PLoS ONE: Curcumin modulerer DNA Methylering i Colorectal Cancer Cells

Abstrakt

Formål

De seneste oplysninger tyder på, at flere kosten polyphenoler kan udøve deres kemoforebyggende effekt gennem epigenetiske modifikationer. Curcumin er en af ​​de mest undersøgte kosten kemoforebyggende midler til forebyggelse coloncancer, men dens virkninger på epigenetiske ændringer, navnlig DNA-methylering, er fortsat uklare. Brug systematiske genom-dækkende tilgange, vi havde til formål at belyse effekten af ​​curcumin på DNA methylering ændringer i kolorektale cancerceller.

Materialer og metoder

For at vurdere effekten af ​​curcumin på DNA methylering, tre CRC cellelinjer, HCT116, HT29 og RKO, blev behandlet med curcumin. 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-CdR) og Trichostatin A behandlede celler blev anvendt som positive og negative kontroller til DNA methylering ændringer hhv. Methylering status LINE-1 gentagne elementer, DNA promoter methylering microarrays og genekspression arrays blev brugt til at vurdere globale methylering og genekspression ændringer. Valideringen blev gennemført ved hjælp af uafhængige mikroarrays, kvantitativ bisulfit pyrosekventering og qPCR.

Resultater

Som forventet, genom-dækkende methylering mikroarrays viste betydelig DNA hypometylering i 5-aza-CdR-behandlede celler (betyder p-værdier på 0,12), men ikke-signifikante ændringer i middel β-værdier blev observeret i curcumin-behandlede celler. I sammenligning med mock-behandlede celler, forekom curcumin-induceret DNA-methylering ændringer i en tidsafhængig måde. I modsætning til den generelle, ikke-specifikke globale hypometylering observeret med 5-aza-CdR, curcumin behandling resulterede i methylering ændringer på udvalgte, delvist methyleret loci i stedet for fuldt methylerede CpG sites. DNA methylering ændringer blev støttet af tilsvarende ændringer i genekspression på både op- og ned-regulerede gener i forskellige CRC cellelinjer.

Konklusioner

Vores data giver tidligere ukendt bevis for curcumin-medieret DNA methylering ændringer som en potentiel mekanisme for tyktarmskræft chemoprevention. I modsætning til ikke-specifik global hypometylering induceret af 5-aza-CdR, forekom curcumin-induceret methylering ændringer kun i en delmængde af delvist methylerede gener, der giver yderligere mekanistiske indsigt i den potente kemoforebyggende virkning af denne kosten nutraceutical.

Henvisning: Link A, Balaguer F, Shen Y, Lozano JJ, Leung H-CE, Boland CR, et al. (2013) Curcumin modulerer DNA Methylering i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 8 (2): e57709. doi: 10,1371 /journal.pone.0057709

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina

Modtaget: August 22, 2012; Accepteret: 25 Jan 2013; Publiceret: 27 feb 2013

Copyright: © 2013 Link et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den nuværende arbejde blev støttet af tilskud R01 CA72851 og CA129286 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, og midler fra Baylor Research Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Ajay Goel øjeblikket tjener som en redaktionel bestyrelsesmedlem for PLoS ONE, men dette gør ikke ændre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de førende dødsårsager på verdensplan, der er ansvarlig for ca. 10% af den samlede dødelighed cancer-relaterede [1]. Omkring 3-5% af alle CRCs skyldes arvelige genetiske defekter og op til 25% af patienterne kan have en vis grad af familiality for denne sygdom, men størstedelen af ​​CRCs forekomme i en sporadisk måde i fravær af en dokumenteret familiehistorie. Stigende data viser, at der ud over genetisk ustabilitet fænotyper såsom kromosomale og mikrosatellit instabilitet, epigenetiske ændringer, der omfatter DNA-methylering ombygninger, histon modifikationer og ændringer i miRNA ekspression, kan spille en vigtig rolle i initieringen og progressionen af ​​CRC [2] – [ ,,,0],4].

