PLoS ONE: CSTP1, en roman Protein Phosphatase, blokke Cell Cycle, Fremmer Cell Apoptose, og Undertrykker Tumor Vækst af blærekræft ved direkte dephosphorylere Akt ved Ser473 Site

Abstrakt

Akt /protein kinase B er en central komponent nedstrøms for phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway, hvis aktivitet regulerer balancen mellem celleoverlevelse og apoptose. Phosphorylering af Akt sker på to centrale steder, enten på Thr308 sted i aktivering sløjfe eller på Ser473 sted i den hydrofobe motiv. Den phosphorylerede form af Akt (Pakt) aktiveres til at fremme celle overlevelse. Mekanismerne i Pakt dephosphorylering og hvordan signaltransduktion af Akt pathway afsluttes er stadig ukendte. I denne undersøgelse, vi identificeret et nyt protein fosfatase CSTP1 (komplet s transaktiveres protein 1), der interagerer og dephosphorylerer Akt specifikt mod Ser473 websted

in vivo

in vitro

, blokerer cellecyklusprogression og fremmer celle apoptose. Virkningerne af CSTP1 på celleoverlevelse og cellecyklus blev ophævet ved depletion af phosphatasedomæne af CSTP1 eller ved ekspression af en konstitutivt aktiv form af Akt (S473D), hvilket antyder Ser473 site af Akt som et primært cellulær mål på CSTP1. Ekspressionsprofil-analyse viste, at CSTP1 ekspression selektivt nedreguleret i ikke-invasive blærekræft væv og overekspression af CSTP1 undertrykt størrelsen af ​​tumorer i nøgne mus. Kaplan-Meier kurver viste, at nedsat ekspression af CSTP1 impliceret væsentligt reduceret tilbagefald overlevelse hos patienter lidt fra ikke-invasive blære kræft

Henvisning:. Zhuo DX, Zhang XW, Jin B, Zhang Z, Xie BS, wu CL, et al. (2013) CSTP1, en roman Protein Phosphatase, blokke Cell Cycle, Fremmer Cell Apoptose, og Undertrykker Tumor Vækst af blærekræft ved direkte dephosphorylere Akt på Ser473 site. PLoS ONE 8 (6): e65679. doi: 10,1371 /journal.pone.0065679

Redaktør: Ferenc Gallyas, University of Pecs Medical School, Ungarn

Modtaget: 11. december 2012; Accepteret: 17. april, 2013; Udgivet: 17 juni 2013

Copyright: © 2013 Zhuo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation of China giver 81272827 og 30971627. de finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Blærekræft er den anden mest almindelige malignitet i urogenitale kanal, med 350.000 nydiagnosticerede tilfælde og over 145.000 dødsfald hvert år på verdensplan [1]. Fordi langsigtede overvågninger af patienterne er nødvendigt, sammen med eventuelle tumor tilbagefald og andre komplikationer, behandlinger af blære kræft normalt koste en masse penge. Ifølge de forskelle i kliniske udvikling, patologi og molekylær alteration profiler, er blære kræft klassificeres i to typer af carcinomer: den ikke-muskel invasive overfladiske, papillære carcinomer og muskel invasive carcinomer [2]. Den ikke-muskel invasive overfladiske, papillære karcinom er som regel lav livstruende, men med høje forekomster og høje gentagelser, mens muskel invasive karcinomer ofte forårsager fjernmetastaser og hurtige dødsfald [3].

Flere signalveje er impliceret i initiering og progression af blære kræft, herunder mutationer i PI3K /Akt og Ras /MAPK onkogen sti måde komponenter og ændringer i de tumorsuppressorer, såsom p53 og Rb. Der er stigende tegn indikerer, at ændringer i disse pathway komponenter ikke kun forbundet med initiering af blære kræft, men også stærkt korreleret med recidiv, progression og overlevelse. For eksempel er gevinst på funktion mutationer af Ras, FGFR3, PIK3CA ofte impliceret i den ikke-musklen invasive overfladiske, papillære carcinomer, mens tab af funktion ændringer af p53 og Rb-gener findes oftere i aggressive, muskel invasive karcinomer [4] -. [6]

phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway regulerer balancen mellem celleoverlevelse og apoptose, og denne balance ødelægges ofte i mange typer af humane cancere, herunder de humane urothelial blærekræft [2 ]. Akt er en central nedstrøms komponent i PI3K pathway, som kan aktiveres ved sekventiel phosphorylering på to lokaliteter konserveret i AGC-kinase familien [7]. For eksempel kan en opstrøms kinase PDK-1 phosphorylere Thr308 stedet i aktiveringssløjfen af ​​Akt1- [8], [9], som udløser autophosphorylering af Akt1- ved sin C-terminale Ser473 [10], og således fuldt aktiverer Akt1. Akt signalering kan afsluttes ved to mekanismer: fjernelse af den aktive lipid sekundær budbringer, der katalyseres af lipidet phosphatase PTEN (phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom ti) [11], og dephosphorylering af den aktiverede Akt. Akt kan også dephosphoryleres direkte af PP2A-type phosphataser de [12] eller andre proteinphosphataser såsom PHLPP1 (PH-domæne leucin-rige repeat proteinphosphatase 1) og PHLPP2 [13], [14].

Her , rapporterede vi en hidtil ukendt proteinphosphatase, betegnet det komplette s transaktiveres protein 1 (CSTP1) [15], hvis ekspression blev selektivt reduceret i ikke-muskel invasiv blærekræft. For at gøre en yderligere at forstå betydningen af ​​CSTP1 i blæren carcinogenese, i denne undersøgelse, vil vi gå dyb indsigt i jeg. virkningerne af CSTP1 på blærekræft cellecyklus, apoptose og tumordannelse in vivo og det understregede molekylære mekanismer; ii. de molekylære mekanismer, hvorigennem CSTP1 udøver sin biologiske funktion; iii. betydningen af ​​nedsat udtryk for CSTP1 på gentagelse og prognose af ikke-invasive blære kræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af etiske udvalg af Peking University First Hospital (Permit nummer: 2008 [96]), og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver emne. Alle eksperimenter dyr blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i Health Science Center i Peking University. Protokollen blev godkendt af den etiske komité af dyreforsøg i Peking University First Hospital (Permit Nummer: J201112).

Patienter

seksogfirs blære kræftpatienter, der blev nydiagnosticerede i instituttets af Urology, blev Peking Universitet indskrevet i denne undersøgelse. Blandt dem, 62 sager havde non-invasive blære kræft og gennemgik orgel-konservering efter transuretral resektion af blæretumorer (TURBT). Mediet alder (± SD) af de 62 patienter var 65,3 ± 11,5 år gamle (40 mænd og 22 kvinder).

Cell Culture

RT4, SV-HUC1, EJ, og T24 celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Hela og 293T-celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% FBS og 100 U /ml penicillin. Sf9 celler blev holdt i SF-900 II SF-medium indeholdende penicillin /streptomycin ved slutkoncentration (50 enheder /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin) ved 27 oC.

Real Time PCR

totalt RNA blev ekstraheret ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol. Den første streng cDNA blev syntetiseret under anvendelse af SuperScript TMIII første streng kits (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. CSTP1_RT og GAPDH_RT primere anvendt i denne undersøgelse er givet i tabel 1. Forskellen i ekspression af CSTP1 mRNA blev beregnet under anvendelse af 2-ACt beskrevet af Schmittgen [16].

Animal Experiment

Seks til 8 uger gamle nøgne hunmus med BALB /c baggrund blev indkøbt fra Peking University. På 5 × 106 i EJ celler overudtrykker CSTP1 eller CSTP1 ΔPP2Ac og kontrolceller blev injiceret subkutant i mus. Størrelsen af ​​tumorer blev målt en gang om ugen med en passer, og tumorvolumener blev beregnet efter formlen π /6 x længde x bredde2. Hvert punkt repræsenterer gennemsnittet ± S.D. for forskellige dyr målinger (n = 6).

Antistoffremstilling

Anti-CSTP1 polyklonalt antistof blev fremstillet ved immunisering af kaniner med 20-mer peptid, IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA, og antiserum blev oprenset ved affinitetskromatografi .

