PLoS ONE: Forhøjet MicroRNA-31 Expression Regulerer Kolorektal Cancer Progression ved at undertrykke sit mål Gene SATB2

Abstrakt

Flere undersøgelser har medført stigende beviser til støtte hypotesen om, at miRNA spiller en central rolle i flere processer carcinogenese , herunder cellevækst, apoptose, differentiering og metastase. I denne undersøgelse undersøgte vi den potentielle rolle for MIR-31 i kolorektal cancer (CRC) aggressivitet og dens underliggende mekanismer. Vi fandt, at MIR-31 steg i CRC-celler stammede fra metastatiske foci og humane primære CRC væv med lymfeknudemetastaser. Derudover blev ekspression på højt niveau af miR-31 signifikant associeret med en mere aggressiv og dårlig prognostisk fænotype af patienter med CRC (

s

0,05). Den stabile overekspression af miR-31 i CRC celler var tilstrækkelige til at fremme celleproliferation, invasion, og migration

in vitro

. Det lettede tumorvækst og metastase

in vivo

også. Yderligere undersøgelser viste, at MIR-31 direkte kan binde til den 3′-utranslaterede region (3’UTR), i SATB2 mRNA og efterfølgende undertrykke både mRNA og protein udtryk for SATB2. Ektopisk ekspression af SATB2 ved transient transficeret med pCAG-SATB2 vektor koder for hele SATB2 kodende sekvens kunne vende virkningerne af MIR-31 om CRC tumorgenese og progression. Desuden ektopisk overekspression af MIR-31 i CRC-celler induceret epithelial-mesenchymal overgang (EMT). Vores resultater viste, at den opregulering af miR-31 spillede en vigtig rolle i CRC celleproliferation, invasion, og metastase

in vitro

in vivo

gennem direkte undertrykkende SATB2, hvilket tyder på en potentiel anvendelse af miR-31 i prognose forudsigelse og terapeutisk anvendelse i CRC

Henvisning:. Yang MH, Yu J, Chen N, Wang XY, Liu XY, Wang S, et al. (2013) Forhøjet MicroRNA-31 Expression Regulerer Kolorektal Cancer Progression ved at undertrykke sit mål Gene SATB2. PLoS ONE 8 (12): e85353. doi: 10,1371 /journal.pone.0085353

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: August 2, 2013; Accepteret: November 25, 2013; Udgivet: December 30, 2013 |

Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.000.953, 81.172.242, 81.071.735), Større projekter af National Natural Science Foundation of China ((Nej. 81.090.422), State Key Program for National Natural Science Foundation of China (U1201226), National Basic Research Program Kina (973 Program, No. 2010CB529402), Key Program for National Natural Science Foundation of China Guangdong (2010B031500012) og National Natural Science Foundation of China Guangdong (10451051501004710). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design , indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:. Alle forfattere har læst papiret og godkendt for at indsende den til PLoS ONE forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser..

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden. Selv om flere slags behandlinger er blevet udviklet for nylig for patienter med CRC, dårlig prognose fortsat i patienter med fremskreden CRC [1]. De fleste CRC dødsfald er blevet forbundet med tumorinvasion og metastase. Så forstå de underliggende molekylære mekanismer i CRC metastaser er af afgørende betydning i udviklingen af ​​terapeutiske strategier for avancerede CRC patienter.

microRNA (miRNA) er en rigelig klasse af stærkt bevaret, korte, regulerende (ca. 22 nt) ikke-kodende RNA’er, der er bredt udtrykt i levende organismer. De binder til 3’UTR af mRNA, der forårsager enten mRNA-molekyle nedbrydning eller translationel inhibering [2]. miRNA har forskellige funktioner, herunder reguleringen af ​​cellulær differentiering, proliferation og apoptose [3,4]. Derfor har en hel del undersøgelser rapporterede den centrale rolle af miRNA i de mange processer i carcinogenese, herunder metastaser [3,5,6]. Desuden udtryk analyser har afsløret karakteristiske miRNA signaturer i specifikke humane kræftformer [7-9].