i modsætning til genetiske defekter, epigenetiske ændringer er mere dynamiske og kan være påvirket af aldring, miljømæssige, livsstil og kostfaktorer, som menes at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​mere end to tredjedele af alle menneskelige kræftformer [5] – [7]. Aberrant DNA-methylering, der består af både fokal

hypermethylering

af promotor- CpG-øer, der resulterer i den transkriptionelle inaktivering af gener, og global

hypometylering

af DNA, der letter kromosomal ustabilitet og aneuploidi, og er en af ​​de meget omfattende undersøgt epigenetiske begivenheder i kræft [8] – [11]. I betragtning at DNA methylering ændringer er potentielt reversible, og ofte forud genetiske begivenheder i flertrins kolorektal carcinogenese, giver en spændende og lovende muligheder for forebyggelse og behandling [12] kræft -. [17]

Baseret på dette koncept , epigenetisk terapi er i øjeblikket ved at blive undersøgt, med det mål at forhindre kræftceller i at erhverve afvigende DNA methylering og bidrage til at genskabe “normale” DNA methylering og genekspressionsmønstre til vigtige cancer-relaterede gener. Derfor har nukleosidanaloger, såsom 5-azacytidin og 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-CdR) blevet identificeret som potente DNA methyl transferase (DNMT) hæmmere. Inkorporering af disse nukleosidanaloger direkte i DNA under replikation samt proteosomal nedbrydning af DNMT1 enzym, som katalyserer

de novo

hypermethylering udgør to centrale mekanismer, der er ansvarlige for deres demethylere aktiviteter [18] – [20]. Der er en stigende erkendelse af, at ophævelsen af ​​uregelmæssig DNA methyleringsmønstre i cancerceller kan være effektiv til behandlingen og forebyggelse [21]. Flere sådanne nukleosidanaloger øjeblikket undersøges til behandling af blodkræftsygdomme og er i den tidlige fase kliniske forsøg for andre faste maligniteter; Desværre har bred anvendelighed af disse midler blevet hæmmet af toksicitet og bivirkninger. Desuden ikke var specifikke, der tillader global hypometylering af selv fuldt methylerede gener og resulterer i kromosomal ustabilitet begrænser anvendelsen af ​​disse forbindelser som potentielle kemoforebyggende midler [8], [10]. I en søgen efter at søge alternative kemoforebyggende strategier, har flere fytokemikalier dukket op som potentielt potente valg i kraft af en mangel på væsentlige toksicitetsprofiler [22]. Endvidere data antyder, at forstyrrelser i kosten næringsstoffer såsom folat og selen kan påvirke DNA-methylering, både

in vitro

in vivo

, som følge af en inhibering af DNMT1 proteinekspression og enzymatiske aktivitet [23]. Kosten polyphenoler, såsom (-) – epigallocatechin-3-gallate (EGCG) fra grøn te og genistein fra sojabønne, er også blevet vist at inhibere DNMT aktivitet i cancercellelinier [24], [25]. DNMT hæmmende aktivitet er forbundet med demethylering og reaktivering af flere methylering-lyddæmpet gener såsom

p16, RAR, MGMT, MLH1, BTG3

GSTP1

i humane cancerceller, hvilket tyder på en mulig kemoforebyggende effekt på grund af epigenetisk modifikation fremkaldt af disse kosten botaniske [25], [26]. Imidlertid forbliver den variable demethylere effekten af ​​polyfenoler dårligt forstået, fordi de fleste publicerede undersøgelser har rapporteret data for kun håndfuld gener, og mange af disse epigenetiske effekter ikke har været reproducerbar i uafhængige undersøgelser [27], [28].

Curcumin (diferuloylmethane), en naturlig forbindelse afledt af krydderiet gurkemeje (

