PLoS ONE: kemoforebyggende Effekt af PSP Gennem Målretning af prostatakræft Stem Cell-Like Befolkning

Abstrakt

De seneste oplysninger tydede på, at prostatakræft stamceller /stamceller (CSC) har ansvaret for kræft initiering samt sygdomsprogression. Desværre, konventionelle behandlinger er kun effektive i at målrette de mere differentierede kræftceller og skåne CSCS. Her rapporterer vi, at PSP, en aktiv komponent udvundet fra svampen Tyrkiet hale (også kendt som

Coriolus versicolor

), er effektiv til at målrette prostata CSCS. Vi fandt, at behandling af prostatacancer-cellelinie PC-3 med PSP førte til nedregulering af CSC markører (CD133 og CD44) i en tid og dosisafhængig måde. I mellemtiden, PSP behandling ikke kun undertrykte evne PC-3 celler til at danne prostaspheres under ikke-klæbende dyrkningsbetingelser, men hæmmede også deres tumorigenicitet

in vivo

, yderligere beviser, at PSP kan undertrykke prostata CSC egenskaber. For at undersøge, om anti-CSC virkning PSP kan føre til prostatakræft kemoforebyggelse, blev transgene mus (TgMAP), som spontant udvikler prostatatumorer oralt fodret med PSP i 20 uger. Henviser 100% af de mus, der fodres med vand kun udviklet prostatatumorer ved afslutningen af ​​eksperimentet kunne ingen tumorer findes i nogen af ​​musene fodret med PSP, hvilket antyder, at PSP behandling helt kan inhibere prostata tumordannelse. Vores resultater viste ikke kun spændende anti-CSC effekt af PSP, men afslørede også, for første gang, den overraskende kemoforebyggende ejendom af oral PSP forbrug mod prostatakræft

Henvisning:. Luk SU, Lee TK-W Liu J, Lee DT-W, Chiu YT, Ma S, et al. (2011) kemoforebyggende Effekt af PSP Gennem Målretning af prostatakræft Stem Cell-Like Befolkning. PLoS ONE 6 (5): e19804. doi: 10,1371 /journal.pone.0019804

Redaktør: Kelvin Yuen Kwong Chan, Tsan Yuk Hospital, Sygehus Authority, Kina

Modtaget: December 23, 2010; Accepteret: 16. april, 2011; Udgivet: 16 maj, 2011

Copyright: © 2011 Luk et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Vicekansler Forskning Fellowship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige mandlige malignitet i de vestlige lande, og udgør en stor sygdomsbyrde i verden. Når diagnosticeret på et fremskredent stadium, hvor kirurgi er ikke længere muligt, det eneste frontlinjen behandling til rådighed, er hormon ablation terapi. Desværre har de fleste af PCA patienter vinder tilbagefald og udvikle hormon refraktær PCa (HRPC), en fatal og slutstadiet betragtes som uhelbredelige [1].

Chemoprevention er en ideel strategi for kæmper prostatacancer, og en række kemoterapeutiske midler eller naturlige kosttilskud øjeblikket testes for deres potentiale til at inhibere prostatakræft udvikling. For eksempel finasterid, en 5-alfa-reduktase specifik inhibitor, har vist sig at reducere forekomsten af ​​prostatacancer med 25% i et klinisk forsøg [2]. Tilsvarende dutasterid, en analog af finasterid, blev også rapporteret signifikant at hæmme prostatacancer udvikling [3]. Trods af de lovende resultat, bivirkningerne forbundet med finasterid behandling forbliver den største bekymring for at den kan anvendes bredt til prostata kemoforebyggelse. Derfor bioaktive fødevarer forbindelser såsom epigallocatechin-3-gallate eller resveratrol [4], [5], [6] udgør et attraktivt alternativ for prostatakræft chemoforebyggelse, hovedsageligt på grund af deres relativt lave toksicitet. Desværre er de fleste af de tidligere undersøgelser har frembragt overbevisende resultater med hensyn til deres kemoforebyggende potentiale.