Plasmidkonstruktion

den kodende region af CSTP1 blev opnået fra normal blære endotel-cDNA under anvendelse af primere CSTP1_MYC_F og CSTP1_MYC_R, og klonet ind i pcDNA3.1 myc /hans C vektor for at generere rekombinante plasmid pcDNA3 0,1 myc /hans C -CSTP1. Alle primere anvendt i denne undersøgelse er givet i tabel 1. For at generere GFP fusionskonstruktion blev hele den kodende region af CSTP1 amplificeret under anvendelse af primere CSTP1_GFP_F og CSTP1_GFP_R, og subklonet ind i pEGFP-N1 ekspressionsvektor som pEGFP-CSTP1. Lentivirus ekspressionsplasmid pZsG-CSTP1 blev konstrueret ved indsættelse af PCR-produkt amplificeret ved CSTP1_ZsG_F og CSTP1_ZsG_R ind pZsG plasmid. pZsG-CSTP1 ΔPP2Ac blev opnået under anvendelse af primerne CSTP1ΔPP2Ac_F og CSTP1ΔPP2Ac_R og produkterne blev ligeret igen under anvendelse af T4 DNA-ligase. Den kodende region af Akt1- blev amplificeret med primerne Akt_Tag_F og Akt_Tag_R og klonet i pCMV Tag-2B plasmidet. Til konstruktion af Akt (S473D) phosphomimetic mutant, blev vildtype Akt1 først klonet ind pZsG plasmidet ved hjælp af PCR (primere Akt_ZsG_F og Akt_ZsG_R er angivet i tabel 1). Punktmutation i Akt1 (Ser473), der konverterer Ser til Asp blev genereret ved anvendelse af QuikChange steddirigeret mutagenese-kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ifølge producentens instruktioner med de følgende primere (Akt_Mut_F og Akt_Mut_R, tabel 1). For bakteriel ekspression af CSTP1 protein blev CSTP1 cDNA klonet ind pET-42a vektor med primere (CSTP1_pET_F og CSTP1_ pET_R, tabel 1).

RNA Interference

menneskelige CSTP1 siRNA målsekvenser (CSTP1_siRNA_target , tabel 1) er i forhold til det første nukleotid i startkodonen af ​​den humane CSTP1 kodende sekvens. En ikke-relaterede, var krypteret siRNA anvendt som den negative kontrol (CSTP1_siRNA_neg, tabel 1). Den siRNA blev syntetiseret af Shanghai Genechem Co., Ltd, Kina. CSTP1 knockdown blev udført ved transfektion af siRNA i MCF-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger.

Northern blot-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra tumor cellelinjer under anvendelse af TRIzol Regent (Invitrogen, USA) ifølge fabrikantens instruktioner. Tyve mikrogram totalt RNA prøver blev denatureret, størrelsesfraktioneret ved elektroforese i 1,2% agarose-formaldehyd-geler og overført til magna nylon overførselsmembran (Osmonics Inc i Minnetonka, MN, USA). Til påvisning af endogent CSTP1 mRNA blev ORF CSTP1 udskåret fra pcDNA3.1 myc /hans C-CSTP1 plasmid, mærket med [α-32P] dCTP under anvendelse af Prime-a-Gene Labeling System (Promega, Madison, WI, USA) . Intern kontrol af GAPDH blev opnået ved PCR-metoden med primere (GAPDH_NB_F og GAPDH_NB_R, tabel 1) og blev mærket som ovenfor. Hybridisering blev udført i ExpressHyb hybridiseringsopløsning (Clontech, Mountain View CA, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

In vitro Phosphatase Assay

De 293T-celler blev transficeret med pcDNA3.1 myc /hans C-CSTP1 plasmid ved anvendelse af calciumphosphat-transfektion. Efter 48 timer blev cellerne lyseret i phosphatase opbevaringspuffer. Fusionsproteinet CSTP1-His blev oprenset ved EZview Red HIS-Select HC Nickel Affinity Gel (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA). Proteiner blev anvendt til Phosphatase assay under anvendelse serin /threonin-phosphatase Assay System (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens instruktioner.

For at undersøge om oprenset CSTP1 kunne dephosphorylere Akt, CSTP1 blev udtrykt som et GST-fusionsprotein i BL21 (DE3) bakterier og oprenset med glutathion-Sepharose. Dephosphoryleringen reaktioner blev udført som beskrevet af Tianyan Gao [13].