Curcuma longa

), er blevet anvendt til behandling af forskellige inflammatoriske sygdomme i traditionelle indiske og kinesiske systemer for medicin. I de seneste årtier har en omfattende og dybdegående krop offentliggjort videnskabelig litteratur viste, at kemoforebyggende virkninger af curcumin formidles af en række molekylære mekanismer, herunder dets direkte eller indirekte samspil med forskellige transkriptionsfaktorer, enzymer og regulatoriske proteiner, der spiller en central rolle i vigtige cancer-relaterede processer såsom inflammation, proliferation, overlevelse, migration, angiogenese, invasion og metastase [22]. Beviser for effektiviteten af ​​curcumin som anticancer eller kemoforebyggende middel er trukket fra hundredvis af undersøgelser foretaget i cellekultursystemer, dyremodeller og mennesker [29]. Nyere undersøgelser er begyndt at erkende curcumin effekt ved modulering epigenetiske processer i cancerceller, hvori curcumin har vist sig at være en histonacetyltransferase (HAT) inhibitor [30], [31], samt en potentiel DNMT1 inhibitor, hvilket resulterer i hypometylering af forskellige gener, herunder RARβ2 i livmoderhalskræft celler [32] – [34]. Men rollen som curcumin som en DNA-hypomethylerende sammensatte er ikke blevet systematisk evalueret som i endnu, og dets potentiale demethylere er ikke blevet gengivet i sin helhed i andre undersøgelser [32], [33].

Derfor , i den foreliggende undersøgelse, udførte vi en omfattende og systematisk analyse for at undersøge virkningen af ​​curcumin på DNA-methylering i colon cancerceller. Genom-dækkende DNA methylering analyser og samtidig genekspression profilering blev udført i CRC-cellelinjer behandlet med kort og langt sigt curcumin behandling. Heri, viser vi, at curcumin modulerer DNA methylering ændringer i cancerceller; desuden er sådanne ændringer ofte bekræftes med tilsvarende ændringer i genekspression. Endelig giver vi hidtil ukendt beviser, at i modsætning til den globale hypometylering induceret af 5-aza-CdR, DNA-methylering ændringer forbundet med curcumin behandling kun forekommer i en undergruppe af primært delvist methylerede gener, og på en tidsafhængig måde.

Materialer og Metoder

Cell kultur

Tre humane CRC cellelinjer, HCT116 (mikrosatellit ustabil eller MSI), RKO (CpG Island methylering fænotype eller CIMP) og HT29 (mikrosatellit stabil eller MSS ), blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler blev dyrket i IMDM-medium (Invitrogen, Rockville MD) under standardbetingelser med 10% føtalt bovint serum og 5% CO

2 ved 37 ° C. Cellelinjen autenticitet blev ofte bekræftet ved at analysere forskellige genetiske og epigenetiske markører hver 6-8 måned.

Curcumin Behandling

Curcumin (Sigma-Aldrich, MO, USA) aktier blev fremstillet ved at opløse det i dimethylsulfoxid (DMSO) ved 10 mM, og små alikvoter blev opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. For at bestemme virkningen af ​​curcumin på DNA-methylering, blev alle tre CRC cellelinier udsættes for 7,5-10 uM curcumin til kortvarig (6 dage; STC) eller langvarig (240 dage; LTC) behandling. Frisk curcumin dyrkningsmedium blev udskiftet hver anden dag i løbet af behandlingen. Kontrol cellelinier uden curcumin behandling blev dyrket med hvert sæt af behandlinger for samme tidsrum.

5-aza-CdR og TSA Behandling

5-aza-CdR behandling blev udført som tidligere beskrevet [ ,,,0],35]. Kort fortalt blev 5-aza-CdR opløst i PBS (pH 7,5) ved 5 mM og små prøver blev holdt frosne ved -20 ° C. Fireogtyve timer efter podning blev CRC-celler behandlet med 2,5 pM 5-aza-CdR (Sigma-Aldrich, MO, US) i 24 timer, og cellerne blev høstet efter 48 timer. Trichostatin A (TSA) blev opløst i ethanol ved 0,3 uM. Celler blev podet ligeligt og efter vækst natten over blev behandlet med TSA i 24 timer. Cellerne blev pelleteret og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse.

