PLoS ONE: kaffesyre Phenethyl Ester Årsager p21Cip1 Induktion, Akt Signaling Reduction, og væksthæmning i PC-3 human prostatakræft Cells

Abstrakt

kaffesyre phenethyl ester (CAPE) behandling undertrykt proliferation, kolonidannelse, og cellecyklusprogression i PC-3 humane prostatacancerceller. CAPE faldt protein ekspression af cyclin D1, cyclin E, SKP2, c-Myc, Akt1, Akt2, Akt3, total Akt, mTOR, Bcl-2, Rb, samt phosphorylering af Rb, ERK1 /2, Akt, mTOR, GSK3α , GSK3p, PDK1; men steg protein ekspression af KLF6 og p21

Cip1. Microarray analyse viste, at veje er involveret i cellulær bevægelse, celledød, proliferation og cellecyklus blev ramt af CAPE. Co-behandling af CAPE med kemoterapeutiske lægemidler vinblastin, paclitaxol, og estramustin angivet synergistisk undertrykkelse effekt. CAPE administration kan tjene som en potentiel adjuverende behandling for prostatakræft

Henvisning:. Lin HP, Jiang SS, Chuu CP (2012) kaffesyre Phenethyl Ester Årsager p21

Cip1 Induktion, Akt Signaling Reduction, og vækst- inhibering i PC-3 human prostatacancer Cells. PLoS ONE 7 (2): e31286. doi: 10,1371 /journal.pone.0031286

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: 26 august, 2011; Accepteret: 5 januar 2012; Publiceret: 7 feb 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CS-100-PP-12 (National Health Research Institutes) og NSC 99-2320-B-400-015-MY3 (National Science Rådet, NSC) i Taiwan for CPC, samt DOH100-TD-C- 111-014 (Department of Health) for SSJ og CPC. Vi takker støtte fra Protein Chemistry Core Facility af Core Instrument Center i NHRI og Taiwan Bioinformatik Institute Core Facility for National Core Facility Program for Biotechnology af NSC (NSC100-2319-B-400-001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er en af ​​de mest almindelige non-kutant karcinom af mænd i de vestlige lande. Mere end 80% af patienter døde af prostatakræft udviklede knoglemetastaser [1] – [3]. I 1941, Charles Huggins opdaget, at berøvelse af androgen forårsagede regression af hormon-responsive metastatisk prostatacancer [4]. Siden da har androgen ablation terapi blevet den primære behandling for metastatisk prostatacancer. Men de fleste prostatakræft patienter, der modtager androgen ablation terapi i sidste ende udvikle tilbagevendende, kastrationsresistent tumorer inden 12-33 måneder efter behandlingen. Den mediane samlede overlevelse tid er 1-2 år efter tumor tilbagefald [5], [6]. Kemoterapi er normalt anvendes til behandling af metastatisk hormon-refraktær prostatakræft [7].

Almindeligt anvendte kemoterapi narkotika for metastatisk prostatacancer omfatter eoposide, paclitaxol, vinblastin, mitoxantron, og estramustin. Etoposid og mitoxantron er type II topoisomerase-hæmmer [7], [8]. Estramustin er et derivat af østrogen med en nitrogensennep-carbamat esterdel [7]. Vinblastin binder tubulin og hæmmer dannelsen af ​​mikrotubuli [7]. Paclitaxel forstyrrer mitosespindelen forsamling, kromosom adskillelse, og celledeling. Paclitaxel også stabiliserer mikrotubuli polymer og dermed beskytter det mod demontering [7]. Behandling med disse kemoterapi narkotika faldt prostata specifikt antigen (PSA) og radiografisk respons samt forbedret smerte og urin symptomer i en undergruppe af patienter. Men de viste, lille effekt på at forlænge overlevelsen. Uønskede bivirkninger af disse kemoterapeutiske midler omfatter giftige dødsfald, slagtilfælde, trombose, neutropeni, ødem, dyspnø, utilpashed og træthed [7]. Co-behandling kemoterapi narkotika med naturlige forbindelser med anticancer aktivitet kan reducere doseringen af ​​kemoterapi narkotika er nødvendige.