Nyt identifikation af prostatakræft stamceller (CSCS) [7] har givet en ny indsigt i prostata carcinogenese. Evnen af ​​disse cancer stamceller til forny sig selv og differentiere til bulk-cancerceller foreslog, at de kan være oprindelsen af ​​prostatacancer [7]. Desuden meget modstandsdygtigt karakter af disse CSCS til forskellige kemoterapier foreslog, at CSCS også kan bidrage til fiasko og sygdomsbehandling tilbagefald [8]. Interessant nok har en række bioaktive fødevarer forbindelser nylig vist sig at have anti-CSC virkning. For eksempel har vi for nylig rapporteret, at gamma-tocotrienol udvundet af palmeolie inhiberer prostasphere dannelse evne og tumorgenicitet af prostatacancerceller [9], hvilket antyder, at gamma-tocotrienol er effektive til at undertrykke prostata CSC egenskaber. Desuden blev en triterpen ekstraheret fra frugter også fundet at inhibere selvfornyelse evne leveren CSCS og sensibilisere levertumor til cisplatin behandling [10]. Disse resultater understreger mulighederne af bioaktive fødevarer forbindelser som CSC målrettet middel enten til forebyggelse eller til behandling af prostatacancer.

Her har vi vist, at polysaccharopeptide (PSP) udvundet fra Tyrkiet hale (kendt som

Coriolus versicolor

eller Yun-zhi) henvender prostata CSCS in vitro og undertrykker tumordannelse in vivo. Behandling af prostatakræft cellelinje PC-3 med PSP førte til nedregulering af CSC markører (CD133 og CD44) i en tid og dosisafhængig måde. I mellemtiden, dannelse af prostasphere, en større egenskab af prostata CSCS, blev fuldstændig undertrykt i PC-3-celler i nærvær af PSP. Endvidere PSP forbehandling undertrykte signifikant tumor initiering af PC-3-celler hos immunkompromitterede mus, hvilket antyder, at PSP undertrykker tumorigeniciteten af ​​PC-3-celler. Mere vigtigt var oral fodring af transgene mus (TgMAP), som spontant udvikler prostatatumor med PSP fundet fuldstændigt at inhibere prostata tumordannelse. Vores resultater understøtter, at PSP kan være en potent kemoforebyggende middel mod prostatakræft, eventuelt ved målretning af prostata CSC befolkning.

Resultater

Effekter af PSP på CSC markør udtryk

PSP har tidligere vist sig at have anti-cancer egenskaber [11], [12], [13], selv om de underliggende mekanismer er stadig uklart. For at teste om den anti-cancer virkning PSP er gennem målretning af CSC egenskaber, vi først undersøgt, om PSP behandling påvirker ekspressionen af ​​prostata CSC markører i PC-3-cellelinjen, som er blevet rapporteret at indeholde CSCS. PC-3-celler blev behandlet med 250 og 500 ug /ml PSP til enten 48 eller 72 timer, og ekspressionen af ​​CSC markører, såsom CD133 eller CD44 blev undersøgt ved Western blotting. Som vist i figur 1B, protein ekspression af CD133 var signifikant nedreguleret efter PSP behandling i et tidsrum og dosisafhængig måde. Nedregulering af CD44 blev også observeret efter PSP behandling, selv om virkningen var mindre indlysende. undersøgelse af mRNA-niveauet af både CD133 og CD44 afslørede imidlertid, at nedregulering af begge proteiner efter PSP ikke skyldes hæmning af gentranskription (data ikke vist). Desto mindre er disse data antyder, at PSP kan være effektiv til at målrette de formodede prostata CSCS.

A) Western blotting af prostata CSC markørerne CD44 og CD133 i PC-3-celler efter PSP behandling. Bemærk, at PSP væsentligt nedregulerer både stamceller markører i en dosis- og tidsafhængig måde. B) levedygtighed PC-3-celler efter behandling med 5, 25, 125, 250 og 500 ug /ml PSP i 48 eller 72 timer blev målt med MTT-assay. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± S.D. C) Flowcytometrianalyse af PC-3-celler efter behandling med 250 ug /ml PSP i 72 timer. Bemærk, at ingen signifikant forskel i cellecyklusfordeling blev observeret. D) Western blotting resultater for apoptotiske markører (venstre panel) og stamcelle vedligeholdelse proteiner (højre panel) i PC-3 celler efter PSP behandling. Bemærk, at der ikke er konstateret ændringer i Bax og Bcl-2 eller spaltning af PARP.