Baculovirus Vector Construction, Virus Packaging

For at få Hans mærkede Akt1, den fulde længde kodende region for Akt1 blev først klonet ind pcDNA3.1Myc /His C plasmidet ved PCR med primere Akt_His_F og Akt_His_R (tabel 1), derefter, Akt1-His-kodende sekvens blev fremstillet ved PCR-fremgangsmåden med primerne Akt_Bac_F og Akt_Bac_R (tabel 1) med pcDNA3.1Myc /His C-Akt1 plasmid som template. Produktet blev subklonet i BamHI og Xhol-stederne i pFastBacTM baculovirus shuttle-vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Det rekombinante pFastBacTM donor plasmid transformeret til DH10BacTM for gennemførelse i bacmidet. Hvide kolonier indeholder de rekombinante bacmid blev udvalgt til isolering af rekombinant bacmid DNA. For at generere viruspartikel, blev Sf9-celler i 6-brønds plader transficeret med den rekombinante CSTP1 bacmid DNA i CellfectinTM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Fem dage senere blev mediet opsamlet, og supernatanten blev reserveret som P1 viral lager.

flowcytometrianalyse

I apoptose assay celler blev behandlet med 10

-8 mol /L gemcitabin eller 2 ug /ml cisplatin hhv. 48 timer senere blev celler opnået og dobbelt farvet med Annexin V-FITC og PI (Keygen, Nanjing, Kina). Celle apoptose blev analyseret ved flowcytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

I cellecyklusanalyse blev celler dyrket i standard RPMI1640 med 10% FBS til ca. 40% confluencey og dyrket med 2 mM thymidin i 19 timer. Celler blev udtømt for thymidin og inkuberes i 9 timer indtil 2 mM thymidin blev tilsat for anden gang, og cellerne blev dyrket i yderligere 16 timer. Efter fjernelse af thymidin igen, thymidin-synkroniserede celler blev dyrket i komplet medium og indsamlet på forskellige tidspunkter for cellecyklusanalyse. Generelt blev cellerne vasket to gange med PBS-opløsning og fikseret med afkølet 70% alkohol ved -20 ° C i 24 timer. Celle sediment blev opsamlet ved centrifugering, vasket to gange med PBS-opløsning, inkuberet med 20 pi RNase A (20 mg /ml) i 30 min ved 37 ° C, og farvet med 25 pg /ml PI i 30 minutter ved stuetemperatur. Cellecyklusfordeling blev derefter evalueret under anvendelse af flowcytometri (BD Biosciences, USA).

Immunhistokemi Analyse

Fire-mikrometer snit fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede væv blev monteret på poly-L-lysin overtrukne dias og derefter afparaffinerede i xylen og rehydrerede gennem alkohol til destilleret vand. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 3% hydrogenperoxid i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter trykkogning objektglassene i 10 mM EDTA (pH 8,0) i 3 minutter, blev snit inkuberet natten over ved 4 ° C med kanin-anti-CSTP1 antistof (1:200). Primære antistoffer blev påvist under anvendelse af en to-trins EnVision System (Dako, Danmark). Positive og negative immunhistokemiske kontroller blev rutinemæssigt anvendt. For negative kontroller, blev det primære antistof erstattet af ikke-immun kaninserum at bekræfte sin specificitet.

Evaluering af CSTP1 farvning blev hovedsageligt efter scoring kriterier tidligere beskrevne [17]. Den immunhistokemiske kvantitative henvisning skala, der går fra 0 til 3 afhang af intensiteten af ​​CSTP1 proteinekspression. Den relative mængde af tumorceller, der farves positivt for CSTP1 (0-100%), sammenholdt med rating af farvningen intensitet, resulterede i en farvning score spænder fra 0 til 100.

Statistisk analyse

Gentagelse overlevelse blev vurderet ved Kaplan-Meier-kurver. Forskelle mellem grupperne blev vurderet ved log rank test. Sygdomsfri overlevelse blev defineret som perioden mellem kirurgi og påvisningen af ​​oprindelige lokalt recidiv. Alle analyser blev udført af statistisk software SPSS 12.0 og P-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

CSTP1 mRNA ekspression i Normal og Tumor væv og cellelinier

CSTP1

genet blev først identificeret af Bai GQ i 2005 [15], som blev transactived ved fuldstændig S protein af hepatitis B virus, og vi skulle det kan være forbundet med menneskelige kræftformer. Vi først undersøgte

CSTP1

mRNA udtryk niveau i flere former for menneskelige kræftformer, herunder lever, bugspytkirtel, mave, tyktarm, blære og nyre kræft. Til vores overraskelse,

CSTP1

mRNA blev reduceret betydeligt (40% -90%) i 80% (8 af 10) af blære cancervæv sammenlignet med parrede hosliggende ikke-cancervæv, hvorimod ekspressionen af ​​