kaffesyre phenethyl ester (CAPE), en bioaktiv komponent udvundet fra honningbi hive propolis, er en stærk antioxidant [9] , [10]. CAPE behandling i bryst-, prostata-, og leukæmiske cancerceller forårsager inhibering af NF-KB-aktivitet [11], [12], induktion af Bax [11], [13], aktivering af c-Jun N-terminal kinase (JNK) [ ,,,0],11] og p38 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK p38) [11]. CAPE inducerer apoptose via aktivering af caspase-aktivitet [11], [13] og nedregulering af Bcl-2, CIAP-1, CIAP-2, og XIAP [12], [13] i bryst-, prostata-, og leukæmiske cancerceller . Desuden CAPE inducerer cellecyklusstop gennem undertrykkelse af cyclin D1 [14], [15], cyclin E [14], og c-myc-ekspression [15], samt øger ekspression af cyclin afhængige kinaseinhibitorer p21

CIP1 [14], p27

Kip1 [14], og p16

INK4a [14] i kolon og gliom kræftceller. Disse observationer antyder, at CAPE er et potentielt terapeutisk middel til cancere.

PC-3 er en af ​​de mest almindeligt anvendte prostatacancercellelinjer etableret fra knogleafledte metastaser. PC-3-celler udtrykker ikke androgen receptor (AR) [16]. Mitoxantron, estramustin, vinblastin, etoposid, og paclitaxel er blevet vist at inducere proliferation inhibition, apoptose, og standsning af cellecyklus i PC-3-celler

in vitro

[17] – [21], samt at forsinke PC-3 xenotransplantater vækst i athymiske nøgne mus [8], [21], [22]. Behandling med 88-176 uM CAPE induceret apoptose i PC-3 celler via hæmning af NF-KB, CIAP-1, CIAP-2, og XIAP [12]. Men den opnåelige koncentration af CAPE i humant serum er omkring 5,0 ug /ml (17 uM) [23]. Vi således undersøgt, om lav koncentration (0-20 uM) i CAPE kan undertrykke spredning af PC-3 celler. Vi har også bestemt, hvis samtidig behandling af kemoterapi narkotika med CAPE viser synergistisk hæmning effekt på udbredelsen af ​​PC-3 celler.

Resultater

CAPE behandling undertrykker spredning og kolonidannelse af PC-3 celler

Trypan blå farvning viste, at CAPE dosisafhængigt hæmmede spredning af PC-3 celler med et EF

50 omkring 20,4 pM (fig. 1A). Hoechst dye-baseret 96-brønds proliferation assay viste, at væksten inhibitoriske virkning af CAPE sket inden for 24 timer efter CAPE behandling ved en koncentration så lav som 2,5 uM (fig. 1B). EF

50 for vækstinhibering af PC-3-celler var 51,4 pM, 30,7 uM, og 23,1 uM i 24, 48 og 72 h CAPE behandling, hvilket viser, at der kan akkumuleres den undertrykkende virkning af CAPE. Kolonidannelse assay viste, at behandling af 10 uM og 20 uM CAPE effektivt hæmmede dannelsen af ​​PC-3 kolonier i blød agar (Fig. 1C).

spredning af PC-3-celle behandlet med stigende koncentration af CAPE blev bestemt ved Trypan blåfarvning efter 72 timer behandling (A) eller måling af total DNA-indhold pr brønd med Hoechst 33258 fluorescens ved 96-brønd proliferation assay efter 24, 48, og 72 h behandling (B). Relative celleantal blev normaliseret til det gennemsnitlige celleantal af kontrollen (ingen CAPE behandling) af hver cellelinje i hvert enkelt eksperiment. Kolonner repræsenterer betyde for 18 gentagelser; søjler repræsenterer standardafvigelse. Stjerne (*) repræsenterer celleantallet er statistisk signifikant forskellige (

s Restaurant 0,05) sammenlignet med kontrollen. Kolonner repræsenterer betyder for 5 biologiske gentagelser; søjler repræsenterer standardafvigelse. (C) Anticancer virkning CAPE blev bestemt ved kolonidannelse assayet af PC-3-celler behandlet med 0, 10, 20 uM i 14 dage. Billedet er et repræsentativt resultat af tre biologiske gentagelser.

Siden CAPE tidligere blev rapporteret som en NF-KB-inhibitor [10], vi afgøres, om lav dasage af CAPE kan hæmme NF-KB-aktivitet ved hjælp af et plasmid -baseret luciferase reporter assay. Selvom CAPE behandling ved 40 uM inhiberede NF-KB-aktivitet, behandling med CAPE ved koncentration lavere end 40 uM havde ingen effekt på NF-KB-aktivitet (fig. 2A). Denne observation tydede på, at andre mekanismer er ansvarlige for Cape hæmmende virkning ved lav dosering.