MTT levedygtighedsassayet

Virkningerne af curcumin på cellelevedygtighed blev bestemt i en MTT assay som er baseret på 3- (4 , 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid optagelse. Celler (2 x 10

3 /brønd) blev podet i plader med 96 brønde 24 timer før curcumin behandling. Efter 72 timer af curcumin behandling blev MTT-opløsning tilsat til hver brønd og inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. Celler blev inkuberet med SDS-buffer (10%) med 0,01 M HCI natten over, og absorbansen blev målt ved 570 nm med et spektrofotometer. Uafhængige forsøg blev udført tre gange in triplo.

bromdeoxyuridin (BrdU) Proliferation Assay

celleproliferation analyser blev udført ved anvendelse af den kolorimetriske Cell Proliferation ELISA, BrdU kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) efter producentens anvisninger. Kort fortalt, 2 × 10

3-celler blev dyrket i plader med 96 brønde og behandlet med curcumin i 72 timer. Proliferationsindeks blev målt ved BrdU-inkorporering efter producentens anvisninger. Eksperimenter blev udført tre gange i 3 uafhængige eksperimenter.

udpladningseffektivitet

For at teste for udpladningseffektivitet blev celler udpladet ved lav tæthed i 6-brønds plader og behandlet ved behandlingen ovenfor beskrevne protokol i 12-16 dage, indtil individuelle celler dannet tydeligt synlige kolonier. Derefter blev cellerne fikseret med 10% formalin og farvet med 0,1% krystalviolet. Efter vask, plader blev lufttørret og digitale billeder blev taget. Uafhængige forsøg blev udført tre gange i tre eksemplarer

DNA Extraction, bisulfit Ændring og Methylering profilering (Infinium Methylering Assay)

DNA ekstraktion blev udført med DNeasy Blood Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Genomisk DNA blev bisulfit modificerede (EZ DNA methylering Gold Kit, Zymo Research, skal du tilføje by /stat) som tidligere [35] beskrevet. For at analysere virkningen af ​​curcumin på DNA-methylering, udførte vi DNA methylering profilering ved anvendelse af Infinium methylering assay med HumanMethylation27 BeadChip mikroarrays (Illumina, San Diego, CA), som er i stand til samtidigt at analysere status for methylering af 27,578 individuelle bindingssteder for CpG dækker over 14.000 gener [36]. Hele genomamplifikation, mærkning, hybridisering og scanning blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger ved genomforskning core facilitet på Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine, Houston, TX. Status for methylering blev målt som forholdet mellem signalet fra en methyleret sonde i forhold til både methylerede og ikke-methylerede probesignaler. Methylering forhold blev ekstraheret under anvendelse af Methylering moduler i Illumina Bead Studio følgende gennemsnitlige normalisering, og den kvantitative β-værdi lå mellem 0 (0% methylering) til 1 (100% methylering). P-værdien cut-off for detekterbare probesignaler blev sat til 0,05. For methylering analyser blev en Δβ-værdi på ≥0.1 (10% methylering) defineret som signifikant [37].

Kvantitative methylering Analyser

Vi validerede methylering microarray data ved uafhængige enkelt gen /promotorelementer kvantitative methylering assays. Afhængigt af methylering assay design features, vi bruges enten bisulfit pyrosekventering (PSQ HS 96A pyrosekventering-system, Qiagen, Valencia, CA) eller real-time baseret qMSP til kvantitativ methylering analyser som tidligere [37] beskrevet, [38]. Primer sekvenser anvendt til begge metoder er fastsat i supplerende tabel S1.

Gene Expression Microarray Analyser

Parallelt med methylering profilering, vi udførte microarray genekspression analyser efter fabrikantens anvisninger og en tidligere etableret protokol [39]. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy mini-kit (Qiagen, Valencia, CA) og amplificeret ved anvendelse Illumina s TotalPrep RNA Amplification Kit. RNA integritet blev vurderet ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer. Mærket cRNA blev hybridiseret natten Human HT12 V3 chips, vasket, og scannet på en Illumina BeadStation-500. Illumina s BeadStudio version 3.1 blev anvendt til at generere signalintensitetsforskellene værdier fra scanningerne, trække baggrunden, og skalere hver mikroarray midterplan gennemsnitlige intensitet for alle prøver (per-chip normaliserings-). Normalisering blev udført under anvendelse fraktiler med Lumi R-pakke. Fold-ændringer blev beregnet i forhold til deres respektive kontrol som beskrevet andetsteds [35]. Opfindsomhed pathway analyse (IPA, Ingenuity Systems, Inc. CA, USA) blev udført for at evaluere und kategorisere differentielt udtrykte gener i forskellige funktionelle veje.