CSTP1

mRNA i lever, bugspytkirtel, mave, tyktarm og nyrecancer væv ændrede sig ikke væsentligt (fig. 1A). Vi derefter bestemmes ekspressionsniveauet af CSTP1 mRNA ved Northern blot i blæren cancercellelinier og SV-HUC1, en ikke-transformerede urothelial celler. Resultater af Northern blot viste en moderat udtryk niveau af

CSTP1

mRNA i SV-HUC1 celler, men i RT4, EJ og T24-blære cancerceller,

CSTP1

mRNA kunne næppe påvises (fig. 1B). Endvidere to sæt microarray datasæt opnået fra Oncomine afslørede også, at CSTP1 mRNA-ekspression faldt i blære kræft, med p-værdier på 0,005 (op) og 2.62E-4 (ned) henholdsvis (fig. 1C).

(A) Real-time PCR-analyse af

CSTP1

mRNA-niveauer i seks typer af humane cancer væv.

CSTP1

mRNA var selektivt nedreguleret i blærekræft væv sammenlignet med tilstødende ikke-kræft væv. (B) Northern blot analyse af CSTP1 mRNA i blære cancercellelinier.

CSTP1

mRNA blev udtrykt på et moderat niveau i SV-HUC1 celler, men kunne næsten ikke påvises i RT4, EJ og T24 blærekræft cellelinjer, blev GAPDH anvendt som intern kontrol. (C) CSTP1 mRNA-ekspression analyse på Oncomine. Nedsat CSTP1 mRNA-ekspression i blære kræft i to sæt af datasæt, med p-værdier på 0,005 (op) og 2.62E-4 (ned) hhv (1, blære slimhinde,. 2, infiltrerende blære urothelial karcinom, 3, overfladisk blærekræft ).

Karakterisering af CSTP1

Bioinformatik analyse viste, at CSTP1 mRNA er 6156 bp i længde, der koder for et protein på 314 aminosyrer (fig. 2A). Den forudsagte molekylmasse af dette protein er 36 kDa med det teoretiske isoelektriske punkt 5,99. Det tilsvarende gen blev kortlagt til kromosom 16p13.12, bestående af fire exoner og tre introner. Sekvensanalyse af den forudsagte proteinsekvens viste, at CSTP1 protein indeholder en PP2Ac (proteinphosphatase 2A katalytisk enhed) domæne fra aminosyre 50 til 250 (fig. 2B). Fylogenetisk analyse viste, at CSTP1 genet er konserveret blandt chimpanse, hund, ko, mus, rotte, kylling, zebrafisk, og P. falciparum (fig. 2C).

(A) nukleotidsekvensen af ​​

CSTP1

åbne læseramme og den udledte aminosyresekvens. Nucleotidsekvensen er vist i 5 ’til 3′ retningen. Den forudsagte aminosyresekvens er vist nedenfor nucleotidsekvensen. De aminosyrerester svarende til phosphorase 2A katalytiske enhed domæne (PP2Ac) er i røde bogstaver. (B) Bioinformatik analyse viste, at CSTP1 protein indeholdt et konserveret PP2Ac domæne mellem 50 til 250 aminosyrer. (C) fylogenetisk analyse viste, at CSTP1 protein er konserveret i chimpanse, hund, ko, mus, rotte, kylling, zebrafisk, og P. falciparum. (D) Western blot-analyse af CSTP1 ekspression i HeLa-celler. HeLa-celler blev transficeret med pCDNA3.1 Myc /His C-CSTP1 plasmid, 48 timer senere, blev niveauet af CSTP1-Myc-fusionsproteinet testes ved anti-Myc-antistof. Actin blev anvendt som intern kontrol. (E) CSTP1 vises en PP2B-lignende protein fosfatase aktivitet

in vitro

. 293T-celler blev transficeret med pcDNA3.1Myc /His C-CSTP1, 48 timer senere blev CSTP1-His fusionsprotein oprenset for phosphatase assay. Frigivelsen af ​​Pi blev bestemt i nærvær af 1 mM EGTA, 50 mM MgCl

2, 5 mM NiCl

2 og 250 ug /ml calmodulin. 200 nM trifluorperazin eller 0,5 pmol af okadainsyre blev også tilføjet at ophæve fosfatase aktivitet PP2B eller PP2A.