(A) PC-3-celler transficeret med et 4X NF-KB luciferasereporterplasmid i 24 timer, blev behandlet med stigende koncentrationer af CAPE for yderligere 24 timer. Relativ luciferaseaktivitet blev bestemt til at sammenligne effekten af ​​CAPE på NF-KB transkriptionel aktivitet. (B) PC-3-celler blev behandlet med CAPE i 24, 48 eller 72 timer, høstet og farvet med propidiumiodid farvestof til flowcytometrisk analyse for cellecyklusfordeling. (*) Repræsenterer statistisk signifikant forskel (

s

0,05). Mellem de to gruppe af celler, der sammenlignes

CAPE behandling forstyrrer cellecyklusprogression

Propidium iodid (PI) farvning flowcytometri analyse afslørede, at behandling med 10-20 pM CAPE faldt cellepopulationen i G1-fasen og øget cellepopulation i sub-G1-fasen inden for 24 timer i PC-3-celler. Denne effekt var mere dramatisk ved 72 timer efter CAPE behandling (fig. 2B-2D). Imidlertid annexin V-farvning flowcytometri analyse viste, at 10-20 pM CAPE ikke inducerede apoptose i PC-3-celler (data ikke vist). Behandling med 20 pM CAPE i 72 timer resulterede i forøgelse af cellecyklusinhiberende proteiner p21

Cip1 og fald i S-fase kinase-associeret protein 2 (SKP2), phosphorylering af serin 807/811 på retinoblastoma (Rb), cycin D1 , cyclin E, c-Myc, og phosphorylering af threonin 202 /tyrosin 204 af ekstracellulær signal-reguleret kinase 1/2 (ERK1 /2) (fig. 3). Ingen ændring i p27

Kip1, total ERK1 /2, eller β-tubulin blev observeret. Sammenlignet med 24 timer og 48 timer behandling, 72 h behandling generelt forårsaget flere forandringer af protein ekspressionsniveau bortset cyclin D1. Dette kan forklare den større væksthæmning forårsaget af CAPE på 72 timer. Cyclin D1 steg efter 24 timer og 48 timer behandling, men faldt efter 72 h behandling.

Protein udtryk for c-myc, cyklin D1, cyclin E-, SKP2, phosho-Rb (S807 /811), p27

Kip1, p21

Cip1, ERK1 /2, pErk1 /2 Thr202 /Tyr204, β-tubulin, og β-actin i PC-3-celler behandlet med 20 pM CAPE i 24, 48 og 5, 10, 20 pM CAPE for 72 timer blev analyseret ved Western blotting.

CAPE behandling hæmmer overflod og aktivitet af proteiner i AKT-signalvejen

Akt spiller vigtig rolle i overlevelse og spredning af prostatakræft celler [24]. Vi således bestemt, hvis CAPE behandling undertrykker Akt signalvejen. 72 timer efter 20 pM CAPE behandling faldt overflod af total Akt, Akt1, Akt2, og Akt3 (figur 4). CAPE behandling i 24-72 timer faldt betydeligt phosphoryleringen af ​​Akt på serin 473 og threonin 308 ,. CAPE ændrede ikke den samlede overflod af phosphoinositid afhængig kinase 1 (PDK1) (fig. 4), dog phosphorylering af serin 241 på PDK1 blev reduceret med CAPE behandling. CAPE behandling også forårsaget faldet i de samlede pattedyr mål for rapamycin (mTOR) og mindre reduktion af fosforylering på serin 2448 og 2481 af mTOR. CAPE behandling ændrede ikke den totale overflod af GSK3α og GSK3p (fig. 4). Imidlertid phosphosphorylation af GSK3α S21 og GSK3p S9 blev forøget efter 24 timer og 48 timer på 20 uM CAPE behandling, men faldt til 72 timer på 20 uM CAPE behandling (fig. 4). Bcl-2 er et anti-apoptose faktor nedstrøms Akt signalering. Overekspression af Bcl-2 er tidligere blevet rapporteret at bibringe resistens af prostatakræft [5]. CAPE faldt en smule udtryk af Bd-2.

Protein udtryk for Akt, Akt1-, Akt2, Akt3, total Akt, phospho-Akt S473, phospho-Akt T308, mTOR, phospho-mTOR Ser2448 og Ser2481, GSK3α, GSK3p, phospho-GSK3α S21, phospho-GSK3p S9, PDK1, phospho-PDK1 Ser241, Bcl-2, KLF6, β-tubulin, og β-actin i PC-3-celler behandlet med 20 pM CAPE i 24, 48 og 5 , 10, 20 uM CAPE for 72 timer blev analyseret ved Western blotting.