Statistiske Analyser

Alle data blev analyseret ved hjælp af Graph Pad Prism 4.0 (San Diego, CA, USA) statistisk software. Forskelle mellem to grupper blev analyseret under anvendelse af t-test. Forskelle mellem mere end to grupper blev analyseret ved hjælp af gentagne målinger ANOVA og Bonferroni s multiple sammenligninger som

post hoc

test. To sidet p-værdier for 0,05 blev betragtet signifikant

Resultater

Curcumin Hæmmer Cell Levedygtighed og spredning i CRC cellelinier

Tidligere undersøgelser har givet flere niveauer af beviser. for anti-cancer virkninger af curcumin ved at påvirke celleproliferation, apoptose, migration og invasion. For at bestemme de effektive og ikke-toksiske curcumin koncentrationer i vores panel af CRC cellelinier (figur 1A) vi først udførte sprednings- og cellelevedygtighedsassays i CRC cellelinjer udsat for forskellige koncentrationer af denne kosten polyphenol. Tre humane CRC cellelinier, der repræsenterer forskellige epigenotypes af humane coloncancerformer blev anvendt: HCT116 (mikrosatellit ustabil – MSI – cancercellelinie grund kimcellelinje mutation i

MLH1,

fejlparringsreparationsgen), RKO (MSI cancercelle linje i forbindelse med

MLH1

promotor hypermethylering i forbindelse med CpG øen promotor methylering fænotype eller CIMP) og HT29 (mikrosatellit stabil eller MSS, cellelinje med mutant

KRAS-

p53 Salg gener) [40]. MTT og BrdU-assays blev udført efter behandling med enten curcumin (0-20 uM) eller DMSO i 72 timer (figur 1B 1C, henholdsvis). Proliferation af CRC-cellelinier blev eksponentielt påvirket på en dosis-afhængig måde. Mens koncentrationer på ≥15 uM var forbundet med toksicitet, de omtrentlige halvdel maksimale hæmmende koncentrationer (IC

50) på 7,5 uM for HCT116 og 10 uM for HT29 og RKO blev bestemt baseret på celleproliferation indekser. Desuden blev kolonidannelse assays også udført over en periode på 12-14 dage (figur 1D), hvilket yderligere bekræftet den optimale dosis på 7,5 pM for HCT116 og 10 uM for HT29 og RKO cellelinier, for efterfølgende methylering af DNA eksperimenter.

(A) Kemisk struktur af curcumin: (1

E

, 6

E

) -1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) -1 , 6-heptadien-3,5-dion. (B) MTT og (C) BrdU-assays blev udført for at bestemme den bedste effektiv sub-toksisk koncentration af curcumin. CRC-celler blev behandlet med curcumin i forskellige koncentrationer i 72 timer (data repræsenterer middelværdien af ​​uafhængige forsøg udført tredobbelt). (D) De langsigtede antiproliferative virkninger blev evalueret i en koloni-dannelse assay. Cellerne blev behandlet med curcumin i 12 til 16 dage, indtil distinkte kolonier var synlige. Repræsentative billeder af fra et eksperiment illustrerer koloni dannelse resulterer i kontroller (DMSO behandlet) og curcumin-behandlede HCT116, RKO og HT29 kræftceller.

Curcumin inducerer demethylering af Specific CpG Loci i CRC Celler

For at analysere genom-dækkende methylering ændringer forbundet med curcumin behandling, vi brugte Infinium mikroarrays med over 27.000 CpG loci. Først, vi behandlede RKO (en CIMP positiv og meget methylerede CRC cellelinje) med 5-aza-CdR (en DNMT inhibitor) og TSA (en potent HDAC-hæmmer) som positive og negative kontroller, hhv. Som vist i figur 2A, en enkelt behandlingsdag med 2,5 pM 5-aza-CdR resulterede i udbredt demethylering af tusindvis af CpG loci i RKO-celler. I modsætning hertil TSA behandling havde en minimal effekt på demethylering af nogen som helst CpG-steder. De gennemsnitlige p-værdier i RKO celler faldt fra 0,39 til 0,26 efter behandling med 5-aza-CdR, hvorimod ingen ændringer i P-værdier blev set med TSA behandling, hvilket bekræfter specificiteten af ​​genom-dækkende demethylering af forskellige CpG sites efter behandling med en DNMT inhibitor i denne eksperimentelle tilstand.

