,001, 95% CI: 0,842-0,956) til 346 pg /ml i serum ADAM-12 niveau fra SCLC patienter (figur 3B) end normale kontroller (en AUC på 0,847 til 105 pg /ml), og en højere AUC på 0,979 (

P

0,001, 95% CI: 0,959-0,999) til 258 pg /ml i urin ADAM-12 niveau fra SCLC patienter (figur 3C) end normale kontroller (en AUC på 0,869 til 92 pg /ml). Serum ADAM-12 niveau var signifikant højere i SCLC patienter end hos raske frivillige (502 ± 234

vs

180 ± 92 pg /ml,

P

0,001) og i dem med omfattende sygdom sammenlignet med dem med begrænset sygdom (586 ± 205

vs

317 ± 185 pg /ml) (figur 3D). Urinen ADAM 12 niveau var i overensstemmelse med serum niveau og var højere i SCLC patienter end hos raske frivillige (404 ± 247

vs

128 ± 50 pg /ml) og hos patienter med udbredt sygdom sammenlignet med patienter med begrænset sygdom (477 ± 201

vs

303 ± 152 pg /ml) (figur 3E). Dette indikerer, at ADAM-12 niveauer i serum og urin er korreleret med SCLC progression og at ADAM-12 kan betragtes som en diagnostisk markør for SCLC sygdom eftersom ekspressionen af ​​ADAM-12 steg med udviklingen og progressionen af ​​sygdom.

(A) ADAM-12-farvning var stærkt positiv i mucussekretioner (regionen er angivet ved pilen). (B, C) var en ROC-kurve udført for at vurdere cut-off for patienter med SCLC og raske frivillige; ROC = receiver transporterende egenskaber. (D, E) Ekspressionsniveauerne for ADAM-12 i serum og urin fra SCLC patienter og normale kontroller blev påvist ved hjælp af en ELISA-kit. **

P

0,01, SCLC patienter

vs

normale kontroller, SCLC patienter med udbredt sygdom

vs

begrænset sygdom

ADAM-12 påvirkede metastase og spredning i H1688 celler

Som vist fig. 1, 2 og 3, ADAM-12 er en uafhængig prognostisk faktor, der kan være nyttige som et diagnostisk markør i SCLC. Vi udforskede derefter rollen som ADAM-12 i proliferation, invasion og metastase i SCLC. Først detekteres vi ekspressionen af ​​ADAM-12 i SCLC-cellelinier (H1688, H446 og H345) og fandt, at ADAM-12 blev mere stærkt udtrykt i H1688 og H446 celler i forhold til H345 cellelinien (figur 4A). I en undersøgelse om brystkræft, blev ADAM-12 rapporteret at have to transskription former (membran-forankret ADAM-12-L og udskilles typen ADAM-12-S), der spiller forskellige roller [22]. På grund af sekvenslighed, kan forskellige siRNAs at målrettede ADAM-12-L og ADAM-12-S, henholdsvis ikke udformes således siRNA blev anvendt til at målrette ADAM-12. Ekspressionen af ​​ADAM-12 blev signifikant reduceret i den specifikke siRNA-gruppen sammenlignet med ubehandlede og scrambled siRNA grupper (figur 4B). Når der var interferens med ekspressionen af ​​ADAM-12 i H1688-celler blev cellerne induceret af serum filtrering kammeret membran signifikant reduceret (figur 4C) og cellecyklussen blev standset i G0-G1-fasen (figur 4D). Roy

et al

rapporterede, at ADAM-12-L fremmet celleproliferation og at ADAM-12-S fremmet cellulære migration i brystkræft [22]. I vores forskning, blev cellulær proliferation og migration væsentligt hæmmet efter tavshed ekspression af ADAM-12 ved specifik siRNA i H1688 cellelinje, der viser, at ADAM-12 er forbundet med cellulær proliferation, invasion og metastase. For at tydeliggøre rollerne for ADAM-12-L og -S i cellulær proliferation og migration, blev et eksperiment udformet og udført, der er beskrevet nedenfor.

(A) Udtrykket af ADAM-12 var højere i H1688 og H446 celler sammenlignet med H345 celler ved Western blotting. (B) mRNA og protein udtryk for ADAM-12 blev signifikant reduceret, når ADAM-12-ekspression blev stille i et specifikt siRNA målrettet ADAM-12 (ADAM-12i) sammenlignet med ubehandlet (Mock) og scrambled siRNA (NCI) i H1688 celler , **

P

0,01. (C) De celler induceret af serum filtrering kammer membran blev væsentligt reduceret i ADAM-12i gruppen sammenlignet med Mock og NIC grupper i H1688 celler, **

P

0,01. (D) Cellen cyklus blev betydeligt anholdt i G0-G1 fase i ADAM-12i gruppe. Mock: ubehandlede celler; NCI: cellerne blev behandlet med scrambled siRNA. ADAM-12i:. Cellerne blev behandlet med siRNA rettet mod ADAM-12

ADAM-12-L fremmer proliferation og ADAM-12-S fremmer invasion

Som vist figur 4, når ADAM-12-ekspression blev stille, var cellulær proliferation og migration hæmmede betydeligt i H1688 celler. ADAM-12-ekspression var lavere i H345 celler sammenlignet med H1688 og H446-celler (figur 3A). H345 celler blev derefter kortvarigt transficeret med ekspressionsvektoren ifølge ADAM-12-L (H345-L) eller -S (H345-S). Den transfektion effektivitet blev vurderet ved real-time PCR, da der ikke var nogen specifikt antistof rettet mod ADAM-12-L eller -S. MRNA ekspression af ADAM-12-L og -S blev forøget signifikant efter transfektion (figur 5A). Der var ingen signifikant forskel mellem H345-L-celler induceret ved filtrering gennem kammeret membran og mock (normal kontrol) eller negative kontroller (pcDNA3.1). Imidlertid blev de modstridende resultater fundet i H345-S-celler. Efter transfektion med ADAM-12-S, blev H345 celler induceret af serum filtrering gennem kammeret membran væsentligt forøget, hvilket indikerer, at Adam-12-S, ikke ADAM-12-L, spiller en vigtig rolle i SCLC invasion og metastase (figur 5B ). I mellemtiden viste cellecyklusanalyse at H345-L-celler indgået S faser, men at H345-S-celler var ikke signifikant forskellig i forhold til negative kontrolceller (figur 5C). Dette indikerede, at ADAM-12-L kan fremme celledeling og ADAM-12-S kunne fremme celle invasion og metastase, hvilket er i overensstemmelse med Roopali resultat [22].

(A) De mRNA udtryk for Adam- 12-L og -S blev detekteret ved real time PCR i H345-celler transficeret med ekspressionsvektoren ifølge ADAM-12-L og -S, **

P

0,01. Mock: ubehandlet gruppe; pcDNA3.1: negativ gruppe. 12-L: transficeret med pcDNA3.1-ADAM-12-L; 12-S: transficeret med pcDNA3.1-ADAM-12-S. (B) De celler induceret af filtreringskammeret membran ikke var signifikant forskellige i H345-celler transficeret med pcDNA3.1-ADAM-12-L (opkaldt H345-L), men cellerne blev signifikant forøget i H345-celler transficeret med pcDNA3. 1-ADAM-12-S (opkaldt H345-S), *

P

0,05. (C) ADAM-12-L inducerede celler til at gå fra G0-G1 fasen ind i S-fasen, men ADAM-12-S påvirkede ikke celleproliferation i H345 celler.

Udtrykket af ADAM-12 blev forøget, når tumorinvasion og metastase blev styrket

Tidligere forskning [22] havde rapporteret, at ADAM-12-L fremmes celleproliferation og ADAM-12-S fremmet celleinvasion og metastase i en dyremodel; Vi bekræftede denne konklusion på celleniveau. Imidlertid har der ikke været rapporter om, hvorvidt ekspressionen af ​​ADAM-12 forøges, når tumorinvasion og metastase er forøget. Som vist i figur 3, blev serum- og urin ADAM-12 niveauer steg signifikant hos patienter med udbredt sygdom sammenlignet med dem med begrænset sygdom, hvilket antyder, at ekspressionen af ​​ADAM-12 øges med udviklingen af ​​sygdommen. For at bekræfte denne konklusion blev den stærkt metastatisk dyremodel simulerer tumormetastase konstrueret som beskrevet i fremgangsmåderne (figur 6A). Der var en større ændring i morfologien af ​​metastatiske celler sammenlignet med de parentale celler fra denne model. Metastatisk cellestørrelse var mindre, cytoplasmaet pletten blev shoaled, blev den nukleare pletten uddybet, celledensiteten tyndet og cellen kompakt svækket (figur 6B). Ekspressionen af ​​ADAM-12 blev påvist i parentale og metastatiske celler. MRNA ekspression af ADAM-12-L var ikke anderledes mellem parentale og metastatiske celler, men ADAM-12-S-mRNA var signifikant højere i metastatiske celler (Figur 6C). Dette indikerer, at Adam-12-S, ikke ADAM-12-L, spiller en vigtig rolle i invasionen og metastase. ADAM-12-protein blev påvist ved IHC og Western blot. Resultatet viste, at ADAM-12 var tydeligvis højere i metastatiske celler sammenlignet med parentale celler (figur 6D).

(A) En stærkt metastatisk dyremodel blev konstrueret, 1 x 10

6 celler blev administreret subkutant og de subkutane tumorer (parentale celler) blev injiceret i nøgne mus via halevenen for at danne metastatiske tumorer (metastatiske celler). blev observeret (B) Morfologiske forskelle mellem parentale celler og metastatiske celler via hematoxylin og eosin (HE) -farvning. Sammenlignet med forældrenes celler, metastatiske celler var mindre, havde shoaled cytoplasma farvning, dybere nuklear farvning, tyndere celletæthed og svagere celle kompakt. (C) Der var ingen forskel i ADAM-12-L mRNA-ekspression mellem forældre og metastatiske celler, men ADAM-12-S-mRNA var signifikant højere i metastatiske celler, *

P

0,05. (D) ADAM-12 protein-ekspression blev øget betydeligt i metastatiske celler ved IHC og western blotting. P1-P5 viser de fem subkutane tumorer og M1-M5 angiver de fem metastatiske tumorer.

Diskussion

Der er mere end 30 ADAM’er der hører til metalloproteinase familien. De interagerer med integriner at mediere celle-celle og celle-ekstracellulær matrix-interaktioner [25], kaste et stort antal transmembrane proteiner, nedbryde ECM’en og aktivere indhakket og EGFR veje til at fremme celleproliferation, invasion og metastase [6].

de vigtigste elementer i SCLC er hurtig vækst og omfattende metastaser i den tidlige fase. På nuværende tidspunkt er der ingen effektiv diagnostisk markør til at bistå ved diagnosticeringen af ​​SCLC, især i den tidlige fase. Denne undersøgelse blev designet til at vurdere ekspressionen af ​​Adams live i SCLC og for at finde en anvendelig diagnostisk markør. Indtil nu var blevet påvist kun ekspressionen af ​​ADAM-15, og ekspressionen af ​​andre ADAM’er blevet kun sjældent rapporteret i SCLC [8]. I vores forskning, vi har registreret ADAM-8, -10, -11, -12 og -17, og fandt, at ADAM-12 blev mere stærkt udtrykt sammenlignet med andre Adams live i SCLC kliniske prøver.

ADAM-12 er stærkt udtrykt i talrige kræftformer, herunder brystkræft [12], [14], [26], levercancer [16], mavekræft [26], [27], tyktarmskræft [26] og nervesystem kræft [28]. I nærværende undersøgelse, univariate og multivariate overlevelse analyse viste, at ADAM-12 er sandsynligvis en selvstændig prognostisk faktor indikerer dårligere overlevelse i SCLC patienter. Selvom ADAM-12 overudtrykkes i talrige tumorer, har ADAM-12 som en specifik diagnostisk markør kun været brugt til brystcancer [22].