CAPE behandling påvirker gener, der regulerer proliferation, overlevelse og død PC-3 celler

Vi studerede yderligere omfattende ændring af genekspression i PC-3-celler behandlet med 20 pM CAPE i 24 timer eller 72 timer ved mikroarray. Gener med udtryk fold ændring 1,5 og

P

0,05 blev betragtet som gener væsentligt berørt af CAPE behandling. CAPE påvirkede ekspression af 69 unikke gener efter 24 timers behandling (tabel S1). 53 gener blev opreguleret og 16 gener blev nedreguleret. Behandling med CAPE i 72 h ændrede udtryk af 147 unikke gener (Tabel S2). 122 gener var opreguleret mens 25 gener blev nedreguleret. 25 gener blev almindeligvis ændret i både 24 timer og 72 timer behandling (figur 5, tabel S3). Blandt de 25 gener, 3 gener var nedreguleret (CYP1B1, SCG5, PADI4) og 22 gener blev opreguleret (LY96, LOC728285, TM4SF19, RGS2, PI3, AKR1C2, GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, RND3, KRT34, HIST2H2AA3, AKR1C4, KLF4, DUSP5, nov, GK, CDKN1A, CXCL2, DUSP1, og HIST1H4H) (fig. 5). Analyse af alle de 191 genprober ramt af CAPE behandling enten på 24 timer eller 72 timer ved hjælp Ingenuity Pathway Analysis (IPA) afslørede, at CAPE behandling påvirkede gener involveret i regulering af celledød, proliferation og overlevelse. Blandt de gener, bliver påvirket af CAPE behandling, 52 gener involveret i celledeling regulering (

s værdi

= 9,82 × 10

-11), 41 gener involveret i regulering af cellevækst (

p-værdi

= 1,40 × 10

-10), 68 gener involveret i celledød regulering (

s værdi

= 1,40 × 10

-12), og 27 gener involveret i celle overlevelse regulering (

s

= 3,43 × 10

-6). Komplet liste af gener prober involveret i disse signalveje er vist i tabel S4.

Gener almindeligt berørt på både tid punkter er i rød farve, mens de specifikt påvirket enten tidspunkt er i sort. IPA-analyse af de unikke gener (n = 191) gener ændret enten i 24 timer eller 72 timer CAPE behandling indikerede, at gruppen af ​​gener, der regulerer flere cellefunktioner, herunder celleproliferation (p-værdi 9,82 × 10

-11, 52-gener ), cellevækst (p-værdi 1,40 × 10

-10, 41 gener), celledød (p-værdi 1,40 × 10

-12, 68 gener) og celleoverlevelse (p-værdi 1,40 × 10

-6, 27 gener).

Vi valideret nogle af de, der berøres af CAPE behandling med kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) gener. 17 ud af 18 gener (GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, RND3, KLF4, DUSP5, nov, CDKN1A, CXCL2, DUSP1, KLF6, TOP2A, PPP1R15A, CAV2, S100P, og GADD45A) testet af QRT-PCR viste lignende ændring mønster efter 24 timer eller 72 timer CAPE behandling i forhold til gen-microarray. Den eneste undtagelse er TUBA1A. Vi har ikke observere nogen ændring af TUBA1A genet under CAPE behandling af QRT-PCR (fig. 6). Western blotting assay viste, at protein niveau KLF6 blev forøget med CAPE behandling (fig. 4).

Gen-ekspression niveau af GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, RND3, KLF4, DUSP5, nov, CDKN1A, CXCL2, DUSP1, KLF6, TOP2A, PPP1R15A, CAV2, S100P, GADD45A, og TUBA1A i PC behandlet med 0 eller 20 uM CAPE i 24 timer eller 72 timer blev bestemt ved QRT-PCR.