For at teste, om nedregulering af CSC markør udtryk af PSP skyldes et fald i cellelevedygtighed, PC 3-celler behandlet med PSP ved forskellige doseringer (0, 5, 25, 125, 250 og 500 ug /ml) i 24, 48 eller 72 timer blev undersøgt ved MTT-assayet. Interessant havde 48 timer af PSP behandling ikke har nogen observerbare virkninger på cellelevedygtighed, selv om de samme behandlinger viste sig at signifikant undertrykke ekspressionen af ​​CSC markører (figur 1B 1C). I mellemtiden, PSP behandling også inducerede ikke cellecyklusstop eller apoptose, hvilket fremgår af manglen på sub-G1 population i resultatet af flowcytometrianalyse (figur 1D). Dette blev yderligere bekræftet ved undersøgelse af apoptose-associerede proteiner (dvs. Bax, Bcl-2 og spaltet PARP) (figur 1E). Imidlertid blev Akt /β-catenin pathway, som er ansvarlig for berigelse af CSCS i brystcancer, drastisk inhiberet af PSP behandling. Som vist i figur 1 D, blev aktivering af AKT ved phosphorylering ved Ser 473 inhiberet af PSP ved begge doser, som blev ledsaget af fuldstændig forsvinden af ​​β-catenin-ekspression (figur 1E).

PSP inhiberer prostasphere dannelse af prostata cancerceller under ikke-adhærente dyrkningsbetingelser

evnen til at danne prostaspheres i ikke-klæbende kultur er et af kendetegnene ved prostata CSCS [14], [15], [16]. For at bekræfte at PSP behandling kan hæmme prostata CSC egenskaber blev prostasphere dannelse af PC-3 undersøgt i nærvær eller fravær af PSP. Som vist i figur 2A, dyrkning af både PC-3 og DU145 celler i 14 dage under ikke-klæbende betingelser resulterer dannelsen af ​​prostaspheres, hvilket yderligere bekræfter tilstedeværelsen af ​​en stilk-lignende befolkning i begge cellelinier. Slående, tilsætning af PSP i mediet hæmmede drastisk prostasphere dannelse i begge cellelinier. Navnlig blev ingen prostaspheres fundet i enten cellelinie i nærvær af 500 mg /ml PSP, hvilket antyder, at PSP behandling signifikant elimineret prostata CSCS. For yderligere bevist, at PSP er effektiv til at inhibere prostasphere formation, primære prostaspheres med beriget CSC befolkning blev dissocieret og re-podet i ikke-klæbende dyrkningsbetingelser at tillade dannelsen af ​​sekundære prostaspheres. I overensstemmelse med resultatet fra den primære sfæroid dannelse assay PSP behandlinger signifikant undertrykke antallet af prostaspheres findes i hver cellelinje, selv om højere dosis af PSP (500 mg /ml) var ikke i stand til fuldstændigt at fjerne alle de sekundære prostaspheres. Ikke desto mindre tyder disse resultater på, at PSP er effektive til at undertrykke de CSC egenskaber af prostatacancerceller.

A) Sfæroide formation assay blev udført med PC-3 og DU 145-celler. To hundrede celler podedes på polyHEMA pre-coatede plader og behandlet med enten 500 ug /ml PSP eller vehikel i 14 dage. Antallet af prostaspheres dannede blev talt, og resultatet blev præsenteret som middelværdi ± s.d. Bemærk, at γ-T3 behandling effektivt undertrykker klumpformet dannelse evne PC-3-celler. Billede af prostaspheres blev fanget under mikroskop. Bemærk, at der ikke prostaspheres kan findes i celler behandlet med 500 ug /ml PSP. (B) PSP hæmmede dannelsen af ​​sekundære prostaspheres. Primære prostaspheres blev dissocieret og re-podet i polyHEMA pre-coated plade. PSP blev tilsat 24 timer efter udpladning. Bemærk at prostasphere dannelse blev inhiberet med mere end 70% og 90% i nærvær af 250 ug /ml og 500 ug /ml PSP hhv. *

P

0,001, **

P

. 0,0001,

t

test

PSP reducerer tumorgenicitet af prostata kræftceller

in vivo

Da CSC er ansvarlig for kræft indvielse, er det muligt, at PSP behandling kan hæmme tumordannelse evne PC-3 celler in vivo. For at teste denne hypotese, vi først behandlet PC-3-celler, der stabilt udtrykker luciferase protein (PC-3-Luc) med PSP i 72 timer før orthotopisk injiceret dem i SCID-mus. Som undersøgt ved bioluminescens billeddannelse, alle de mus, som blev injiceret med vehikel-forbehandlede PC-3-luc celler dannede tumorer to uger efter implantation (figur 3A). Interessant nok tre ud af de otte mus, som blev injiceret med PSP forbehandlede PC-3-Luc celler ikke har udviklet tumorer selv ved uge fire efter implantation (figur 3A B). Manglen på tumorer i PSP-forbehandlede gruppe blev yderligere bekræftet ved undersøgelse af muse prostata kirtler i slutningen af ​​forsøget (figur 3C). Tilsammen vores resultater antydede, at PSP var effektive til at reducere tumorigent potentiale af prostata kræftceller, hvilket er en væsentlig egenskab ved CSCS.

A) Bioluminescent billeder af SCID-mus orthotopisk injiceret med PC-3-luc celler i to uger. SCID-mus i den øvre række blev injiceret med vehikelbehandlede PC-3-luc celler, hvorimod mus i den nederste række blev injiceret med PSP-behandlede PC-3-luc celler. B) Tabel opsummerer procentdele af mus udvikler påviselige tumorer i uge 2. Ca. 40% af mus i PSP forbehandlede gruppe ikke danner påviselige tumorer, mens 100% tumordannelse blev fundet i kontrolgruppen (p = 0,07). C) Valgt

ex vivo Salg billeder af prostata fra begge grupper. Bemærk, at i PSP-behandlede mus med negativ luciferase signal, blev ingen synlig tumor findes i prostata væv.

Oral administration af PSP undlader at hæmme prostata intraepitelialneoplasi (PIN) udvikling i TgMAP mus

effekten af ​​PSP på prostata CSCS understøtter den hypotese, at den kan have en kemoforebyggende virkning mod prostatakræft. For at teste denne hypotese har vi ansat en transgen musemodel, som spontant udvikler adenokarcinom i prostata (TgMAP) [17], [18]. De TgMAP mus udvikler PIN mellem 16-20 ugers alderen og fremskridt til prostata adenocarcinom efter uge 24 (figur 4A). Fordi PIN betragtes som den præ-maligne læsioner og det vigtigste risikofaktor for prostatakræft [19], vi først testet, hvis PSP administration påvirkede PIN udvikling i TgMAP mus. Fem TgMAP mus (14 uger gamle, mindst 2 uger før PIN udvikling) blev fodret med 200 mg /kg af PSP i 4 uger. Fire mus på samme alder blev fodret med vand kun for den samme periode. Alle mus blev aflivet efter 20 uger gamle og prostatavæv blev opsamlet og snittet til histologi. Som vist i figur 4B Eosin farvning af prostatavæv fra TgMAP mus. Bemærk, at både kontrol- og PSP-behandlede TgMAP mus udviklede prostata intraepitelialneoplasi (PIN), som angivet med pilene.

Forlængelse PSP forbrug hæmmer prostatakræft udvikling i TgMAP mus

Den manglende hæmme PIN dannelsen af ​​PSP behandling kan på grund af utilstrækkelig dosis eller behandling længde. Vi har derfor testet, om en højere dosis og længere PSP forbrug kan påvirke prostata tumor dannelse ved hjælp af den samme model. Fem TgMAP mus (8 uger gamle) blev fodret med 300 mg /kg af PSP i alt 20 uger (figur 5A). Fire mus på samme alder blev igen fodret med vand kun for den samme periode. Alle mus blev aflivet efter 28 uger gammel, da prostatatumorer blev dannet, med prostatavæv opsamlet og snittet til histologi. Som vist i figur 5B blev tumorer findes i forskellige dele af prostatakirtlen fra alle de mus, som blev fodret med kun vand. Overraskende undersøgelse af alle prostata sektion afslørede, at ingen af ​​de mus, der blev fodret med PSP bare eventuelle prostatatumorer (figur 5C), hvilket antyder, at PSP behandling fuldstændig hæmmet prostata tumordannelse i TgMAP mus. I mellemtiden, mens tre af PSP-fodrede mus viste sig at have PIN, blev de to andre mus sig at have helt normale prostata (figur 5D). Endvidere i overensstemmelse med den lave toksicitet af PSP, vises lang sigt forbrug, har ingen bivirkninger på musene, som vurderet ved ændringerne i kropsvægt og fysiske tegn (data ikke vist) (figur 5E). Disse resultater tyder på, at oral indtagelse af PSP kan være en sikker og effektiv kemoforebyggende middel mod prostatakræft.

A) Oversigt over tidsplanen for PSP behandling. Otte uger gamle TgMAP mus blev behandlet med 300 mg /kg af PSP ved oral sondeernæring fodring i 20 uger og aflivet i en alder af 28 uger. B C) Repræsentative billeder af Hematoxylin Eosin farvning af prostatavæv fra køretøjet og PSP-behandlede TgMAP mus. Bemærk, at tumorer blev fundet i alle de mus, som blev behandlet med kun køretøjet, men var fraværende i alle de PSP-behandlede mus. D) tabel opsummerer resultaterne af histologi undersøgelse af prostata væv fra køretøjet og PSP-behandlede TgMAP mus. * P 0,05 sammenlignet med kontrol behandling af Fishers eksakte test. E) Gennemsnitlig kropsvægt af musene under PSP behandling.

Diskussion

PSP er tidligere blevet påvist at inducere apoptose og hæmme væksten af ​​en bred vifte af kræftceller, som omfatter bryst [20], [21], [22], lever [23] og prostatakræft [24], selv om mekanismerne bag sine anti-cancer effekter forbliver dårligt forstået. Her demonstrerede vi for første gang, at PSP har anti-CSC effekter, som det fremgår af nedregulering af CSC markører og undertrykkelsen af ​​prostasphere og tumor dannelse.

Prostata CSCS blev først identificeret af Collins et al. i 2005 ved hjælp af CD44 + /alpha2beta1hi /CD133 + som celleoverflademarkørerne [25]. Ved hjælp af lignende fremgangsmåder, er CSCS også blevet identificeret i prostatakræft-cellelinier såsom LNCaP [26], DU145 [26], [27] og PC-3 [28], [29]. Disse prostata CSCS ikke kun udtrykke høje CD133 og CD44, men er også yderst tumorigene sammenlignet med den ikke-CSC population. Den omstændighed, at PSP væsentligt kan undertrykke ekspressionen af ​​både CD133 og CD44, samt tumorigeniciteten af ​​PC-3-celler, viser klart effektiviteten af ​​PSP i målretning prostata CSCS. Som det fremgår af Hsieh et al [24], PSP er effektiv på induktion af apoptose og hæmning af celleproliferation i LNCaP-celler. Men dens virkning var langt mindre fremtrædende i androgenuafhængige prostatacancer-cellelinier såsom PC-3. Dette er faktisk i overensstemmelse med vores fund, som viste, at PSP kan undertrykke CSC egenskaber uden at fremkalde nogen påviselig cellecyklusstop eller apoptose. Ikke desto mindre er konstateringen af, at både Akt phosphorylering og β-catenin udtryk blev også nedreguleret af PSP (figur 1E) antyder, at PSP kan virke ved at inaktivere PTEN /Akt /β-catenin vej til at hæmme CSC fornyelse. Dette nyligt identificerede stamcelle vedligeholdelse vej viste sig at spille en central rolle i reguleringen af ​​prostata og mammae stamcelle befolkning [16], [30]. Aberrant aktivering af Akt /β-catenin pathway gennem knockdown af PTEN fandtes at berige mamma stamcellepopulation, der fører til induktion af hyperplastiske læsioner i mus [30]. Tilsvarende knockdown af PTEN i prostatacancerceller viste sig også at forbedre prostasphere dannelse evne og tumorgenicitet af cellerne [16]. Derfor kan tabet af “stemness” af prostata CSCS efter PSP behandling skyldes nedregulering af PTEN /AKT /β-catenin pathway.

En af de vigtigste egenskaber af stamceller er deres evne til dannelse sfærer i ikke-adhærente, serumfrie betingelser [31]. Faktisk har sfæroid dannelse analyser for nylig blevet anvendt til at identificere og at berige formodede CSCS [16], [32], [33], [34]. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, både prostata cancercellelinier PC-3 og DU145 kunne danne prostaspheres i ikke-klæbende kultur [16], hvilket tyder tilstedeværelsen af ​​CSCS inden for disse cellelinier. Disse primære prostaspheres, som er resistente over for kemoterapeutiske lægemidler [9], er meget følsomme over PSP behandling (figur 2A). Desuden blev de sekundære prostaspheres signifikant inhiberet på en dosis-afhængig måde (figur 2B), støtter, at PSP er effektiv til at eliminere prostata CSCS

in vitro

.

Prostata CSCS menes at være oprindelse prostata tumor, som har evnen til at forny sig selv og differentiere til hovedparten tumor [35]. Den omstændighed, at PSP forbehandling signifikant kan inhibere tumorigenicitet af PC-3-celler (figur 3) fremhæver ikke blot anti-CSC virkning PSP, men også antyder, at PSP kan have kemoforebyggende virkninger mod prostatacancer. Vi testede denne hypotese ved anvendelse af en nyligt udviklet transgen musemodel for prostatacancer (TgMAP) [17], [18]. Den trinvise udvikling af prostata tumor (fra lav PIN kvalitet til grov tumor) i TgMAP musen stærkt efterligner patogenesen af ​​menneskelige prostatakræft, selvom det måske ikke helt afspejler den komplekse karakter af prostata carcinogenese. Ikke desto mindre, det tillod os at udvikle en optimal PSP behandling dosering og tidsramme. Ud fra følgende betragtninger fire uger PSP oral indtagelse på 200 mg /kg undladt at fremlægge eventuelle forskelle i PIN udvikling, blev fuldstændig hæmning af prostata tumor dannelse opnået efter 20 ugers oral PSP fodring ved 300 mg /kg. I mellemtiden, undertrykkelsen af ​​PIN dannelse ved PSP endvidere foreslået, at kemoforebyggende effekt af PSP kan skyldes undertrykkelse af tumor initiering på et tidligt tidspunkt. Den ekstremt lave toksicitet og den meget potent anti-CSC effekt af PSP garanterer yderligere evaluering af dets kemoforebyggende effekt i humane kliniske forsøg.

Sammenfattende har vi vist, for første gang, at PSP behandling ikke kun hæmmer CSC egenskaber, men også effektivt undertrykker prostata tumor dannelse. Vores resultater antyder, at PSP kan være et effektivt middel til prostatacancer chemoprevention.

Materialer og metoder Salg

Polysaccharopeptide (PSP)

PSP ekstraheret fra Yun-Zhi blev venligst tilvejebragt af Wonder Herb Health Products, Ltd. PSP pulver blev opløst i autoklaveret Milli Q-vand i en koncentration på 30 mg /ml ved blanding i en rotator ved 4 ° C natten over. PSP opløsning blev opbevaret ved 4 ° C. Til celledyrkning undersøgelse blev PSP lager steriliseret med 0,2 um filtrering før anvendelse. I dyreforsøg blev PSP tilføres direkte til mus.

Cellelinier og dyrkningsbetingelser

Prostatacancer cellelinier PC-3 og DU 145 (ATCC, Rockville, MD) blev opretholdt i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 1% (w /v) penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 5% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA). Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2 miljø. Luciferase-udtrykkende PC-3-cellelinjen blev dannet i vores tidligere undersøgelse.

TgMAP prostata tumormodel

TgMAP C57 /BL6-mus ved uge 8 og 14 blev administreret med PSP ved 200 mg /kg i 4 uger (n = 5) eller 300 mg /kg i 20 uger (n = 5) henholdsvis ved oral gavage feeding (5 dage om ugen). Kontrolgruppe blev fodret med vand kun for den samme periode. Mus blev aflivet (i en alder af 20 uger for 200 mg /kg behandlingsgruppen og 28 uger for 300 mg /kg behandlingsgruppe) og prostatavæv blev opsamlet, fikseret i 10% formalin og indlejret i paraffin. Hele prostata blev skåret i 4 um sektioner og én ud af hver fem på hinanden følgende sektioner blev farvet med H 0,05. Animal etik blev godkendt af Udvalget om brug af levende dyr til Undervisning og Forskning (CULATR) med godkendelse nr. af 1694-1608. Alle procedurer for håndtering af dyr blev udført i henhold til retningslinjerne fra Udvalget om brugen af ​​levende dyr i undervisning og forskning (CULATR), The University of Hong Kong.