(a) for den positive kontrol af hypometylering, vi behandlede RKO celler med 2,5 pM 5-aza-CdR. For den negative kontrol blev RKO-celler behandlet med 0,3 uM Trichostatin A (TSA). (B) Tre CRC cellelinjer fra forskellige epigenetiske fænotyper blev behandlet med effektive anti-proliferative koncentrationer af curcumin (HCT116 7,5 uM, RKO og HT29 10 uM) til 6 og 240 dage. Kort behandling var forbundet med få ændringer i DNA-methylering, mens langvarig behandling med curcumin resulterede i omfattende ændringer i CpG methylering. For at sammenligne den direkte virkning af behandlingen på methylering status Δβ

(βcontrol-βtreatment) værdier blev beregnet i overensstemmelse hermed for hver CpG locus. Den hvide linje repræsenterer stigende rækkefølge methylering af CpG loci i kontrol- /forældrenes cellelinjer. Prikker repræsenterer direkte sammenligning af matchende CpG loci ( 27.500) i behandlede celler

For at vurdere effekten af ​​curcumin på DNA methylering vi brugt to forskellige behandlingsmuligheder modeller:. Først, vi vedtog et almindeligt anvendt kortvarig behandling af CRC-celler med curcumin over en periode på 6 dage [24]. For det andet, brugte vi langsigtet curcumin behandling i 240 dage, en model, der sandsynligvis bedre efterligner brug af curcumin i et kemoforebyggende indstilling i mennesker, og én, der blev antaget at bedre repræsentere curcumin-induceret epigenetiske ændringer i kloner af celler, der har undergået og vedligeholdes CpG demethylering, givet curcumin nedre aktivitet sammenlignet med kommercielt tilgængelige DNMT hæmmere. For at undersøge effekten af ​​curcumin på CpG methylering (figur 2B), vi udførte parallelle sammenligninger mellem kort- og langsigtede curcumin behandlet CRC cellelinjer. Først vi sorteret alle 27.000 CpG loci i stigende rækkefølge methylering baseret på status for methylering i forældrenes cellelinjer (hvide prikker, der kumulativt vises som en linie i figur 2), mens tilsvarende DNA methylering ændringer efter både kort og lang sigt curcumin behandlinger er repræsenteret som røde og blå prikker hhv. De lodrette afstande på hver prik fra “line afbilder resultaterne fra kontrol- celler” repræsenterer niveauet af enten hyper- (over den hvide linie) eller hypo-methylering (under den hvide linie). Som vist i figur 2B, blev kortvarig curcumin behandling forbundet med relativt små methylering ændringer i alle 3 cellelinjer, med de tilsvarende gennemsnitlige β-værdiændringer som følger; 0,389 vs. 0,393 for HCT116, 0,388 vs. 0,396 for RKO og 0,294 vs. 0,291 for HT29. I modsætning hertil blev langvarig curcumin behandling forbundet med mere udtalte methylering ændringer i forhold til kontrolceller (figur 2B), selv om nettet β-værdi ændring ikke var signifikant forskellige (0,399 for HCT116, 0,398 for RKO og 0,275 for HT29).