Co-behandling af CAPE med kemoterapeutiske lægemidler undertrykt spredning af PC-3 celler

Endelig har vi undersøgt, om co-behandling af CAPE på serum-tilgængelig dosis (0-20 uM) med almindeligt anvendte kemoterapi narkotika (etoposid, paclitaxol, vinblastin , mitoxantron, og estramustin) kan undertrykke væksten af ​​PC-3 celler mere effektivt end behandling med kemoterapi narkotika alene. EF

50 af CAPE, etoposid, paclitaxol, vinblastin, mitoxantron, og estramustin til hæmning spredning af PC-3 celler var 18,3 pM, 1,7 pM, 3,0 nM, 2,1 nM, 5,9 nM, og 13,0 uM. Behandling af 20 uM CAPE undertrykt vækst af PC-3-celler mere effektivt end behandling med 1,0 pM etoposid, 2,5 nM paclitaxol, 5 nM mitoxantron, 2 nM vinblastin, eller 10 uM estramustin (figur 7). Når co-behandling med 20 pM CAPE, 0,5 pM etoposid, 1 nM paclitaxol, 1 nM vinblastin, 2,5 nM mitoxantron, og 8 uM extramustine forårsaget vækstinhibering svarende til den højeste dosis testede vi (figur 7). Synergistisk virkning betyder undertrykkende virkning af to lægemidler, som behandles sammen, er større end summen af ​​deres separate undertrykkende virkning ved de samme doser, mens antagonistiske virkninger: den undertrykkende virkning af to lægemidler er mindre end summen af ​​virkningen af ​​de to kemikalier i separat. Ifølge definitionen, co-behandling af CAPE viste synergistisk effekt med vinblastin, estramustin eller paclitaxol, og antagonistisk effekt med etoposid eller mitoxantron (figur 7).

spredning af PC-3 celler behandlet med stigende dosering ( 0, 5, 10, 20 uM) i CAPE i kombination med stigende koncentration af etoposid (A), paclitaxol (B), vinblastin (C), mitoxantron (D), og estramustin (E) i 72 timer blev bestemt ved 96- godt proliferationsassay. Den højre del af figuren viser forholdet mellem forventede celletal /observerede celleantal. For eksempel behandling af 5 uM CAPE eller 1 nM vinblastin nedsætter celle antal PC-3 til 80.9% og 88,7%, sammenlignet med kontrollen (ingen behandling). Det forventede celle antal behandling kombinerer 5 uM CAPE og 1 nM vinblastin er 0,809 * 0,887 = 71,8%. Den observerede celleantal er 48,8% sammenlignet med kontrollen. Så forholdet er 0,718 /0,488 = 1,5. Ratio større end en repræsenterer synergi af væksthæmning, mens forholdet er mindre end én repræsenterer antagonistisk effekt.

Ifølge vores observation, p21

Cip1 spiller vigtig rolle i reguleringen af ​​væksthæmning induceret af CAPE behandling . For at bekræfte dette, vi bankede ned p21

Cip1 i PC-3 og bestemt hvis disse PC-3 celler bliver mere modstandsdygtige over for CAPE behandling. Som forventet, efter 24 timer af CAPE behandling, PC-3 celler med mindre p21

Cip1 proteinekspression var mere resistente over for væksthæmning forårsaget af CAPE behandling (fig. 8).

Protein niveauer af vildtype PC-3, PC-3-celler transfektere med scramble-kontrol (20 nM), og PC-3-celler transficeret med p21

Cip1 siRNA (20 nM) blev bestemt ved Western blotting assay. Proliferation af disse PC-3-celler behandlet med 20 pM CAPE i 24 timer blev bestemt ved 96-brønds plade proliferation assay som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder.

Discussion

Vores observation foreslog at koffeinsyre phenethyl ester (CAPE) kan inhibere proliferation og kolonidannelse af PC-3 humane prostatacancerceller ved koncentration 10-20 uM. Disse observationer tydede på, at den opnåelige koncentration af CAPE i human serum, (17 uM) [23], er muligvis at forårsage væksthæmning i prostata tumorer hos patienter.

Cyclin-afhængig kinase inhibitor p21

CIP1 binder og inhiberer kinase aktiviteterne i Cdk2 /cyclin A, Cdk2 /cyclin E, Cdk4 /cyclin D, og ​​Cdk6 /cyclin D komplekser [25]. p21

Cip1 kan interagere med prolifererende cellekerneantigen (PCNA), en DNA-polymerase tilbehør faktor, og spiller en regulerende rolle i S-fase DNA-replikation og DNA-beskadigelse reparation [26]. SKP2 er medlem af F-box proteinfamilien. SKP2 udgør et af de fire underenheder af ubiquitin protein ligase kompleks kaldet SCFs (SKP, Cullin, F-boks med komplekse), der fungerer i fosforylering-afhængige ubiquitinering. SKP2 er et væsentligt element i den cyklin A-Cdk2 S-fase-kinase [27]. Reduktion i phosphorylering af Rb begrænser celleproliferation ved at inhibere E2F aktivitet [28]. ERK1 og ERK2 er involveret i kontrollen af ​​mange fundamentale cellulære processer, herunder celleproliferation, overlevelse, differentiering, apoptose, motilitet og metabolisme. ERK1 /2 spiller vigtige roller i kanonisk MAPK (mitogen-aktiveret protein kinase) signalvejen og er kritiske regulatorer af vækst og overlevelse [29]. CAPE induceret p21

Cip1 og reduceret cyclin D, cyclin E, SKP2, og phosphorylering af Rb og ERK1 /2 (fig. 3). CAPE kan således undertrykke væksten af ​​PC-3-celler via disse proteiner [30].

