PLoS ONE: Silencing af Claudin-11 er forbundet med øget invasivitet af mavekræft Cells

Abstrakt

Baggrund

Claudins er membranproteiner, der spiller kritiske roller i tight junction (TJ) dannelse og funktion. Medlemmer af claudin genfamilien er blevet demonstreret at være afvigende reguleret, og deltage i patogenesen af ​​forskellige humane cancerformer. I den foreliggende undersøgelse, rapporterer vi, at claudin-11 (

CLDN11

) er bragt til tavshed i gastrisk cancer

via

hypermethylering af sin promotor-regionen.

Metode /vigtigste resultater

Niveauer af

CLDN11

methylering og mRNA-ekspression blev målt i primære gastrisk kræft væv, noncancerous gastrisk slimhinder og cellelinier af gastrisk oprindelse hjælp kvantitativ methylering-specifik PCR (qMSP) og kvantitativ revers transkriptase-PCR (QRT-PCR), hhv. Analyser af parrede gastrisk kræft og tilstødende normale gastriske væv afsløret hypermethyleringsassocierede af

CLDN11

promoter region i gastrisk kræft, og dette hypermethyleringsassocierede var signifikant korreleret med nedregulering af

CLDN11

udtryk

vs.

normale væv.

CLDN11

promotor-regionen blev også hypermethyleret i alle gastrisk cancer cellelinjer testet i forhold til udødeliggjort normale gastriske epitelceller. Desuden

CLDN11

mRNA-ekspression blev omvendt korreleret med dets methylering niveau. Behandling af

CLDN11

-nonexpressing mavekræft celler med 5-aza-2′-deoxycytidin restaureret

CLDN11

udtryk. Desuden siRNA-medieret knockdown af

CLDN11

udtryk i normale gastriske epitelceller øget deres motilitet og invasionsevne.

Konklusioner /Betydning

Disse data tyder på, at hypermethylering af

CLDN11

, hvilket fører til nedreguleret ekspression, bidrager til gastrisk carcinogenese ved at øge cellulær motilitet og invasionsevne. En yderligere forståelse af de mekanismer, der ligger til grund rolle claudin proteiner i gastrisk carcinogenese vil sandsynligvis hjælpe med identifikationen af ​​romanen tilgange til diagnose og behandling af mavekræft

Henvisning:. Agarwal R, Mori Y, Cheng Y, Jin Z, Olaru AV, Hamilton JP et al. (2009) Silencing af Claudin-11 er forbundet med øget invasivitet af gastrisk kræftceller. PLoS ONE 4 (11): e8002. doi: 10,1371 /journal.pone.0008002

Redaktør: Fatah Kashanchi, George Washington University School of Medicine, USA

Modtaget: August 3, 2009; Accepteret: 23. oktober 2009; Udgivet: November 24, 2009

Copyright: © 2009 Agarwal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af USA National Institutes of Health giver CA085069, CA138677 og CA146799 til SJ Meltzer. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er fortsat den næstmest-almindelige årsag til kræftdødsfald globalt. Det er en af ​​de mest dødelige maligniteter og en førende årsag til kræftdødsfald i udviklingslandene, med samlet 5-års overlevelse på under 20% [1], [2].

Studier af GC’ers og deres præneoplastiske forløber læsioner har identificeret flere genetiske og epigenetiske ændringer, herunder mikrosatellit ustabilitet, punktmutationer, og tab af heterozygositet (LOH) påvirker tumorsuppressorgener (GTS) [3] – [6]. Ikke desto mindre er den molekylære patogenese GC stadig ufuldstændigt forstået.

Epigenetisk ændringer er ekstremt vigtige i cancer udvikling og progression [7]. Transkriptionel inaktivering af tumorsuppressorgener via afvigende promotor hypermethylering af CpG øer, der forårsager permanent gendæmpning, er en stor epigenetisk mekanisme GTS inaktivering.

Tidligere har undersøgelser blevet offentliggjort på promotor hypermethylering i GC’ers og deres præmaligne forstadier [ ,,,0],8] – [10]. p16INK4a og p15INK4B var blandt de første gener at vise hypermethylering i GC’ers [11]. Vores gruppe og andre efterfølgende opdagede hypermethylering af hMLH1 DNA mismatch repair gen i GC’ers udstiller hyppig mikrosatellit instabilitet (MSI-H) [12] – [14]. Vi viste også, at hypermethylering af E-cadherin (CDH1) genet forekommer hyppigt i GC’ers [15].

En pilot microarray-baserede genom-dækkende søgning foretaget af vores gruppe, udføres for at opdage nye epigenetisk lyddæmpede gener i gastrisk carcinogenese, identificeret claudin-11 (

CLDN11

), en tight junction (TJ) protein, som et potentielt mål for epigenetisk inaktivering i gastrisk kræft (upublicerede data).

claudin-11 tilhører til familien af ​​claudin proteiner, som indeholder mere end 23 medlemmer. Medlemmer af claudin familien udtrykkes på en yderst vævsspecifik måde i forskellige normale og neoplastiske væv [16]. Claudins er transmembrane proteiner, der spiller afgørende roller i TJ dannelse og funktion. TJs er intercellulære junctions kritiske i den paracellulære transport af opløste stoffer, samt at opretholde celle polaritet. Tumorceller almindeligvis udviser strukturelle og funktionelle mangler i deres TJs [17].

I de senere år har en række undersøgelser har vist afvigende ekspression af claudin proteiner i forskellige cancertyper [18], [16]. Flere af disse undersøgelser fundet dysregulering af claudin proteinekspression

via

promotor hypermethylering. Hypermethylering-induceret dæmpning af claudin-7-ekspression er tidligere rapporteret i bryst [19] og kolorektal [20] karcinomer. Claudin-6 er også epigenetisk tavshed i brystkræft [21], mens claudins -3 og -4 er epigenetisk reguleret i æggestokkene cancerceller [22], [23].

Den nuværende undersøgelse identificerer og rapporter, til vores viden for første gang, at den

CLDN11

promoter region er hypermethyleret i GC væv og cellelinier. Endvidere medens

CLDN11

mRNA blev udtrykt i alle primære noncancerous gastriske mucosale væv, såvel som i en udødeliggjort normal gastrisk epitelcellelinje blev det stumme i alle GC væv og cellelinier undersøgt. Interessant, siRNA-medieret nedregulering af

CLDN11

i

CLDN11

udtrykkende gastriske celler blev også forbundet med kræft-relaterede fænotypiske ændringer, specielt øget celle motilitet og invasionsevne.

Materialer og metoder

cellelinjer og Klinisk vævsprøver

immortaliserede humane normale gastriske epitelceller (HFE145) blev indhentet fra Dr. Duane T. Smoot (Howard University) og GC cellelinjer AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, og SNU-1 blev opnået fra ATCC. Alle cellelinjer blev dyrket og opretholdt i RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotisk-antimycotisk opløsning (Invitrogen).

Forbundne primære gastriske normale og tumorvæv blev opsamlet ved Johns Hopkins Hospital ( JHH). Prøver blev snap-frosne umiddelbart efter resektion.

Etik Statement

Johns Hopkins University (JHU) Institutional Review Board (IRB) godkendelsen er opnået for alle de tilfælde, der indgår i undersøgelsen. Sager blev opnået fra JHU kirurgisk patologi under JHU IRB-godkendt fritagelse 02-07-19-05e i henhold til regel 45 CFR 46,101 (b), der giver afkald kravene til at opnå patientens samtykke.

Rensning og Udarbejdelse af Genomisk DNA og Total RNA

Genomisk DNA blev ekstraheret fra lynfrosset vævsprøver eller cellelinjer under anvendelse af en DNeasy Blood Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol. Totalt RNA blev ekstraheret med Trizol-reagens (Invitrogen). Ekstraherede DNA og RNA blev kvantificeret under anvendelse af et NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop, Wilmington, DE).

Kvantitativ methyleringsspecifik PCR (qMSP) for Claudin-11 Salg

genomiske DNA’er opnået fra 36 patientprøver indeholdende 18 GC og 18 matchede noncancerous mave mucosale (NS) væv, såvel som fra forskellige gastriske cellelinjer, blev underkastet qMSP. qMSP blev udført som tidligere beskrevet, med mindre modifikationer [24]. Kort fortalt blev bisulfitbehandling af genomiske DNA’er udføres under anvendelse af et EpiTect bisulfitbehandling Kit (QIAGEN, Valencia, CA). En MSP amplikon og TaqMan-probe til påvisning fuldstændigt methyleret DNA blev designet til at indbefatte flere bindingssteder for CpG i 5′-UTR-regionen i

CLDN11

gen.

CLDN11

-specifikke primere og probe sekvenser anvendt var: forward primer 5’CGCGATTGGTCGGCGCGTTTC 3 ‘; reverse primer 5’GACGAAAACAACAACGCTACT 3 ‘; TaqMan sonde 5’TCGGAGTCGCGGGGTTTAAAGAG 3 ‘. CpGenome Universal Methyleret DNA (Chemicon International, Temecula, CA) tjente som en positiv kontrol, og serielle fortyndinger af det blev brugt til at plotte en standardkurve. qMSP med TaqMan sonde blev udført på en iQ5 termisk cycler (BioRad, Hercules, CA) ved hjælp af iQ Supermix (

ibid.

). Halvtreds cykler PCR-amplifikation startende med 50 ng af bisulfit-behandlet genomiske DNA blev udført tredobbelt, ifølge fabrikantens protokol. Duplex PCR med β-actin (ACTB) primer og probesekvenser, der ikke indeholder CpG’er blev udført for normalisering. Grunder og probesekvenser var som tidligere [24] offentliggjort. Normaliseret methylering værdi (NMV) blev defineret som følger: NMV = (

CLDN11-S-service /

CLDN11-FM

) /(

ACTB-S-service /

ACTB -FM

) * 100, hvor

CLDN11-S

CLDN11-FM

repræsentere

CLDN11

methylering niveauer i prøven og fuldt methylerede DNA, hvorimod

ACTB-S

ACTB-FM

svarer til

β-actin

i prøven og fuldt methylerede DNA, hhv. Whole-genomet amplificeret DNA (WGA) blev anvendt som et ikke-methyleret negativ kontrol.

Kvantitativ Reverse Transcription-PCR-analyse

CLDN11

RT-PCR-amplikon blev designet til at overlappe et intron-exon grænsen for at udelukke genomisk DNA (

g

DNA) amplifikation. Primersekvenser blev som offentliggjort tidligere [18]. Et-trins QRT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [24], under anvendelse af en Quantitect SYBRA RT-PCR-kittet (QIAGEN, Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol.

CLDN11

udtryk blev normaliseret til

β

actin-udtryk. Totalt RNA fra HFE145 celler blev anvendt til standardkurven. (

CLDN11-S-service /

CLDN11-C

) /(

ACTB-S-service /

ACTB-C

), hvor

CLDN11- S

og

CLDN11-C

repræsenterer

CLDN11

mRNA ekspressionsniveauerne i prøven og kontrol mRNA henholdsvis mens

ACTB-S

og

ACTB -C

svarer til

Ø-actin

ekspressionsniveauerne i prøven og kontrol mRNA henholdsvis.

5-Aza-2′-deoxycytidin (5-Aza-dC) Behandling

AGS er en GC cellelinje manifesterer hypermethylering af

CLDN11

promotor sammen med fraværende

CLDN11

mRNA-ekspression. 5-aza-2′-deoxycitidine (5-aza-dC) behandling af celler blev udført som tidligere [24] beskrevne. Kort fortalt blev GC cellelinien AGS (ATCC katalognummer CRL 1739) podet med en tæthed på 2 x 10

5 celler /ml i en T-75 kolbe. Fireogtyve timer senere blev cellerne behandlet med 1 pM 5-aza-dC i 72 timer. Medier indeholdende 5-aza-dC blev erstattet med frisk fremstillede medier hver 24 timer. Celler blev derefter høstet for total RNA-ekstraktion. Total RNA fra AGS celler før og efter 5-aza-dC behandling blev udsat for kvantitativ real-time RT-PCR-analyse.

Små interfererende RNA Knockdown Eksperimenter

CLDN11

-specifikke siRNA oligoer blev indkøbt fra Ambion, Inc. (Austin, TX). Den HFE145 cellelinie, som er

CLDN11

positiv, blev valgt til at undersøge effekten af ​​claudin-11 knockdown på migrations- og invasion egenskaber gastriske celler. Eksperimenter blev udført som beskrevet tidligere (Agarwal

et al.

, 2005). Celler dyrket i 6-brønds plader blev transficeret med siRNA-duplexer anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen), ved at følge producentens instruktioner. Mock-transfektioner og ikke-specifikke siRNA-duplexer blev anvendt som negative kontroller. Cellerne blev behandlet i 48 til 72 timer for at opnå maksimal knockdown, hvorefter de enten blev høstet for Western blot analyse eller anvendes til migration og invasion assays.

Western blot analyse af Claudin-11 i Gastric cellelinier

Sammenflydende cellekulturer blev vasket med HBSS (Invitrogen) og hele cellelysater blev fremstillet ved anvendelse af lysepuffer: 62,5 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8), 10% glycerol og 2% SDS. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af en bicinchoninsyre (BCA) assay kit (Pierce, Rockford, IL). Tyve mikrogram af totale proteiner blev separeret ved 10% til 20% SDS-PAGE på Tris-glycin-geler (Invitrogen) og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore Corp., Bedford, MA). Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk, vasket i TBST buffer og probet med et anti-claudin-11-antistof (Zymed, San Francisco, CA). Blots blev derefter vasket og inkuberet i peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (anti-kanin IgG: 1:10,000; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Til detektion blev kemiluminescens foretages ud fra en forøget kemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech).

Cell Invasion og Migration Assay

invasivitet af siRNA-transficerede celler blev bestemt ved anvendelse Matrigelcoatede invasion kammer skær (24-well-format med 8 um porer, BD Biosciences) under anvendelse af en modificeret Boyden kammer assay [25]. Celler blev dyrket til ca. 80% konfluens og serum-udsultet natten over. På dagen for assayet blev celler trypsiniseret og levedygtige celletællinger taget. Ca. 50.000 celler blev udpladet på toppen af ​​hver af hvert filter i serum-frit medium. Et tilsvarende volumen af ​​det samme medium indeholdende 20% FCS blev anbragt i det nedre kammer (

dvs..

, Brønden under filteret) at fungere som en kemoattraktant. Assayplader blev inkuberet ved 37 ° C i op til 48 timer. Celler, der ikke migrerer eller invadere gennem porerne i Transwell skær blev manuelt fjernes med en vatpind. Celler til stede i bunden af ​​membranen blev fikseret i kold methanol i 10 minutter og derefter farvet med 0,01% krystalviolet i 20% ethanol. Efter 10 minutters inkubation blev filtrene vasket grundigt i vand og suspenderet i 200 pi af 5% eddikesyre og 5% methanol. Kolorimetriske aflæsninger blev taget på OD

595. Forsøg blev gentaget mindst tre gange, med tre eksemplarer hvert eksperiment. For at vurdere cellemigration blev assays udført i det væsentlige som ovenfor, bortset fra at cellerne blev udpladet på toppen af ​​ikke-coatede (Matrigel-fri) skær.

Statistical Analysis Salg

Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af Students t -test (SPSS version 16), med

s

. 0,05 betragtet som statistisk signifikant

Resultater og diskussion

Vi først testet vores hypotese om, at

CLDN11

promotor er hypermethyleret og at denne hypermethylering korrelerer omvendt med

CLDN11

mRNA-ekspression i primære GC væv. Forbundne primære gastrisk normale og tumorvæv blev indsamlet ved Johns Hopkins Hospital (JHH). Prøver blev opnået umiddelbart efter resektion og lynfrosset indtil anvendelse. Kun sager opnået med informeret samtykke, som er godkendt af Institutional Review Board (IRB) blev inkluderet i dette projekt. Genomiske DNA’er blev opnået fra 36 kliniske prøver, der omfatter 18 GC og 18 matchede noncancerous maveslimhinden (NS) væv.

CLDN11

promotor methylering niveauer i disse prøver blev analyseret ved brug af kvantitativ real-time methyleringsspecifik PCR (qMSP). Figur 1A viser den normaliserede methylering værdi (NMV),

dvs..

, Forholdet mellem methyleret værdi

CLDN11

promotorregion i hver prøve til et fuldt methyleret kontrol-DNA’et.

CLDN11

NM

Vs

var signifikant højere i GC prøver end i deres matchende NS væv (

P

0,001). For at vurdere, om

CLDN11

promotor hypermethylering i GC’ers var forbundet med lyddæmpning af

CLDN11

udtryk,

CLDN11

mRNA-niveauer blev målt ved hjælp af kvantitativ real-time (QRT-PCR) i RNA’er ekstraheret fra de 36 prøver, der anvendes til methyleringsanalyse. Som vist i figur 1B, normaliserede udtryk værdier (NEVs) af

CLDN11

i GC prøver var betydeligt lavere end i parrede NS prøver (

P

0,001). Disse data fastslår, at

CLDN11

promotor hypermethylering korrelerer med formindsket eller tavshed

CLDN11

mRNA-ekspression i primære GC’er.

Denne figur illustrerer promotor methylering og mRNA ekspressionsniveauer af

CLDN11

i parret gastrisk cancer (GC) og noncancerous maveslimhinden (NS) væv. A) Kvantitativ methylering-specifik PCR (qMSP) for

CLDN11

i primære væv. Genomisk DNA ekstraheret fra 18 GC og 18 matchede NS væv blev udsat for qMSP analyse ved hjælp MSP amplikon og TaqMan sonde designet til at omfatte flere CpG sites i 5′-UTR-regionen i

CLDN11

gen. CpGenome Universal Methyleret DNA (Chemicon International, Temecula, CA) blev anvendt som en fuldt methyleret positiv kontrol. Duplex PCR med β-actin (ACTB) primer og probesekvenser, der ikke indeholder CpG’er blev udført for normalisering. Normaliseret methylering værdi (NMV) blev defineret som følger: NMV = (

CLDN11-S-service /

CLDN11-FM

) /(

ACTB-S-service /

ACTB -FM

) * 100, hvor

CLDN11-S

CLDN11-FM

repræsentere

CLDN11

methylering niveauer i prøven og fuldt methylerede DNA, hvorimod

ACTB-S

ACTB-FM

svarer til

β-actin

i prøven og fuldt methylerede DNA, hhv. Dette endimensionale scatterplot viser signifikant høj

CLDN11

promoter methylering niveauer i GC prøver sammenlignet med de NS prøver (

P

0,001

). Whole-genomet amplificeret DNA (WGA) anvendt som et ikke-methyleret negativ kontrol viste ingen amplifikation.

P

værdi blev beregnet ved hjælp af parrede t-test. B)

CLDN11

mRNA-ekspression i gastrisk væv. Totalt RNA ekstraheret fra 18 parrede NS og GC-prøver blev underkastet

CLDN11

specifik RT-PCR.

CLDN11

mRNA-ekspression blev normaliseret til

β

-actin mRNA-ekspression i hver prøve.

P

værdi blev beregnet ved hjælp af parrede t-test. Dette plot viser, at

CLDN11

mRNA ekspressionsniveauerne var signifikant lavere for ikke-påviselige i GC prøver, mens de fleste af de tilsvarende NS prøver havde påviselig

CLDN11

mRNA-niveauer (

P

0,001

). C) 2D-scatter plot af promotor-methylering og mRNA-ekspression værdier i GC væv.

CLDN11

mRNA-ekspression lyddæmpning er forbundet med promoter hypermethylering i GC patienter. Dette to-dimensionelle scatterplot viser NEV værdier (Y-aksen) og NMV værdier (X-akse) i de 18 parrede NS og GC prøver.

Næste, vi evalueret

CLDN11

promotor-methylering og ekspression i gastriske cellelinier. Immortaliserede humane normale gastriske epitelceller (HFE145) og GC cellelinier AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, og SNU-1 blev undersøgt. Alle testede GC cellelinier (AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, og SNU-1) demonstrerede promoter hypermethylering, mens ingen methylering blev observeret i udødeliggjort normale HFE145 celler (Figur 2A).

CLDN11

mRNA niveauer blev vurderet ved anvendelse QRT-PCR på RNA’er oprenset fra cellelinier, mens claudin-11-protein-ekspression blev analyseret ved Western blotting. Som vist i figur 2B, alle 5 cancer linjer udviste ingen detekterbar ekspression af

CLDN11

mRNA eller protein, mens HFE145 celler manifesteret høj

CLDN11

ekspressionsniveauer. Dette fund fastslår, at

CLDN11

er sideordnet hypermethyleret og nedreguleret i GC cellelinier i forhold til normale gastriske epitelceller (NGECs).

Denne figur illustrerer claudin-11 promotor methylering, mRNA-ekspressionsniveauerne og proteinekspression i gastriske cellelinjer. A) Kvantitativ methylering-specifik PCR (qMSP) for

CLDN11

. Genomisk DNA isoleret fra immortaliserede humane normale gastriske epitelceller (HFE145) og GC cellelinier AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, og SNU-1 opnået fra ATCC blev analyseret af qMSP. Denne figur illustrerer, at promotorregionen af ​​

CLDN11

gen hypermethyleret i alle GC cellelinier i forhold til HFE145 celler. B)

CLDN11

mRNA-ekspression i gastriske cellelinier. Totale RNA’er fra forskellige gastriske cellelinier blev underkastet kvantitativ real-time RT-PCR-analyse. Som det kan ses i denne figur, HFE145 celler udtrykte meget høje niveauer af

CLDN11

mRNA, mens alle fem cancer testede cellelinjer havde meget lav eller udetekterbar

CLDN11

mRNA-ekspression. C) Western blot-analyse af claudin-11 ekspression i gastriske cellelinier. Totale cellelysater opnået fra forskellige gastriske cellelinier blev probet med anti-claudin-11-antistof. Denne figur illustrerer, at mens den immortaliserede normal gastrisk epitelcellelinje, HFE145 udtrykt rigelige claudin-11-protein, det kunne ikke påvises i forskellige GC-cellelinier. Anti-β-actin antistof blev anvendt som en belastning kontrol.

For yderligere at validere lyddæmpning af

CLDN11

udtryk ved hypermethylering, vi behandlede GC cellelinje AGS med demethyleringsmiddel, 5-aza-2-deoxycytidin (5-aza-dC, 1 uM), til varierende tidsintervaller. Total RNA udvundet før

vs.

Efter behandlingen blev udsat for QRT-PCR for

CLDN11

. Som det kan ses i figur 3, på hvert tidspunkt,

CLDN11

mRNA blev igen udtrykt ved behandling med 5-aza-dC, bekræfter, at

CLDN11

er bragt til tavshed af promotor hypermethylering i AGS GC celler.

AGS er en GC cellelinje manifesterer hypermethylering af

CLDN11

promotor sammen med fraværende

CLDN11

mRNA-ekspression. Disse celler blev behandlet med 5-aza-dC, en global demethyleringsmiddel. Totalt RNA fra AGS celler før og efter 5-aza-dC behandling blev udsat for kvantitativ real-time RT-PCR-analyse for

CLDN11

mRNA-ekspression.

Y-akse

repræsenterer gennemsnittet gange ændring i ekspressionsniveauerne af

CLDN11

mRNA efter 5-aza-dC behandling på forskellige tidspunkter, sammenlignet med de ubehandlede celler. AGS-celler, når de behandles med 5-aza-dC, udviste en tidsafhængig stigning i

CLDN11

mRNA-ekspression op til 72 timers behandling. Denne restaurering af

CLDN11

udtryk efter 5-aza-dC behandling understøtter vores hypotese om, at claudin-11 er bragt til tavshed af promotor hypermethylering i GC celler.

Medlemmer af claudin protein familien har været impliceret i reguleringen af ​​celleadhæsion, invasion og migration af cancerceller [25] – [27]. Derfor vi næste undersøgt, om

CLDN11

påvirkninger celle motilitet eller invasiv. HFE145 celler, som udtrykker rigelige

CLDN11

, blev valgt til at studere virkningerne af

CLDN11

knockdown på invasive og migrerende egenskaber af gastriske epitelceller. Forbigående siRNA transfektioner blev udført ved hjælp af

CLDN11-

specifikke siRNA dobbelthuse. Transfektion med

CLDN11

-specifik siRNA rækkehuse effektivt undertrykt claudin-11 protein niveauer af 90%, mens udtryk forblev uændret i mock- eller kontrol siRNA-behandlede celler (figur 4A). Cellemotilitet og invasion assays blev udført på siRNA-transficerede celler under anvendelse af et modificeret Boyden-kammer-assay-systemet [25]. Interessant nok som vist i figurerne 4B og 4C, inhibering af

CLDN11

ekspression i HFE145 celler steget betydeligt de migrerende og invasive potentialer disse celler.

HFE145 cellelinie, som er claudin- 11 positive blev valgt til at studere den rolle, claudin-11 knockdown på migrations- og invasion egenskaber gastriske celler. Celler blev transficeret med

CLDN11

specifikke siRNA oligoer. Mock transfektioner og ikke-specifikke siRNA-duplexer blev anvendt som negative kontroller. A) Western blot-analyse af siRNA-medieret claudin-11 knock-down i HFE145 celler. HFE145 celler blev transficeret med

CLDN11

– specifikke og ikke-specifikke kontrol siRNA dobbelthuse, som beskrevet i materialer og metoder. Efter 48 til 72 timer blev totale cellelysater fremstillet og analyseret for claudin-11-ekspression. Transfektion af claudin-specifikke siRNA oligoer resulterede i 90% reduktion i ekspression af proteinet, hvorimod niveauet af claudin protein i kontrolcellerne ikke blev væsentligt ændret. B) Boyden kammer celleinvasion assay. Invasivitet af siRNA-transficerede celler blev bestemt ved anvendelse matrigel belagt invasion kammer, ved anvendelse af en modificeret Boyden kammer assay. Forsøg blev gentaget mindst tre gange, med tre eksemplarer hvert eksperiment. De data, der er repræsenteret her er den gennemsnitlige gange ændring i invasionen af ​​siRNA-transficerede celler sammenlignet med mock transfektioner. Som vist i denne figur, siRNA knockdown af claudin-11 fører til en stigning i celle invasion af HFE145 celler. C) To kammer cellemigrationsassay. Virkningerne af claudin-11 knockdown på migration af HFE145 celler blev sammenlignet ved at måle antallet af celler migrerer gennem uovertrukne filtre (i stedet for Matrigelcoatede filtre). Søjlerne i denne figur repræsenterer middelværdien gange ændring i migration af siRNA-transficerede celler sammenlignet med mock-transficerede kontrolceller. Som det kan ses i denne figur, er en reduktion i claudin-11 protein niveauer er forbundet med øget motilitet af cellerne.

Den aktuelle undersøgelse bekræfter således hypotesen om, at

CLDN11

, en tight junction protein, tavshed i GC via promotor hypermethylering, og disse data understøtter inddragelsen af ​​

CLDN11

i kontrollen af ​​GC celle invasion og migration.

promotor hypermethylering er kendt for at være forbundet med transkriptionel inaktivering af visse gener. DNA-methylering kan forstyrre binding af transkriptionsfaktorer, hvis bindingssteder indeholder CpG-dinukleotider. Brug af TFSEARCH software program, vi scannet

CLDN11

sekvens sig at være hypermethyleret i mavekræft væv og cellelinjer,

dvs

., Den qMSP amplikon (-104 til fire baser i forhold til det transkriptionelle startsted for

CLDN11

). Denne scanning identificeret formodede bindingssteder for Sp1 og GATA-1- og GATA-2. Tidligere undersøgelser har vist, at hypermethylering af promotor-DNA bidrager til dæmpning af

CLDN3

og

CLDN4

i æggestokkene cellelinier, delvis

via

methylering-induceret ødelæggelse af binding af Sp1 til dets beslægtede bindingssted (22, 23). Endvidere har medlemmer af GATA familien vist sig at være positive regulatorer af

CLDN11

transkription [28]. Yderligere undersøgelser er nu berettiget til at vurdere, om hypermethylering af disse steder interfererer med bindingen af ​​transkriptionsfaktorer, og hvordan sådanne forstyrrelser kan påvirke

CLDN11

gentranskription.

Tumor celler typisk udviser strukturelle og funktionelle mangler i deres TJs [17]. Disse mangler er forbundet med et tab af polaritet og differentiering. En anden vigtig forbindelse mellem TJs og kræft er et tab af TJ integritet, med deraf følgende lækage eller transport af pro-tumorigene stoffer (såsom vækstfaktorer eller næringsstoffer) i at udvikle tumorceller primordier, fremme tumorvækst [29]. Endvidere kan tabet af polaritet, differentiering og klæbeegenskaber associeret med forringet TJ funktion i cancer være kritisk i at erhverve en metastatisk fænotype [30]. Undersøgelser har antydet, at uregelmæssigheder i TJ-associerede proteiner kan repræsentere epithelial-mesenchymal overgang (EMT), og således ændre den invasionsevne og motilitet af cancerceller.

Modulationer i ekspression af TJ-associerede proteiner, især claudin proteiner, har blevet vist i en række cancere. Nylige undersøgelser af os og andre har vist ændringer i claudin protein regulering i forskellige epitelial kræft [18]. Medlemmer af claudin genfamilien udtrykkes på en yderst vævsspecifik, samt en meget udviklingstrin-specifik, måde. Desuden, afhængigt af cancer type, kan ekspressionen af ​​claudin proteiner enten være opreguleret eller nedreguleret i cancerceller. For eksempel er flere claudin proteiner opreguleres i colon, ovarie, pancreas- og prostatacancer, mens nogle er nedreguleret i brystkræft og hoved og hals kræft [16], [18]

Undersøgelser har tidligere rapporteret ændringer i ekspression profiler af medlemmer af claudin familien at være forbundet med GC. Seriel analyse af genekspression (SAGE) identificerede den

CLDN18

gen som nedreguleret i GC’er besidder en tarm fænotype [31].

CLDN23

gen er også nedreguleres i tarm-type GCS [32]. Omvendt Cunningham

et al.

Rapporteret

CLDN4

udtryk øges i tarm metaplasi og gastrisk epitel dysplasi, identificere dette gen som markør for GC precursor læsioner [33]. I den aktuelle undersøgelse, fandt vi

CLDN11

udtryk, der skal nedreguleret eller tavshed i GC

via

hypermethylering af sin promotor-regionen. Desuden fandt vi, at i modsætning til

CLDN18

og

CLDN23

,

CLDN11

udtryk blev nedreguleret i GC patientprøver samt i cellelinjer, uanset diffus

vs .

intestinal subtype.

Claudin-11, også kendt som oligodendrocyt-specifikke protein, blev først identificeret til at være specifikt udtrykkes i tight junction strenge af oligodendrocytter i hjernen og i Sertoli celler fra rotter og mus [ ,,,0],34], [35]. Tab af claudin-11 udtryk, hvilket fører til afbrydelse af TJ barriere, er forbundet med neurologiske og reproduktive underskud [36]. En nylig undersøgelse rapporteret overekspression og mislocalization af

CLDN11

fra blod-testis-barrieren i Sertoli-celler at være forbundet med testikelkræft intraepitelialneoplasi hos mænd [37]. Data i den aktuelle undersøgelse fastslår, at

CLDN11

udtrykkes i normale gastrisk væv og udødeliggjort NGECs. Men dens komplette funktioner i normal mave samt i gastrisk carcinogenese fortsat uklare.

I et forsøg på at undersøge mulighederne for inddragelse af

CLDN11

i GC, vi studerede fænotypiske ændringer i forbindelse med lyddæmpning af

CLDN11

udtryk i

CLDN11-

udtrykker gastriske epitelceller (HFE145). Meget interessant, siRNA-medieret knockdown af

CLDN11

medførte øget celle motilitet og invasion.

Tidligere undersøgelser har rapporteret kræft-specifikke fænotypiske ændringer for at blive associeret med modulationer i claudin udtryk i forskellige cancertyper . Overekspression af claudin-3 og claudin-4 proteiner i æggestokkene cancercellelinier resulterer i øget invasion af disse celler [25].