Næste, vi bekræftet den forudsagte molekylvægt af CSTP1 protein. Den pcDNA3.1Myc /Hans C-CSTP1 plasmider blev transficeret ind i HeLa-celler og CSTP1-Myc-fusionsproteinet blev bestemt ved Western blot med anti-Myc-antistof. Som vist i fig. 2D, det rekombinante plasmid udtrykte et protein med den forventede molekylvægt på 36 kDa.

Endelig har vi bestemt, hvis CSTP1 protein viste en serin /threonin-phosphatase aktivitet in vitro. 293T-celler blev transficeret med pcDNA3.1myc /hans C-CSTP1 plasmider og CSTP1-His fusionsprotein blev oprenset for phosphatase assay. Den enzymatiske aktivitet blev bestemt ved måling af frigivelsen af ​​Pi fra den kommercielle syntetiske peptidsubstrat indeholdende en phosphothreonin rest [RRA (pT) VA]. Som vist i fig. 2E, CSTP1 protein katalyseret Pi frigivet fra RRA (PT) VA-peptider endvidere PP2B specifik inhibitor, trifluorperazin næsten ophævede sin fosfataseaktivitet, mens PP2A specifik inhibitor okadainsyre ikke påvirkede CSTP1 aktivitet.

Subcellulær Lokalisering af CSTP1

for at få indsigt i den biologiske funktion af CSTP1 protein, vi først analyseret sin subcellulære lokalisering. GFP-mærkede CSTP1 ekspressionsplasmider blev transficeret ind i HeLa-celler, og fluorescensen blev visualiseret under fluorescensmikroskop. Celler transficeret med tom vektor pEGFP viste diffus fluorescens hele subcellulære afsnit af cellerne, mens CSTP1-GFP hovedsagelig lokaliseret til cytoplasmaet (fig. 3), hvilket antyder, at CSTP1 kan udøve den funktion gennem lokalisering til cellecytoplasmaet.

Hela-celler blev transficeret med pEGFPN1 og pEGFPN1-CSTP1 plasmidet henholdsvis 48 timer senere blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd og visualiseret ved fluorescens konfokal mikroskopi. 4, 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid farvning blev anvendt til at angive cellekernen. Resultaterne var repræsentative for tre uafhængige forsøg.

CSTP1 Over-udtryk Undertrykker blærekræft Cell Proliferation og Colony Formation, men ikke Invasion

I betragtning af den observation, at CSTP1 mRNA blev nedsat i blærekræft væv, vi formodes at CSTP1 kan fungere som en tumorsuppressor i blære kræftformer. For at undersøge den rolle, CSTP1 i cellefunktion, vi først analyseret effekten af ​​CSTP1 overekspression på celleproliferation. CSTP1 blev stabilt overudtrykt i EJ blære cancerceller via lentiviral infektion og celleproliferation blev vurderet ved MTT-metoden. Overekspression af CSTP1 inhiberede proliferationen af ​​EJ-celler med 50% efter en 5-dages kultur (fig. 4A), mens, udtømning af PP2Ac domæne forringet vækst-hæmning evne CSTP1 på EJ celler med 80% (fig. 4A) . I overensstemmelse med resultaterne af MTT-assayet, overekspression af CSTP1 nedsatte kolonidannelse kapacitet EJ celler, og udtømningen af ​​PP2Ac domæne reddede kolonidannelse evne EJ celler (fig. 4B). Lignende resultater blev opnået i en anden blærecancer-cellelinie T24 (data ikke vist).

(A) EJ celler blev transduceret med lentivirus overudtrykker CSTP1 (Lv-CSTP1), den PP2Ac domian udgår CSTP1 (Lv-CSTP1 ΔPP2Ac ), eller Lenti-vektor kontrol (Lv-ctr). Celleproliferation blev detekteret ved MTT-assayet. Data ved hvert tidspunkt repræsenterer middelværdien ± SD af 8 prøver. Resultaterne var repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) De transducerede EJ celler blev dyrket i 14 dage, og kolonier blev farvet ved anvendelse krystalviolet og talt inden for en × 40 objektivlinse. Resultaterne var repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) The xenograft tumorvækst i nøgne mus blev bemærkelsesværdigt undertrykt efter CSTP1 overekspression. Data ved hvert tidspunkt repræsenterer middelværdien ± SD, n = 6. (D) Chamber assays blev udført med transducerede EJ celler. Resultaterne viste, at CSTP1 har nogen virkning på celleinvasion. De viste data var gennemsnitlige antal invaderende celler (× 100 field) ± SD fra tre uafhængige forsøg. **, P. 0,01