Akt er en serin /threoninproteinkinase regulering inhibering af apoptose og stimulering af celleproliferation. Opregulering af PI3K /er Akt aktivitet forbundet med dårlig klinisk resultat af prostatakræft [31]. Der er tre mammale isoformer af dette enzym, Akt1, Akt2, og Akt3 [32], [33]. Protein overflod og aktivitet af Akt3 er tidligere blevet foreslået at bidrage til en mere aggressiv kliniske fænotype af androgen non-responsive prostata og brystcancer [34]. Akt3 enzymatisk aktivitet var ca. 20-60 gange højere i AR-negative PC-3 og DU-145 celler i forhold til AR-positive LNCaP prostata kræftceller [34], [35]. Vi observerede, at CAPE undertrykte Akt signalering-relaterede proteiner, herunder Akt1, Akt2, Akt3, total Akt, mTOR, Bcl-2, Pakt Ser 473, Pakt Thr 308, pmTOR Ser 2448/2481, pGSK3α Ser21, pGSK3β Ser9, og pPDK1 Ser241 . CAPE blev for nylig rapporteret at undertrykke phosphorylering af Akt i andre humane celler, såsom CD4 + T-celler [36], koronar glatte muskelceller [37], og A549 lungecancerceller [38]. Phosphatase og tensin homolog (PTEN) proteinet virker som en phosphatase for at dephosphorylere phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate. PTEN kontrollerer negativt phosphoinositid 3-kinase /Akt signalvej [39]. PC-3 celler erhverve en homozygot sletning af PTEN, således Akt er konstant aktiv. Der er to phosphoryleringssteder på Akt, threonin 308 og serin 473. Phosphorylering af Thr308 på Akt aktiveres af PDK1 [40]. Phosphorylering af serin 473 aktiveres af mTOR kinase, dens associerede protein rektor, og SIN1 /MIP1 [41], [42]. CAPE phosphorylering af serin 241 på PDK1 og svækkede phosphoryleringen af ​​serin 2448 og 2481 på mTOR (fig. 4). Reduktion af PDK1 og mTOR aktivitet kan derfor bidrage til faldet i phsphorylation på Akt. Aktiviteterne af glycogensyntasekinase 3 alpha (GSK3α og GSK3p vides at blive inhiberet af Akt-medieret phosphorylering på Ser21 og Ser9 henholdsvis begrænser deres evne til at phosphorylere cellecyklus regulering proteiner, såsom cyclin D1 og p21

Cip1 [43 ], [44]. Phosphosphorylation af GSK3α S21 og GSK3p S9 blev forøget efter 24 timer og 48 timer på 20 uM CAPE behandling, men faldt til 72 timer på 20 uM CAPE behandling (fig. 4). øget phosphorylering af GSK3α S21 og GSK3p S9 kan bidrage til forøgelsen af ​​p21

Cip1 ved 24 timer og 48 timer efter CAPE behandling. GSK3p-afhængig phosphorylering af cyclin D1 medieret nuklear eksport og hurtig nedbrydning i cytoplasmaet af cyclin D1 [45]. Reduktion af GSK3βactivity følge af stigning af phosphorylering (fig. 4) resulterede i mindre phosphorylering af cyclin D1 og derfor akkumulering af cyclin D1 ved 24 timer og 48 timer (fig. 3). Forhøjelse af GSK3βactivity grundet fald i phosphorylering (fig. 4) vil derfor nedsætte overflod af cyclin D1 efter 72 timer (fig. 3). Nedsat phosphorylering af GSK3α og GSK3p på 72 timer var i overensstemmelse med den formindskede phosphorylering af Akt. Undertrykkelse af Akt signalering ved CAPE kan bidrage til hæmning af overlevelse og vækst i PC-3 celler.

Vi har bemærket, at gener, der berøres af CAPE på 24 timer og 72 timer efter behandling moderat var korreleret (

r =

0,56, fig. 5). Der var kun 25 påvirket betydeligt gener til fælles mellem disse to tidspunkter. Da væksthæmning og cellecyklus forstyrrelse forårsaget af CAPE behandling startet inden 24 timer og den undertrykkende effekt akkumuleret over tid, vi hypotese, at de vigtigste mål gener for anticancer aktivitet af CAPE var disse 25 almindelige gener. Krüppel-lignende faktor 4 (KLF4) transaktiverer p21

Cip1 promotor og inhiberer proliferation gennem aktivering af p21

Cip1 samt direkte undertrykkelse af cyclin D1 og cyclin B1-genekspression [46] – [48]. November genet koder for protein CCN3 (Nov), der inhiberer celleproliferation via Notch /p21

Cip1 pathway [49]. Elevation af KLF4 og nov gener kan undertrykke PC-3 vækst via p21

Cip1. Vækst /differentieringsfaktor-15 (GDF-15) er et divergerende TGFp familiemedlem, der har været impliceret i inhibering af tumorvækst og øget tumorindtrængen [50]. Et par gener er cytokiner, der er involveret i inflammation reaktion, såsom CCL20 [51], CXCL2 [52], CXCL5 [53]. De blev fundet opreguleret, hvilket antyder, at CAPE inducerer inflammation reaktion i PC-3-celler. Desuden CAPE behandling øger RhoE /Rnd3. Opregulering af den lille G-protein RhoE /Rnd3 /Rho8 inhiberer proliferationen af ​​prostatacancerceller ved at fremme apoptose og inhibering cellecyklusprogression [54].

Udover de 25 almindeligt ændrede gener, nogle differentielt udtrykte gener specielt efter 24 timer eller 72 timer behandling også regulere celle overlevelse, formering, eller celledød. CAPE behandling steget KLF6, S100P, GADD45A, PPP1R15A, S100P, men faldt TOP2A og CAV2. Kruppel-lignende faktor 6 (KLF6) er et zinkfinger transskriptionsfaktor og fungerer som tumorsuppressorgen i human prostatacancer [55]. KLF6 opregulerer p21

Cip1 i en p53-uafhængig måde og reducerer celledeling [55] væsentligt. S100P protein regulerer calcium signaltransduktion, cytoskelet interaktion, proteinphosphorylering, transkriptionel kontrol, cellecyklusprogression og -differentiering. Elevation af S100P i PC3-celler fremmes cellevækst, øget andelen af ​​S-fase celler, nedsat basal apoptose sats, fremmet forankringsuafhængig vækst i blød agar, og bibringe resistens over for kemoterapi [56]. GADD45A protein reagerer på miljømæssige belastninger ved at mediere aktivering af p38 /JNK. Den GADD45 proteinet er blevet beskrevet at danne et kompleks med p21

Cip1. P21

Cip1-bindende domæne af GADD45A koder også Cdc2-bindingsaktivitet. GADD45A interagerer med Cdc2, dissocierer Cdc2-cyclin B1-kompleks, ændrer cyclin B1 kernelokalisering, og således hæmmer aktiviteten af ​​Cdc2 /cyclin B1 kinase [57] – [59]. PPP1R15A (Proteinphosphatase 1 regulatoriske underenhed 15A, også kendt som GADD34) er blevet vist at inducere vækststandsning og apoptose. PPP1R15A opregulering øger p21

Cip1 proteinekspression og inducerer p21

Cip1 promotor-aktivitet [60].

vinblastin, paclitaxol, og CAPE påvirke genekspression af α-tubulin og β-tubulin (figur S1, S2), mens etoposid, mitoxantron, og CAPE påvirke genekspression af type II topoisomerase (fig S3). Imidlertid etoposid inducerer p21

Cip1 via p53 og nedregulering af c-Myc i cancerceller [61], [62]. Mitoxantron inducerer p21

Cip1 [63]. Vinblastin inducerer apoptose via reduktion af p21

Cip1 [64]. Paclitaxol inducerer en Akt-afhængig phosphorylering af p21

Cip1 fører til en sammenslutning af p21

Cip1 med 14-3-3 og dermed akkumulering af den phosphorylerede form af p21

Cip1 i cytoplasmaet, som forhindrer den inhiberende virkning af p21

Cip1 [65]. Ingen undersøgelsesrapporter forholdet mellem p21

Cip1 og estramustin. Da CAPE behandling stiger både mRNA og protein niveau af p21

Cip1 (fig. 3), og knockdown af p21

Cip1 i PC-3 celler lavet celler mere resistente over for CAPE behandling (fig. 8), kan CAPE undertrykke vækst og overlevelse af PC-3-celler mere ligner etoposid og mitoxantron, men mindre ligner vinblastin, paclitaxol, og estramustin. Udover CDKN1A (p21

Cip1 gen), CAPE behandling også øget genekspression af KLF4, KLF6, nov, GADD45A, PPP1R15A. Disse gener alle undertrykke proliferation via p21

Cip1. Skønt samtidig behandling med CAPE undertrykt flere PC-3-celler end behandling med kemoterapi lægemiddel alene, CAPE viste kun synergistisk undertrykkende virkning med vinblastin, paclitaxol, og estramustin (fig. 7). CAPE behandling også undertrykt overflod og fosforylering af Akt, samt opstrøms og nedstrøms signalering proteiner i Akt signalering. Vi tror derfor, at p21

Cip1 induktion og undertrykkelse af Akt signalering begge spiller vigtig rolle i væksthæmning forårsaget af CAPE behandling i PC-3 celler. Vi opsummerer Akt /p21

Cip1 signalvejen netværk påvirkes af CAPE behandling i PC-3 i figur 9.

Protein overflod eller aktivitet, der stimuleres af CAPE behandling er mærket med røde opadgående pile, mens de undertrykkes af CAPE behandling er mærket med blå nedadgående pile.

som konklusion, vores observationer givet indsigt i den molekylære mekanisme af CAPE anti-proliferativ effekt i PC-3 prostatacancerceller. Vore data antydede, at CAPE administration kan være anvendelig som en potentiel adjuvans terapi i kombination med kemoterapeutika mod metastatisk prostatacancer.

Materialer og metoder Salg

Kemikalier

kaffesyre AICD phenethyl ester, etoposid, paclitaxol, vinblastin, estramustin, mitoxantron og blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA).

Cellekultur

PC-3-celler var generøse gave fra Dr. Shutsung Liao lab (University of Chicago) og blev opretholdt i DMEM (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA), penicillin (100 U /ml ) og streptomycin (100 ug /ml).

celleproliferationsassay

Relativ celleantal blev analyseret ved at måle DNA-indholdet i cellelysater med det fluorescerende farvestof Hoechst 33258 (Sigma) som tidligere beskrevet [66] – [69]. EF

50 (koncentration af stof til at forårsage 50% væksthæmning) af lægemidler på PC-3 celler blev bestemt ved en Excel add-in program ED50V10.

Soft Agar Colony Formation Assay

8000 celler blev suspenderet i 0,3% lavtsmeltende agarose (Lonza, Allendale, NJ, USA) med 10% føtalt bovint serum i DMEM-medium og derefter lagt oven på 3 ml 0,5% lavtsmeltende agarose plus 10% føtalt bovint serum i DMEM-medium i 6 cm skåle. Cellerne fik lov at vokse ved 37 ° C med 5% CO

2 i 14 dage. Pladerne blev farvet med 0,005% krystalviolet i 30% ethanol i 6 timer.

Luciferase-reporter assay

PC-3-celler blev podet ved 1,9 x 10

5 celler /brønd i en 12-brønds plade i DMEM indeholdende 10% FBS. 24 timer efter udpladning PC-3-celler blev transficeret med pRL-TK-Renilla luciferase plasmid (normalisering vektor; 8 ng /brønd), 4X NF-KB (reportergenet vektor; 800 ng /brønd) ved anvendelse af PolyJet ™ in vitro DNA transfektionsreagens (SignaGen Laboratories, Rockville, MD). 24 timer efter transfektion blev celler behandlet med stigende koncentrationer af CAPE. Efter yderligere 24 timer blev celler lyseret i 100 pi passive lysis buffer (Promega, Madison, WI, USA) og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af en dobbelt-Luciferase kit (Promega) i en 20/20

n luminometer Turner Biosystems .

flowcytometrisk analyse

Celler blev sået i 6 cm skåle i 4,5 ml medier og CAPE tilsættes 24 timer efter plating. Efter angivne tid (24, 48, 72 timer) af kulturen i nærvær af forskellige koncentrationer af CAPE blev celler fjernet med trypsin og fikseret i 70% ethanol i PBS natten over ved -20 ° C. Fikserede celler blev vasket med PBS, behandlet med 0,1 mg /ml RNase A i PBS i 30 min, og derefter suspenderet i 50 ug /ml propidiumiodid i PBS.