Sfæroide dannelse assay

klumpformet dannelse assay blev ændret fra et tidligere rapporteret protokol [36]. Kort fortalt blev PCA-celler (200 celler per linie) podes på 12-brønds polyHEMA (Sigma) overtrukne plader. Celler blev dyrket i DMEM /F12-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 14 dage suppleret med 4 ug /ml insulin (Sigma), B27 (Invitrogen), 20 ng /ml EGF (Sigma), og 20 ng /ml basisk FGF (Invitrogen) med PSP på enten 250 ug /ml og 500 ug /ml. For seriel passage af primære sfærer blev de primære sfærer behandlet med PSP for ovennævnte doser i 72 timer og efterfølgende opsamlet, dissocieret med trypsin og resuspenderet i DMEM /F12-medium med ovennævnte kosttilskud. Hvert forsøg blev gentaget tre gange, og hvert datapunkt repræsenterer middelværdien og standard afledning. Statistisk forskel blev bestemt ved Students

t

-test og blev betragtet som signifikant, hvis p. 0,05

Cell levedygtighed assay

Cell levedygtighed på PSP behandling blev målt ved en 3 – (4,5-dimethyl thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay som tidligere beskrevet [37]. Kort beskrevet blev celler podet på plader med 96 brønde og behandlet med forskellige koncentrationer af PSP i den angivne tid. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev MTT (Sigma, St. Louis, MO) tilsat til hver brønd, og brøndene blev inkuberet i 4 timer ved stuetemperatur. DMSO blev derefter tilsat til hver brønd for at opløse formazan-krystallerne. Pladen blev inkuberet i yderligere 5 minutter ved stuetemperatur, og den optiske densitet (OD) blev målt ved en bølgelængde på 570 nm på en LabSystem Multiscan mikropladelæser (Merck Eurolab, Dietikon, Schweiz). Alle individuelle brønde blev analyseret i tre eksemplarer. Procentdelen af ​​cellelevedygtighed blev præsenteret som OD forholdet mellem de behandlede og ubehandlede celler i de angivne koncentrationer.

Western Blotting

Detaljerede eksperimentelle procedurer er beskrevet tidligere [37]. Kort fortalt blev cellerne lyseret med RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% deoxycholsyre, 1% NP-40, 0,1% SDS) med proteaseinhibitorer (1 mg /ml aprotinin, 1 mg /ml leupeptin, 1 mM PMSF), og proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af en D

C protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Proteiner blev løst i SDS-polyacrylamidgel ved elektroforese og derefter overført på Hybond-P PVDF-membran (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Membranerne blev blokeret med 10% fedtfri tørmælk i TBS-T eller 3% fedtfri tørmælk i TBS og inkuberet med primære antistoffer ved stuetemperatur mod Akt (Ser473), Bcl-2, PARP (cellesignalering, Technology Inc, Beverly, MA), CD133 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), CD44, β-catenin og β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med TBS-T, blev membranen inkuberet med enten anti-muse- eller anti-kanin IgG sekundære antistoffer, og signalerne blev visualiseret ved anvendelse af ECL plus western blotting (Amersham, Piscataway, NJ).

cellecyklusanalyse

Celler blev fikseret med 1 ml iskold 70% ethanol ved 4 ° C. Efter fiksering blev cellepellets opsamlet ved centrifugering, resuspenderet med 500 pi PBS og derefter inkuberet ved 4 ° C om dagen før udførelse flowcytometri. Den næste dag blev cellerne farvet med propidiumiodid (50 ug /ml) og RNase (1 ug /ml) i 30 min. Celle cyklus analyse blev udført på et flowcytometer EPICS profil analysator og analyseret ved anvendelse af ModFit LT2.0 software (Coulter, Miami, FL).

ortotopisk implantation af PC-3-Luc celler

Den ortotopisk model blev etableret med procedurer tidligere [38], der er beskrevet. Kort fortalt blev otte uger gamle CB-17 SCID-mus bedøvet og anbragt under et dissektionsmikroskop. Et snit på midterlinjen af ​​maven blev foretaget, udsætter den dorsale prostata ved bunden af ​​blæren. Ens mængder af levedygtige PC3-luc celler (2,5 x 10

4) med eller uden forudgående PSP behandling blev injiceret i den dorsale prostata af musene. Organerne blev udskiftet, og abdomen blev lukket. Tumorudvikling blev overvåget ved måling af den bioluminescerende signal hver anden uge i seks uger efter tumorimplantation. Mus blev aflivet ved afslutningen af ​​eksperimentet og prostatavæv blev indsamlet til fysisk undersøgelse. Statistisk forskel blev bestemt ved en to-halet

t

-test og blev betragtet som signifikant, hvis p 0,05. Alle procedurer kirurgiske og håndtering af dyr blev udført i henhold til retningslinjerne fra Udvalget om brugen af ​​levende dyr i undervisning og forskning (CULATR), The University of Hong Kong.