curcumin inducerede ikke Global DNA-methylering Ændringer

for at vurdere effekten af ​​curcumin på globale DNA methylering ændringer, vi indsat to uafhængige tilgange. Først, vi analyserede status methylering af LINE-1 elementer, der tjener som surrogat markører for global methylering, ved hjælp af kvantitativ bisulfit pyrosekventering [41]. Vi fandt, at efter kort- og langtidsbehandling med curcumin LINE-1 methylering niveauer var sammenlignelig med ubehandlede kontroller, mens de i 5-aza-CdR behandlede cellelinjer udviste signifikante fald i LINE-1 methylering (figur 3A). For det andet, ved hjælp af Infinium methylering array-data, vi visualiseret globale CpG loci tæthed mønstre ved hjælp plottene tæthed. Som forventet blev 5-aza-CdR behandling forbundet med et klart skift af methylering tæthed linje mod umethyleret, mens ingen tydelige ændringer i den globale methylering tæthed mønstre blev fundet i CRC cellelinjer behandlet med curcumin – en observation som er i overensstemmelse med vores LINE-1 methylering resultater, der viser et fravær af globale methylering forandringer som følge af curcumin (figur 3B).

(A) HCT116, RKO og HT29 blev behandlet med 5-aza-CdR og curcumin og LINE-1 methylering status blev bestemt ved anvendelse af bisulfit pyrosekventering. (B) For at vurdere ændringer i de globale methyleringsmønstre blev tæthed plots beregnet for kontrol, 5-aza-CdR og curcumin-behandlede cellelinjer hjælp Infinium global methylering microarrays. Mens 5-aza-CdR var ansvarlig for et skift i CpG methylering mod hypometylering, methylering mønster af cellerne efter curcumin behandling forblev uændret. Forkortelser: 5-aza-deoxycytidin (5-aza-CdR), kortvarig curcumin behandling (STC), lang behandling med curcumin (LTC)

Validering af Curcumin-induceret DNA-methylering Ændringer i. CRC cellelinier

Som beskrevet ovenfor blev langvarig udsættelse for curcumin forbundet med mere signifikante methylering ændringer sammenlignet med kortsigtede behandlet CRC cellelinjer. Således til validering, indsnævret vi vores fokus på effekterne af længerevarende curcumin behandling ved hjælp af to forskellige strategier. Først, vi udførte en uafhængig genom-dækkende methylering microarray analyse (Infinium®) hjælp matchede uafhængig bisulfit modificerede DNA-prøver fra curcumin og kontrol cellelinjer. Som beskrevet ovenfor blev en Δβ-værdi på 0,1 (svarende til 10% methylering) anvendt som cut-off tærskel for differentielt methyleret loci. Figur 4A illustrerer antallet af forskelligt denatureret loci efter langvarig curcumin behandling, der blev delt mellem begge sæt methylering mikroarrays. Samlet fandt vi en høj grad af korrelation mellem de to eksperimenter (HCT116-LTC: R

2 = 0,9669, s 0,0001; RKO-LTC: R

2 = 0,9508, s 0,0001; HT29-LTC: R

2 = 0,9089; p 0,0001; RKO 5-aza-CdR: R

2 = 0,9569; p 0,0001; RKO-TSA: R

2 = 0,9484; p 0,0001). Følgelig vi bekræftet, at langvarig curcumin behandling var associeret med methylering af DNA ændringer på 1436 loci for HCT116, 814 for RKO og 3051 for HT29 (figur 4A). For det andet, vi med succes valideret methylering ændringer på flere tilfældigt udvalgte loci, herunder

KM-HN-1, PTPRO, WT1

GATA4,

bruge en qMSP assay i både curcumin og 5-aza-CdR behandlede tyktarmskræft cellelinjer (figur 4B). Med undtagelse af UCHL-1 (β-værdi på 0-9), alle validerede loci havde β-værdi mellem 0,3-0,8.

(A) til validering af ændringer i DNA-methylering, prøverne blev re -analyzed med en Infinium microarray hjælp uafhængigt bisulfit modificeret genomisk DNA. Figuren viser antallet af CpG loci, der viste CpG methylering ændringer med en Δβ-værdi på ≥0.1 i begge forsøg. 5-aza-CdR og TSA behandlede celler blev anvendt som positive og negative kontroller til validering. (B) Kvantitativ MSP (qMSP) blev udført for at validere methylering ændringer i HCT116. Relativ methylering blev beregnet ved normalisering af status for methylering af curcumin og 5-aza-CdR behandlede celler med kontroller. (C) Den Venn-diagram viser, at CpG methylering ændringer overlapper mellem HCT116, RKO og HT29 efter behandlingen med curcumin.

Curcumin-induceret Methylering Ændringer forekommer i en gen- og Cell Line-specifik måde

Vi næste spørgsmålstegn ved, om curcumin-induceret DNA methylering ændringer observeret i vores eksperimenter er gene- eller cellelinje-specifikke. Under hensyntagen til de genetiske og epigenetiske forskelle mellem forskellige CRC cellelinier analyseret i denne undersøgelse fandt vi i en-til-én sammenligninger, at alle 3 cellelinier delt i op til 30% CpG loci vis grad af methylering ændringer efter curcumin behandling. observerede vi imidlertid, at kun 68 CpG loci blev hypomethylated i alle 3 cellelinjer, hvilket tyder cellelinje-specifikke forskelle i DNA-methylering induceret af curcumin (figur 4C). Dernæst ønskede vi at se, om curcumin-induceret methylering ændringer er tilfældig, eller hvis der er et bestemt mønster for denne epigenetiske modifikation. For at besvare dette spørgsmål, vi arrangeret igen methylering resultater fra alle 27.000 CpG steder i stigende rækkefølge, og overlejret disse resultater med middelværdien Δβ-værdi ændring i curcumin behandlede celler (figur 5). Udover både hypo- og hyper-methylering af forskellige bindingssteder for CpG forbundet med curcumin behandling observerede vi et unikt mønster af curcumin-induceret methylering ændringer, tydeligt adskilte sig fra den 5-aza-CdR en i alle 3 cellelinier. Som vist på figur 5, mens 5-aza-CdR induceret hypometylering blev detekteret overhovedet CpG loci blev curcumin behandling forbundet overvejende med methylering ændringer på CpG websteder, der var delvist methyleret, en observation, der understøtter en genspecifik demethylering af dynamisk methylerede CpG loci, der er mål for curcumin-induceret epigenetisk modifikation.

Den validerede CpG loci af cellelinjer blev bestilt i stigende rækkefølge. Tallet repræsenterer størrelsen og placeringen af ​​curcumin-ramte CpG loci i forhold til at styre cellelinjer. Den grå kurve repræsenterer fordelingen af ​​CpG loci i stigende rækkefølge. De sorte linjer repræsenterer Δβ-værdier

(βcontrol-βtreatment) Tilpasning af reguleringen celler. Behandlingen med curcumin var forbundet med både hyper- og hypometylering ændringer, overvejende delvist methylerede CpG loci, mens 5-azaCdR behandling var ansvarlig for ikke-selektivt hypometylering.

Curcumin-induceret DNA-methylering Alterations Associate med tilsvarende ændringer i genekspression

for yderligere at forstå den biologiske betydning af DNA methylering forandringer som følge af curcumin, vi analyserede genekspression profiler i CRC-cellelinjer før og efter langvarig curcumin behandling. Til denne analyse, vi udførte korrelativ analyse mellem genom-dækkende methylering resultater og genekspression data. Heri valgte vi alle CpG loci, der havde en methylering ændring på mindst 10% (eller en Δβ-værdi ± 0,1) og et udtryk ændring på mindst 1,5 gange mellem kontrol og curcumin behandlede celler. Ved anvendelse af disse kriterier, vi identificeret 235 gener i HCT116, 108 gener i RKO og 543 i HT29-celler (figur 6). Opfindsomhed Pathway Analyser (IPA) viste, at gener med samtidig DNA methylering og genekspression ændringer ofte er involveret i flere vigtige cellulære regulatoriske processer, herunder lægemiddel- eller lipidmetabolisme, molekylær transport, cancer biologi, cellesignalering, inflammatorisk respons og cellecyklus. Detaljerede kategorier af disse gener i HCT116 celler er præsenteret i tabel 1. Derfor er vores data tyder på, at methylering forandringer som følge af curcumin har en direkte indvirkning på transskription af forskellige gener, der deltager i vigtige biologiske processer, der kan være medvirkende til at curcumin-medieret anticancer virkninger.

For at vurdere, om curcumin-medierede ændringer i DNA-methylering korreleret med genekspression variation, vi udførte genom-dækkende genekspression analyser.