For at undersøge den rolle, CSTP1 in vivo, vi etablerede humane blære xenotransplantattumorer i nøgne mus ved injektion af kontrol EJ celler eller EJ celler stabilt udtrykker enten vildtype CSTP1 eller CSTP1 ΔPP2Ac. Vækst af de implanterede tumorer blev målt i mus (n = 6 for hver gruppe) over en periode på 8 uger. Resultater viste, at i athymiske mus, der modtog de EJ celler, der overudtrykker CSTP1 blev tumorvækst signifikant undertrykt (-50%), men i athymiske mus, der modtog EJ celler, der overudtrykker CSTP1 ΔPP2Ac, tumorvækst næsten ikke ændring i forhold til kontrolgruppen (fig. 4C). Men CSTP1 overekspression havde ingen effekt på EJ celle invasion, som bestemt ved transwell assays (Fig. 4D).

CSTP1 Indflydelse på Cell Cycle og Apoptose

For at undersøge effekten af ​​CSTP1 på cellecyklus blev lentivirus transducerede EJ celler synkroniseret ved G0 /G1-fasen ved to runder af thymidin behandling og cellecyklus blev analyseret ved FACS ved 0 timer, 2 timer, 4 timer, og 8 timer efter frigivelse fra G0 /G1-fasen ved tilsætning af komplet medium. Som vist i fig. 5A, overekspression af CSTP1 Significantlly forsinket progression af cellecyklus. Sammenlignet med kontrolcellerne, celler, der overudtrykker CSTP1 udviste en lavere procentdel af celler i S-fase på 2 timer og 4 timer efter frigivelse fra G0 /G1-fasen. Endvidere blev en lavere procentdel af G2 /M-fase-celler ved 8 h efter frigivet fra cellecyklus blokering også observeret i CSTP1-overudtrykker celler, mens celler, der overudtrykker CSTP1 ΔPP2Ac ikke viste forsinket cellecyklusprogression. For at bekræfte effekten af ​​endogen CSTP1 på cellecyklus blev CSTP1 protein slået ned af siRNA transfektion i SV-HUC1 celler, som viste en moderat CSTP1 udtryk (fig. 1B). CSTP1 protein var effektivt nedreguleres ved specifik siRNA transfektion (fig. 5B), og den reducerede ekspression af CSTP1 fremmet celleproliferation ved at hæve procentdelen af ​​celler i S-fase (fig. 5C).

(A) EJ celler overekspression CSTP1 (Lv-CSTP1), CSTP1 ΔPP2Ac (Lv-CSTP1 ΔPP2Ac) og kontrol celler blev behandlet med to runder af 2 mM thymidin. Cellecyklus blev analyseret ved FACS efter frigivelse fra G0 /G1-fasen ved angivet tidspunkt. Resultaterne var repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) Immunoblotting af CSTP1 i ekstrakter af SV-HUC1cells 48 timer efter transfektion med en kontrol siRNA (Mock) eller en siRNA for CSTP1 (CSTP1 siRNA). (C) Cell cyklus analyse af SV-HUC1 celler efter transfektion med kontrol siRNA eller siRNA for CSTP1. *, P 0,05. Resultaterne var repræsentative for tre uafhængige forsøg.

For at undersøge, hvilken rolle CSTP1 på celle apoptose, EJ celler, der overudtrykker CSTP1 eller CSTP1Δ PP2Ac og kontrol celler blev dyrket i komplet medium med eller uden gemcitabin og cisplatin, to almindeligt anvendte kemoterapi narkotika i blærekræft behandling. FACS resultater vist, at overekspression af CSTP1 alene kun let induceret EJ celler apoptose, men når cellerne blev behandlet med kemoterapi narkotika, en øget dødelighed blev observeret i CSTP1-overudtrykker celler og depletion af PP2Ac domæne svækkede denne dødsfremmende evne CSTP1 dramatisk (fig. 6).