Adskillige forskere rapporterede, at miR-31 opreguleret i CRC [10-12] og planocellulært karcinom i tungen [13], men nedreguleret i brystkræft [14], mavekræft [15], malignt mesotheliom [16] og pancreascancer [17] ved brug QRT-PCR. Men, den kliniske prognostisk betydning, funktion og regulatorisk aktivitet af miR-31 i CRC er ikke blevet helt forstået endnu. I denne undersøgelse udforskede vi den entydige rolle MIR-31 i CRC og fandt, at opregulering af MIR-31 var forbundet med de aggressive fænotyper af CRC og dårlig prognose hos patienter. Yderligere undersøgelser afslørede, at overekspression af miR-31 i CRC førte til at øge tumorcelleproliferation og motilitet

in vitro

in vivo

. Den foreliggende undersøgelse bestemmer en positiv rolle miR-31 i carcinogenese, invasion, og migration via undertrykke SATB2 udtryk i CRC.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Anvendelse af væv til denne undersøgelse er blevet godkendt af den etiske komité af Nanfang Hospital, Southern Medical University. Alle patienterne underskrevet informeret samtykke før brug af disse kliniske materialer til forskningsformål. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i det sydlige Medical University (Permit Nummer: SYXK2011-0074). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Tissue forberedelse og cellekultur

Friske og formalinfikserede, paraffinindlejrede, kolorektal tumor vævsprøver var opnået fra patienter med en diagnose af primær CRC og derefter gennemgik elektiv kirurgi i Nanfang Hospital, Southern Medical University (Guangzhou, Kina). Brugen af ​​væv til denne undersøgelse er blevet godkendt af den etiske komité af Nanfang Hospital, Southern Medical University. I alt 31 tilfælde af fersk CRC væv blev frisk nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse. Og 143 tilfælde af arkiverede CRC vævsprøver blev indsamlet og anvendt i klinisk-patologisk og prognostisk undersøgelse af miR-31. Ingen patienter modtaget nogen præoperative kemoterapi eller strålebehandling. Et omfattende sæt af klinisk-patologiske data blev besat, herunder alder, køn, størrelse af primær tumor, tumor differentiering, T scenen, lymfeknude metastaser og fjernmetastaser. Komplet opfølgning, der spænder fra 1-96 måneder, var til rådighed for kohorten af ​​143 patienter, og den mediane overlevelse var 56 måneder.

De humane embryonale nyreceller 293T og de menneskelige CRC cellelinjer DLD-1 , HCT116, SW480, SW620, Lovo blev opnået fra en celle bank på det kinesiske videnskabsakademi (Shanghai, Kina). I tidligere undersøgelser har vi beskrevet en subklon navngivet M5 med forbedrede metastatiske evner i leveren. Vi har også beskrevet en subklon navngivet SCP 51 med høje metastatiske evner i lever og lymfeknuder. Disse subkloner blev isoleret ved

in vivo

udvalg af SW480-celler ved en proces beskrevet i tidligere undersøgelser [18-20]. Alle CRC-cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) med 10% føtalt bovint serum (HyClone, Logan, USA) og 100 U /ml penicillin /streptomycin (Gibco). De blev holdt i en befugtet kammer med 5% CO

2 ved 37 ° C. 293T blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% FBS.

RNA-isolering og kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret med TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA ). cDNA blev syntetiseret med PrimeScript RT reagens Kit (Promega, Madison, WI, USA). En hårnåle-kvantitativ RT-PCR blev udført for at detektere ekspression af modent MIR-31 med ABI TaqMan

® MicroRNA Assay kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) og genspecifikke primere (Applied Biosystems, Foster City , USA) under anvendelse af en ABI 7500 Real-Time PCR-system. Assayet blev udført tredobbelt i hvert enkelt tilfælde at muliggøre vurdering af den tekniske variabilitet.

In situ-hybridisering og evaluering af farvning af MIR-31

In situ-hybridisering (ISH) blev udført ifølge fabrikantens protokol (Exiqon, Vedbæk, Danmark). Paraffinindstøbte snit (4 um tyk) blev afparaffiniseret med xylen og rehydreret med fortyndet ethanol af reagenskvalitet. Objektglassene blev behandlet med proteinase K ved 37 ° C i 20 minutter. Derefter blev de præhybridiseret i en hybridiseringsopløsning ved 50 ° C i 2 timer. Efterfølgende 40 nM en låst nukleinsyre-modificeret, 5 ‘digoxigenin (DIG) -mærkede oligonukleotidprobe af HSA-MIR-31 eller et kodet kontrolprobe (Exiqon) blev tilsat til hybridiseringsopløsningen og hybridiseret ved en temperatur på 50 ° C natten over. En alkalisk phosphat-konjugeret anti-DIG-antistof (Roche, Mannheim, Tyskland) blev påført. Efter at være blevet vasket i farveopløsning blev sektionerne inkuberet i NBT /BCIP fremkalderopløsning (Roche) ved 37 ° C i 15 til 30 minutter. Derefter blev de modfarvet med nuklear fast red.

For at vurdere patienternes kliniske karakteristika, ISH farvede vævssnit blev gennemgået og scorede separat af to blindede patologer. Farvning for MIR-31 blev vurderet ved anvendelse af en relativt enkel, reproducerbar scoringsmetode [21,22]. På en skala fra 0 til 3 blev farvningsintensitet scoret som følger: negativ (ingen farvning, 0), svag (lyseblå, 1), medium (blå, 2) eller stærk (mørkeblå, 3). Omfanget af farvningen er defineret som den procentdel af positiv farvning områder af tumorceller eller normale colon-epitelceller i forhold til hele tumoren område eller hele sektionen for de normale prøver. Omfanget af farvning blev bedømt på en skala fra 0 til 4 som følger: 0, 0%; 1, 1-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; og 4, 76-100%. Summen af ​​farvning intensitet og farvning-omfang scoringer blev anvendt som den endelige farvning score for miR-31 (0-7). Til statistisk analyse blev en endelig farvning score på ≥ 3 anses for at være høj.

Vector forberedelse

En 184-bp DNA fragment svarende til at pre-miR-31 blev valgt, og den flankerende sekvens blev amplificeret og klonet ind pLVTHM lentiviral vector (https://www.addgene.org/Didier_Trono) til generering af PLV-mIR-31 ekspressionsvektor. pLVTHM lentiviral vektor koder forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP), der er optimeret til lysere fluorescens og større ekspression i mammale celler. Den tidligere beskrevne vektor pCAG-SATB2 [19] blev anvendt til at opregulere SATB2 ekspression.

fuld længde 3’UTR af SATB2 (2711bp) blev klonet og derefter indsat i nedstrøms for luciferasereportergenet af pGL3-kontrolvektor (Promega, Madison, WI, USA). Dette blev gjort for at generere pGL3-SATB2-3’UTR. To formodede MIR-31 bindingssteder på 3’UTR af SATB2 blev steddirigeret og muterede henholdsvis hjælp GeneTailor steddirigeret mutagenese System (Invitrogen). Alle plasmider blev verificeret ved sekventering. Alle primersekvenser for detektion og miRNA sekvenser er tilvejebragt i tabel S1.

lentivirus produktion og infektion

Virus partikler blev høstet 48 timer efter PLV-miR-31 transfektion med kuverten plasmidet pMD2.G og emballagen vektor psPAX2 i 293T-celler ved hjælp af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen ). CRC-celler blev inficeret med de rekombinante lentivirus-transducerende enheder, plus 8 mg /ml Polybrene (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) og derefter underkastet FACS-analyse for GFP-ekspression at få CRC-celler med stabil overekspression af MIR-31. Den tomme lentiviral vector pLVTHM blev anvendt som kontrol (MIR-con).

Oligonucleotid transfektion

MIR-31 efterligner og antisense-inhibitorer indeholdende 2′-OMe (

O

methyl) ændringer blev syntetiseret af GenePharma (Shanghai, Kina). Oligonukleotid transfektion blev udført med lipofectamin 2000-reagens (Invitrogen).

Luciferase reporter assay

Ved tilstedeværelse af enten miR-31 eller miR-con, ildflue luciferase konstruktionen blev cotransficeret med en kontrol

Renilla

luciferase vektor pRL- CMV (Promega) i SW480-celler. En dual luciferase assay (Promega) blev udført 48 timer efter transfektion. Eksperimenterne blev gennemført tre gange uafhængigt af hinanden.

Celleproliferationsassay og cellecyklus-analyse

Celler blev podet i plader med 96 brønde ved 2 x 10

3 per brønd. Celleproliferation blev vurderet ved anvendelse celle Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, USA) ifølge producentens anvisninger. For celle-cyklus analysen blev celler udpladet i plader med 6 brønde ved 5 x 10

5 per brønd. Fordelingen celle-cyklus blev analyseret ved propidiumiodid (Sigma-Aldrich) farvning og flowcytometri [23].

Kolonidannelse assay

Cellerne blev udpladet i 6-brønds plader ved 2 × 10

2 per brønd og holdt i RPMI1640 indeholdende 10% FBS i 2 uger. Efter 2 uger blev cellerne vasket to gange med PBS, fikseret med methanol og farvet med 0,5% krystalviolet. Antallet af kolonier blev talt under et mikroskop [24].

sårheling og invasion analyser

Cell migration blev vurderet ved at måle bevægelsen af ​​celler i en skrabet og acellulær område skabt af en 200 uL pipette rør, og blev observeret spredningen af ​​sårlukning efter 0 og 48 timer. Fotografier blev taget til at vurdere niveauet af migration i hver gruppe af transficerede celler. Migration blev kvantificeret ved at tælle det totale antal celler, der migrerede mod den oprindelige viklede felt. For invasion assay blev Matrigelcoatede kamre (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) indeholdende 8 um porer anvendes. Celler blev podet i de øvre kamre (overtrukket i matrigel) ved 2 × 10

5 koncentration i serum-frit medium. Den nederste kammer i transwell var fyldt med dyrkningsmedier indeholdende 10% FBS som en kemo-lokkemiddel. Efter kamrene blev inkuberet ved 37 ° C i 48 timer blev ikke-invaderede celler på toppen af ​​transwell skrabes med en vatpind. Succesfuld omplantede celler blev fikseret med 10% formalin. Derefter blev de farvet med 0,1% krystalviolet i 30 minutter og talt under et lysmikroskop.

In vivo Salg funktioner assays

Balb /C-nu /nu atymiske nøgne mus (4-6 uger gamle) blev købt fra Laboratory Animal Center of Southern Medical University. Musene blev opstaldet under patogenfrie forhold i en 12 timers mørke /lys-cyklus og

ad libitum

adgang til mad og filtreret vand. Dyr anvendt til eksperimenter fik human måde. For tumorvækst assay, i alt 2 × 10

6 celler af SW480 med stabil overekspression MIR-31, eller kontrolceller, blev injiceret subkutant i venstre og højre flanke af mus (n = 6 pr gruppe). Derefter blev fluorescens udsendt af celler opsamlet og billeder blev analyseret gennem en helkrops-GFP imaging system (Lighttools, Encinitas, CA), der kan visualisere realtid tumorvækst. Tumorstørrelse blev målt ved anvendelse af digitale skydelære hver tredje dag. Efter 30 dages opfølgning, blev mus aflivet ved cervikal dislokation, og tumorer blev dissekeret. Tumor volumen blev beregnet som følger:. Volumen = (D × d

2) /2, hvor D betød den længste diameter og d betød den korteste diameter

For etablering metastatisk model, mus coecum blev blotlagt ved laparotomi under bedøvelse med natriumpentobarbital (6mg /100g legemsvægt). De subkutane tumorer blev hakket i 1 mm

3 terninger og implanteret i mesenteriet ved coecum terminalen af ​​mus. Derefter blev tarmen returneret til bughulen og lukket med kirurgiske afdækningsstykker. Varmepuder blev brugt til at hjælpe postoperative opsving for mus efter xenografter implantation. Animal sundhedstilstand blev overvåget efter operationen dagligt, herunder deres fysiske aktivitet, hydrering, spise og drikkevaner og mobilisering. Kropsvægt af kontrol og SW480 /MIR-31-mus blev også registreret hver tredje dag. Humane endpoints var planlagt i slutningen af ​​eksperimentet og som et middel til at genopleve smerte eller lidelse. En integreret kriterium for behov for eutanasi blev udført i vores undersøgelse, herunder fysisk underskud, sygdom, angst, immobilitet, vægttab og maksimal tumorstørrelse. Når de syntes indlysende fysiske underskud, såsom tørre eller matte øjne, tacky slimhinder, krum, reduktion ambulation, bort observatør, dyspnø eller kakeksi blev mus anses for at opfylde kriterierne for eutanasi og blev ofret for at minimere lidelse og angst. Ved slutningen af ​​forsøget (8 uger), blev de stadig er i live mus aflivet ved cervikal dislokation. De organer blev fjernet og fikseret med 10% neutral bufret formalin. Efterfølgende blev fortløbende vævssnit opnået og farvet med hæmatoxylin-eosin (H mCRC betegner CRC væv med lymfeknudemetastaser. (C) Ekspression af MIR-31 i CRC cellelinier og subkloner. miRNA overflod blev normaliseret til U6 RNA. (D) Expression analyse af miR-31 i normal kolorektal slimhinde og CRC væv ved

i

situ

hybridisering. (A) Negativ ekspression af MIR-31 i normal colorektal slimhinde; (B) Lav udtryk for miR-31 i CRC væv; (C, d) Høj ekspression af MIR-31 i CRC væv; (E) negativ kontrol; (F) Kaplan-Meier-analyse for overlevelse af patienter med CRC ifølge MIR-31-ekspression. Log Rank = 6,682,

s

= 0,010.

Over-ekspressionen af ​​miR-31 var forbundet med en aggressiv fænotype og dårlig prognose for patienter med CRC

for yderligere at undersøge den klinisk-patologisk og prognostisk betydning af miR-31 niveauer, målt vi miR-31-ekspression i en stor kohorte af 143 arkiveret paraffinindlejret CRC og normale colon væv ved hjælp af ISH. Vi observerede, at 75/143 (52,45%) CRC’er havde højniveauekspression miR-31, mens 11/55 (20%) normale mucosa væv havde højt niveau ekspression af miR-31 (

s

0,001). Sammenhængen analyse mellem klinisk-patologiske karakteristika og-31 miR-niveau viste højt niveau ekspression af miR-31 var signifikant associeret med T-stadie (

s

= 0,045), lymfeknude metastaser (

s

= 0,001), og fjern metastase (

s

= 0,026) hos patienter med CRC er imidlertid ikke forbundet med alder, køn, tumorstedet, tumorstørrelse, og tumor differentiering grad (

s

. 0,05, tabel 1)

Kendetegn

n

miR-31 udtryk

lav (%)

høj (%)

P Drømmeholdet værdi

Køn Male8739 (44,83) 48 (55,17) 0,416 Female5629 (51,79) 27 (48.21) Alder (år) 506535 (53,85) 30 (46,15) 0,169 ≥507833 (42,31) 45 (57,69) Tumor websted proksimal colon4220 (47,62) 22 (52,38) 0,369 Distal colon3721 (56,76) 16 (43,24) Rectum6427 (42,19) 37 (57,81) Tumor størrelse (cm i diameter) 54519 (42,22) 26 (57,78) 0,387 ≥59849 (50,00 ) 49 (50,00) Tumor differentiering Good136 (46,15) 7 (53,85) 0,979 Moderate10450 (48,08) 54 (51,92) Poor2612 (46,15) 14 (53,85) T-stage1-22316 (69,57) 7 (30,43) 0,045 38740 (45,98) 47 (54,02) 43312 (36,37) 21 (63,63) N-stage05938 (64,41) 21 (35,59) 0,001 1-28430 (35,71) 54 (64,29) Distant metastasis09451 (54,26) 43 (45,74) 0,026 14917 (34,69) 32 (65,31) tabel 1. sammenhæng mellem de klinisk-patologiske træk og udtryk for miR-31.

CSV Hent CSV

for at vurdere den prognostiske værdi af miR-31 for CRC’er, vi analyserede sammenhængen mellem miR-31-ekspression og overlevelse varighed hjælp Kaplan -Meier analyse med log-rank test. Resultaterne viste, at ekspression på højt niveau af MIR-31 var korreleret med korte overlevelsestid for patienter med CRC (51.85 ± 3.78

vs

.76.64 ± 4,30,

s

= 0,010, figur 1D ). Endvidere multivariat Cox regressionsanalyse indikerede, at høj-niveau ekspression af MIR-31 er en uafhængig prognostisk faktor for ringe overlevelse af patienter med CRC (tabel 2).

Variabler Salg univariat analyse

multivariatanalyse

P Drømmeholdet værdi

HR

95% Konfidensinterval

P Drømmeholdet værdi

HR

95% Konfidensinterval

Gender0.516 0,826 0.464-1.471Age0.391 0,785 0.451-1.366Tumor site0.915 0,982 0.707-1.365Tumor size0.581 1,190 0.642-2.207Tumor differentiation0.074 1,648 0.953-2.850T-stage0.001 2,262 1.419-3.6060.032 1,695 1.045-2.750 N-stage0.041 1,563 0.846-2.7280.604 0,847 0.453-1.586M-trins 0.0014.338 2,441-7,707 0.0013.563 1.940-6.545miR-31 expression0.012 2,145 1.182-3.8900.048 1,877 1.007-3.488Table 2. Samlet overlevelse analyser af univariate og multivariate COX regressionsanalyse.

CSV Hent CSV

Exogenetic overekspression af miR-31 forfremmet CRC vækst celler, invasion, og migration

in vitro

for at udforske potentialet biologiske funktion af miR-31 i CRC tumorigenese og progression, blev SW480 og DLD-1 celler inficeret med PLV-miR-31 eller PLV-con, hhv. Dette blev gjort for at etablere to stabile miR-31-overekspression cellelinjer og to mock cellelinier (miR-con). En øget ekspression af MIR-31 efter infektion i to cellelinier blev bekræftet ved real-time RT-PCR (figur 2A). Som vist i figur 2B-2D, over-ekspression af MIR-31 forøgede cancercelleproliferation og dens evne til at danne kolonier end den mock celler og vildtype ikke-inficerede celler (

s Restaurant 0,001 ). Flowcytometri og cellecyklus-analyse viste en signifikant fald i procentdelen af ​​celler i G1 /G0 fase (

s

= 0,004 i SW480

, s

= 0,008 i DLD1) og en stigning i S fase af CRC celler behandlet med miR-31 (

s

= 0,002 i SW480

, s

= 0,001 i DLD1, figur 2E).

(A) Real-time RT-PCR-analyse af miR-31 ekspressionsniveauet i SW480 og DLD-1 celler efter ektopisk overekspression af miR-31. (B, C) Effekt af MIR-31 på celleproliferation blev målt ved CCK-8 assay. (D) Sammenligning af kolonidannelse effekt af CRC cellelinier. (E) Cell-cycle distribution af CRC-celler inficeret med MIR-31 blev påvist ved flowcytometri analyse. (F, G) Virkninger af miR-31 ektopisk overekspression på celle motilities og invasionsevne blev bestemt ved anvendelse af sårheling (F) og matrigel invasion (G) analyser. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD. Resultaterne var reproducerbare i tre uafhængige forsøg. *

s

0,05, **

s

. 0,001

Efter observere miR-31-medieret vækst aggrandizement, effekten af ​​miR-31 om invasive kapacitet CRC celler var præget af den sårhelende og matrigel invasion assay. Resultaterne indikerede, at exogenetic ekspression af MIR-31 i CRC-celler forårsagede en signifikant stigning i cellemigrering ved anvendelse af en sårhelende assay (

s

= 0,001 i SW480

, s

0,001 i DLD1, figur 2F). Matrigel invasion assay illustreret også, at overekspression af miR-31 markant induceret invasionsevne af CRC-celler (

s

0,001 i både SW480 og DLD1, figur 2G). Disse resultater viste, at overekspression af miR-31 var tilstrækkelige til at fremme både celledeling og migration

in vitro

.

miR-31 lettede CRC celler tumorvækst og metastase

in vivo

Siden miR-31 fremmer vækst, migration og invasion af CRC celler

in vitro

, vi fristet til at afgøre, om miR-31 kunne fremme tumorvækst og metastase

in vivo

. Til dette formål SW480-celler med stabil overekspression MIR-31 (SW480 /MIR-31) og kontrolceller (SW480 /MIR-con) blev subkutant inokuleret i nøgne mus. Som vist i figur 3A, hastigheden af ​​tumorvækst i SW480 /MIR-31 gruppe var signifikant end den SW480 /MIR-con gruppe (

s Restaurant 0,05, figur 3A og 3B). IHC farvning viste, at tumorer i kontrolgruppen viste meget lavere Ki-67-indekset end miR-31 overekspression gruppe (figur 3B).

(A) Eksterne hele kroppen fluorescens billeder af SW480 /miR -31 og SW480 /mIR-con mus og tumorer (øvre) og billeder af subkutan tumor i mus (lavere) blev opnået. Pile viser subkutane cancere. (B) Repræsentative fotografier af H 0,05, figur 3D og 3E ). Desuden blev det afsløret, at miR-31 overekspression førte til kortere samlet overlevelsestid af dyr (

s

0,05, figur 3F)

Hæmning af miR-31 reduceret. væksten, invasion, og migration af CRC celler

in vitro

for at bekræfte effekten af ​​miR-31 om at modulere maligne fænotyper af CRC celler, undersøgte vi også ændringen af ​​aggressive fænotyper af CRC celler efter reduceret ekspression af mIR-31. miR-31-specifik inhibitor transfektion blev ansat til at hæmme miR-31-ekspression i M5 og SW620 celler, som havde høj endogen miR-31-ekspression. Som vist i figur 4A, sammenlignet med kontrolcellerne, blev en signifikant langsommere proliferationshastighed observeret i MIR-31 inhibitor-transficerede celler (

s Restaurant 0,001). Desuden matrigel invasion og sårhelende assays bekræftede, at hæmning af MIR-31 ekspression reduceret invasivitet og migrering af M5 og SW620 celler, sammenlignet med kontrolcellerne (

s Restaurant 0,05, figur 4B og 4C ).

(A) Inhibering af mIR-31 inhiberede celleproliferation af M5 og SW620 celler ved CCK8 assay. *

s

*

s

β-actin blev anvendt som en loading kontrol.