EJ celler, der stabilt overudtrykker CSTP1 eller CSTP1 ΔPP2Ac og kontrolceller blev dyrket i komplet medium med eller uden gemcitabin (10

-8 mol /liter) og cisplatin ( 2 ug /ml), 48 timer senere blev cellerne dobbelt farvet med annexin V-FITC og PI, blev celleapoptose analyseret ved FACS. Resultaterne var repræsentative for tre uafhængige forsøg. **, P. 0,01

CSTP1 Interagerer og dephosphorylerer Pakt på Ser473 site

At udforske de understregede mekanismer der er ansvarlige for den forhøjede apoptose og retarderede cellecyklus af blære cancerceller medieret af CSTP1, søger vi at finde signalveje nedstrøms for CSTP1 overekspression. Signalveje, der normalt er involveret i cancer biologi blev cellecykluskontrol eller celleproliferation undersøgt i CSTP1-overudtrykkende EJ celler ved analyse af luciferaseaktivitet under anvendelse Cignal Reporter Assay Kit. Resultaterne viste, at FOXO faktor havde en mere robust transkriptionsaktivitet i CSTP1-overekspression celler (Fig. 7A). Stigningen i FOXO aktivitet blev yderligere demonstreret ved reduktion i fosforylering tilstand af FOXO3A på Thr32 stedet efter CSTP1 overekspression (fig. 7B). Da Akt kinase er den primære negativ regulator opstrøms for FOXO faktor, vi formodes at Akt kinase aktivitet kunne faldt i CSTP1-overudtrykkende celler. For at bekræfte denne hypotese, den phosphorylerede Akt ved Thr308 eller Ser473 site, som repræsenterer aktiveringstilstanden af ​​Akt, blev påvist. Western blot viste resultater at overekspression af CSTP1 faldt niveauet af phosphoryleret Akt ved Ser473 site, men niveauet af phosphoryleret Akt på Thr308 var uændret (fig. 7B). Da CSTP1 nedreguleres i blærekræft væv, så vi spurgte, om tab af CSTP1 udtryk i urothelial celler kan resultere i aktiveringen af ​​Akt-kinase og inaktivering af FOXO faktor. I overensstemmelse med CSTP1 overekspression assay, knockdown af CSTP1 i SV-HUC1 øget fosforylering niveau af Akt på Ser473 stedet og FOXO3A på Thr32 stedet (fig. 7C). For yderligere at undersøge effekten af ​​CSTP1 overekspression på aktiviteten af ​​Akt, vi undersøgte også andre fire kendte proteiner, afhængig af Akt for fosforylering, GSK3α, GSK3p, p70S6K, og TSC2. Til vores overraskelse har CSTP1 overekspression ikke påvirke phosphorylering status GSK3α, GSK3p, p70S6K, og TSC2 (fig. 7B).

(A) EJ celler, der overudtrykker CSTP1 og kontrolceller blev transficeret med en række cignal rapporterede plasmid, 48 timer senere, luciferaseaktivitet blev målt under anvendelse af luciferase-assay-system med et luminometer. luciferase-baserede reporter signal er normaliseret til ekspressionen af ​​et cotransficerede Renilla luciferase kontrol plasmid. (B) Western blot-analyse af phosphoryleringsniveauerne af FOXO3A, Akt, GSK3α, GSK3p, p70S6K og TSC2 i EJ celler, der overudtrykker CSTP1. Phosphoryleret FOXO3A, Akt, GSK3α, GSK3p, p70S6k og resten skyldes TSC2 proteiner blev detekteret som interne kontroller. (C) Western blot-analyse af phosphoryleringsniveauerne af FOXO3A og Akt efter banker ned af CSTP1 i SV-HUC1 celler. (D) CSTP1 interagerer med Akt i 293T-celler. 293T-celler blev cotransficeret med pcDNA3.1-CSTP1 og Flag-Akt udtrykkende plasmider, blev interaktion mellem CSTP1 og Akt analyseret ved co-ip eksperiment med anti-Flag (op panel) eller anti-CSTP1 antistof (lav panel). (E) Dephosphorylering af Akt af renset CSTP1

in vitro

. Pure His-Akt blev inkuberet med GST-mærket CSTP1 eller GST-mærket CSTP1ΔPP2Ac i phosphatasebuffer. For en negativ kontrol blev CSTP1 protein udeladt fra reaktionsblandingen (CTR). (F) EJ celler blev overudtrykt CSTP1 (Lv-CSTP1) eller CSTP1 (Lv-CSTP1) plus fosfor-mimetiske S473D konstruktionen af ​​Akt (ca-Akt) ved lentivirus blev cellecyklus analyseret ved FACS. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig.