PLoS ONE: Molekylær Interaktion af en kinase inhibitor MIDOSTAURIN med Anticancer Drug Targets, S100A8 og EGFR: transskriptionsprofilering og Molekylær Docking Undersøgelse for nyrekræft Therapeutics

Abstrakt

S100A8 og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) proteiner er proto-onkogener, som er stærkt udtrykt i en række cancertyper. EGFR fremmer cellulær proliferation, differentiering, migration og overlevelse ved at aktivere molekylære veje. Inddragelse af proinflammatorisk S100A8 i tumor celledifferentiering og progression er stort set uklar og ikke undersøgt i nyrekræft (KC). S100A8 og EGFR er potentielle terapeutiske biomarkører og anticancer narkotika mål for KC. I denne undersøgelse har vi undersøgt molekylære mekanismer for interaktion profiler af begge molekyler med potentielle anticancerlægemidler. Vi foretog transskriptionsprofilering i Saudi KCS hjælp Affymetrix HuGene 1.0 ST arrays. Vi identificerede 1478 betydeligt udtrykte gener, herunder S100A8 og EGFR overekspression, hjælp cut-off p værdi 0,05 og fold forandring ≥2. Desuden har vi sammenlignet og bekræftet vores resultater med udtryk data til rådighed på NCBI s GEO-database. Et betydeligt antal gener forbundet med kræft viste engagement i cellecyklusprogression, DNA-reparation, tumor morfologi, væv udvikling, og celle overlevelse. Aterosklerose signalering, leukocyt ekstravasation signalering, hak signalering, og IL-12-signalering var de mest alvorlig indvirkning signalveje. Nærværende undersøgelse giver en indledende transkriptionel profilering af Saudi KC patienter. Vores analyse tyder distinkte transkriptom underskrifter og veje underliggende molekylære mekanismer i KC progression. Molekylær docking analyse viste, at kinase inhibitor “MIDOSTAURIN” har blandt målene for udvalgte narkotika, de bedste ligand egenskaber til S100A8 og EGFR, hvilket indebar, at sine bindende hæmmer nedstrøms signalering i KC. Dette er den første struktur-baserede docking undersøgelse for de valgte mål protein og anticancer narkotika, og resultaterne viser, S100A8 og EGFR som attraktive anticancer mål og MIDOSTAURIN med effektive narkotika egenskaber til terapeutisk intervention i KC

Henvisning:. Mirza Z, Schulten HJ, farsi HM, al-Maghrabi JA, Gari MA, Chaudhary AG, et al. (2015) Molekylær Interaktion af en kinase inhibitor MIDOSTAURIN med Anticancer Drug Targets, S100A8 og EGFR: transskriptionsprofilering og Molekylær Docking Undersøgelse for nyrekræft Therapeutics. PLoS ONE 10 (3): e0119765. doi: 10,1371 /journal.pone.0119765

Academic Redaktør: Jaydutt V. Vadgama, Charles R. Drew University of Medicine and Science, UNITED STATES

Modtaget: 9. september 2014 Accepteret: 16 januar 2015; Udgivet: 19 Mar 2015

Copyright: © 2015 Mirza et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af kong Abdullah City for Videnskab og Teknologi, Riyadh, Saudi-Arabien (KACST, Strategic Project ID 10-BIO1258-03 og 10- BIO1073-03) og Dekanat forskningsleder, Kong Abdulaziz Universitet (Projekt ID: HiCi-1434-117-2). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er et globalt stort sundhedsproblem. Dysregulering i molekylære signalveje er kendetegnende for kræft initiering og progression [1-3]. Nyrekræft (KC) tegner sig for ca. 1,5 procent af alle kræftdødsfald. Især KC er almindelig hos overvægtige mandlige befolkning [4]. Kirurgisk tumorresektion er standard helbredende behandling. Metastatisk KC er næsten nonresponsive konventionelle systemiske behandlinger og næsten alle patienter dør af metastase. Manglende lovende biomarkører for effektiv målrettet kemoterapi udgør en stor udfordring i KC ledelse. Bedre forståelse for de molekylære mekanismer effektive i KC har udvidet vinduet til udvikling af effektive målrettede behandlinger [5,6]. High-throughput microarray platforme er velegnede til identifikation af hidtil ukendte inducerede eller undertrykte sygdomsrelaterede skyldige gener [7]. Molekyler, der viser direkte involvering i en biokemisk eller regulatoriske vej, der fører til sygdom er potentiel anticancer mål. Drug /molekyle interaktion involverer disse mål kan enten undersøges ved co-krystallisation eller afprøvet af docking simulering for at identificere molekylære interaktioner, der kræves for rationel drug design [8]. High-throughput docking er nøglen indgangen til lægemiddelopdagelse [9,10]. Transkriptom profilering og funktionel pathway analyse i KC har identificeret flere markant differentielt udtrykte gener, herunder S100A8 og EGFR. Vi forsøgte at vurdere deres potentiale som KC drug target af

i silico

docking med kendt proteinkinaseinhibitorer. Samlet set denne undersøgelse illustrerer struktur-baserede virtuelle screening og ligand-protein docking af anticancer-lægemidler, f.eks MIDOSTAURIN, enzastaurin, og gefitinib, med mål anticancer, S100A8 og EGFR.

S100A8 er en lille (10 kDa) proinflammatoriske protein af S100 familie, som har tendens til at danne heterodimere komplekser med S100A9 (S100A8 /A9) [9 ], der undergår konformationelle ændringer efter Ca

2+ bindende og funktion som intracellulære Ca

2 + sensorer [10]. Under fysiologiske betingelser, er disse Ca

2 + bindende EF hand typen proteiner konstitutivt udtrykt af myeloide celler [11-13]. Men under patologiske tilstande som betændelse og kræft, er en forøget ekspression af S100A8 set i epitelceller [14,15]. Tidlig fase død S100A8 knock-out mus viser Væsentlighed dette gen for overlevelse [16]. Øget niveau af S100A8 findes i forskellige carcinomer, herunder bryst- [15], prostata [17,18], lunge [19], gastrisk [20], hepatisk [21], pancreas [22] og kolorektal cancer [23,24]. En nylig undersøgelse viser, cellevækst-fremmende aktivitet og binding til receptor for avancerede glykering slutprodukter (RAGE) ved lave S100A8 koncentrationer [15]; Men den direkte rolle i tumorogenesis er tvetydig og skal belyses endnu. Det er blevet rapporteret, at primære tumorer secernerer opløselige faktorer, som inducerer ekspression af S100A8 i endotelcellerne før tumormetastase [19]. Ved aktivering af p38 MAPK-vejen, det øger motiliteten af ​​cirkulerende cancerceller [25]. Derfor målretning S100A8 kunne anvendes til at forhindre tumorcellemigration og vækst. Adskillige rækker af beviser peger på vitale funktioner S100A8 under tumorigenese og, selv om det er nøjagtige rolle i tumormikromiljøet er stadig ikke klart, er der blevet foreslået forskellige tumorfremmende effekter. Men, er forskningen begrænset på sit udtryk mønster i kræft, sit engagement i onkogenese og dens potentiale som terapeutisk biomarkør. Så vidt vi ved, har ingen undersøgelse rapporteret men dens ekspressionsmønster eller dens rolle i KC progression.

EGFR er en af ​​de fire medlemmer af ErbB-familien af ​​receptortyrosinkinaser. Den receptor er overudtrykt eller muteret i mange kræftformer, fremhæver sin rolle som terapeutisk kræft biomarkør. Det er involveret i forskellige cellulære funktioner, såsom proliferation, angiogenese og undertrykkelse af celledød. Bliver et transmembrant protein, EGFR passerer afgørende signaler fra epitelcelle overflade til det intracellulære domæne til kontrolleret celleproliferation, migration og adhæsion. Overudtrykt EGFR transmitterer flere signaler til celle for accelereret vækst og cellulær levetid, og spiller en central rolle i carcinogenese af forskellige typer af kræft [26-29]. Forbedret opfattelse af de molekylære signalveje har åbnet nye strategier og måder for kræftbehandling. Således målrettet EGFR at slukke sin signaltransduktion forventes at blokere vækst og overlevelse af kræftceller.

S100A8 og EGFR kan spille en vigtig rolle i malignitet og derfor betragtes som potentielle lægemiddelkandidater til kræftbehandling udvikling [26 -30]. Grunden til at vælge MIDOSTAURIN, enzastaurin, og gefitinib som inhibitor for S100A8 og EGFR er den seneste forskning viser, at EGFR-målrettede terapier hjælp kinase hæmmere er effektive i mange kræftpatienter [31-36]. Gefitinib, en inhibitor af EGFR-kinase-funktion, blev godkendt af den amerikanske FDA til lungekræft behandling [37]. S100A8 ejer ikke nogen kinase domæne eller ATP bindende lomme, men det deltager i protein fosforylering [38] og er en opstrøms vej molekyle af EGFR. Således et lægemiddel stand til at inhibere både EGFR og S100A bærer potentielle terapeutiske virkninger.

Efter opdagelsen af ​​proteinkinaseaktivitet i 1954, en masse kinaseinhibitorer er blevet identificeret [39]. På grund af høj grad af lighed i deres struktur og funktion i “kinome” [40], identifikation af effektive proteinkinaseinhibitorer (PKIs) er en stor udfordring. På nuværende kinase hæmmere omfatter mere end 30% af lægemiddel-discovery programmer resulterer i godkendelse af snesevis af kinase inhibitorer som anti-cancer medicin eller mindst afprøvning i kliniske forsøg [41]. I denne undersøgelse, vi bestemt ved docking simulering den potentielle effektivitet tre sådanne lægemidler navngivne MIDOSTAURIN, enzastaurin, og gefitinib

(i) MIDOSTAURIN (CID 104.937, også kendt som PKC412 og benzoylstaurosporin). Er en multi-target kinaseinhibitor anvendes til akut myeloid leukæmi behandling. Det er et semisyntetisk alkaloid afledt af bakteriel staurosporin anvendes til behandling af patienter med CD135 (FMS-lignende tyrosinkinase 3 receptor) mutationer [42]. MIDOSTAURIN hæmmer vækst eller inducerer apoptose i flere typer af kræft, blokerer angiogenese og sensibiliserer kræftceller for ioniserende stråling, der begrunder dens anvendelse i kræftbehandlingen [43]. Prækliniske undersøgelser har vist, at MIDOSTAURIN arbejder synergistisk med kemoterapeutiske stoffer, styrkelse hinandens effekt mod kræft [44]. (Ii) Enzastaurin er en syntetisk acyklisk Bisindolylmaleimide viser antineoplastisk aktivitet. Det er en lille oral serin /threonin kinase inhibitor af PKCβ og AKT pathways. Det hæmmer proteinkinase Cp der er kendt stimulator af neo-angiogenese gennem induktion af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF). Binding af protein kinase Cp til ATP-bindingsstedet af VEGF sandsynligvis reducerer tumor blodforsyning og forhindrer vækst. Bortset fra sin anti-VEGF faktor virkninger, lav koncentration af enzastaurin undertrykker proliferation i cancercellelinier [45]. Tab af GSK3p og AKT phosphorylering er blevet rapporteret i myelomaceller behandling med enzastaurin [46]. (Iii) Gefitinib (Iressa) selektivt målretter ATP kløft inden EGFR tyrosinkinasedomæne [47]. Det afbryder EGFR signalering af target-celler, og derfor er kun effektiv i cancerceller med muteret og overaktiv EGFR.

Molekylær docking prognoser en optimeret kropsbygning og relativ orientering for både protein og ligand molekyle. I denne undersøgelse blev vi sigter mod at vurdere potentialet i S100A8 og EGFR som KC drug target af

in silico

molekylær docking med den kendte proteinkinaseinhibitorer MIDOSTAURIN, enzastaurin, og gefitinib for at teste effektiviteten af ​​disse lægemidler mod cancer under disse konstellationer.

Materialer og metoder

patienter og prøver

undersøgelsen blev udført på patienter fra Saudi-Arabien diagnosticeret med renalcellecarcinom. Prøverne blev indsamlet fra Kong Abdulaziz University Hospital, Bakhsh Hospital og King Faisal Specialist Hospital Research Center, Jeddah løbet 2010-2012. For genekspression analyse blev frisk tumor og normale vævsprøver taget fra kirurgiske resektioner af tumor og normale nyrevæv henholdsvis og blev straks placeret i RNAlater (Invitrogen-Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Ud af 18 tumorprøve, kun to bestået kriterier (RNA integritet nummer (RIN) 5), der skal anvendes til opstilling ekspressionsanalyse. En patient var 61 år gammel Saudi mand, diagnosticeret med klar celle renalcellecarcinom af nuklear grad II og tumorstørrelse 4,5 x 3 x 4 cm. Den anden patient var 47 år gammel Saudi kvinde, diagnosticeret med kromofobt renalcellecarcinom af Fuhrman lønklasse II.

Etisk godkendelse.

Alle patienter inkluderet i undersøgelsen forudsat skriftligt informeret samtykke. Undersøgelsen blev revideret og godkendt af Center of Excellence i Genomisk Medicin Research (CEGMR) lokal etisk komité (autorisationsnummer 08-CEGMR-02-ETH).

RNA ekstraktion og kildebehandling

totalt RNA blev ekstraheret fra frisk konserverede nyre vævsprøver med Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), herunder en on-søjle DNAse behandling ifølge producentens anbefalinger. Kvaliteten af ​​det oprensede RNA blev kontrolleret på en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Middelværdi af RIN for behandlede prøver var 8,0 kun for to kræft prøver og fire normale nyrevæv. RNA-koncentrationer blev bestemt ved anvendelse af et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). RNA-prøver (250 ng) blev bearbejdet i overensstemmelse med producentens anbefalinger (Life Technology, Grand Island, NY). Efter fragmentering og mærkning blev prøverne hybridiseret ved 45 ° C i 17 timer til Human Gene 1.0 ST GeneChip arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Disse arrays er konceptuelt baseret på det menneskelige genom sekvens samling UCSC hg18, NCBI Build 36 og afhørt med et sæt af 764,885 sonder 28,869 kommenterede gener.

Gene Expression Analysis

Vi har udført udtryk profilering af to nyrecellecancere og fire normale nyrevæv. På grund af vores begrænset antal prøver, var uafhængige datasæt tilgængelige i det offentlige domæne indarbejdet i genekspression analyseprocessen. Vi brugte valgt KC udtryk data fra NCBI s GEO-database (Tiltrædelse nr: GSE781, GSE7023, og GSE6344) for sammenlignende analyse og bekræftelse. Prøve størrelse for GSE781, GSE7023, og GSE6344 var 34, 47 og 40 hhv. Affymetrix. CEL filer blev importeret til Partek Genomics Suite-version 6.6 (Partek Inc., MO, USA). Dataene blev normaliseret ved hjælp RMA normalisering. Variansanalyse (ANOVA) blev påført på den fuldstændige datasæt og listen over differentielt udtrykte gener blev derefter dannet ved anvendelse falsk opdagelse sats (FDR) på 0,05 med 2-gange ændring afskåret. Unsupervised todimensional gennemsnit kobling hierarkisk klyngedannelse blev udført ved hjælp af Spearmans korrelation som en lighed matrix.

Funktionel og Pathway analyse

For at definere biologiske netværk, interaktion og funktionel analyse blandt de differentielt regulerede gener i KC blev pathway analyserne anvender Ingenuity Pathways Analysis software (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA). Statistisk differentielt udtrykt datasæt med probesets ID, Gene symbol og Entrez gen id som klon identifikator, p-værdi og fold ændre værdier blev uploadet i IPA. Den funktionelle /pathway analyse af IPA identificerer de biologiske funktioner og /eller sygdomme og veje, der er ændret mest markant for det differentielt udtrykte gensæt. Betydningen af ​​forbindelsen mellem udtrykket data og de kanoniske veje blev beregnet ved forholdet og /eller Fishers eksakte test.

Molekylær Docking

Vi udførte molekylære docking studier (i) for at undersøge den rolle af S100A8 som inflammatoriske mediatorer og etablere deres engagement i inflammationsassocierede kræftformer på molekylært niveau og (ii) at undersøge, hvilken rolle af EGFR signalering i proliferation, angiogenese og undertrykkelse af celledød fremkalde kræft. De 3-D strukturer af identificerede cancer drug mål blev hentet fra Protein Data Bank (FBF ID: S100A8 dimer, 1MR8 og EGFR tyrosinkinasedomænet, 2GS2). De molekylære strukturer af inhibitorer blev hentet fra pubchem sammensatte database (MIDOSTAURIN med CID 104.937; enzastaurin med CID 176.167 og gefitinib med CID 123.631) (Fig. 1). Det bundne ligand blev anvendt som probe til bindingsstedet gitter generation. Struktur visualisering og identifikation af lægemiddel bindingssted blev udført under anvendelse PyMOL [48] (fig. 2). PyMOL blev anvendt til at analysere og generere en illustration af helt protein-ligand-kompleks.

Surface repræsentation af de to FBF strukturer, der anvendes til docking-analyse. Figur fremstillet ved anvendelse PyMOL. (1) MR8 kæde A (grøn) + kæde B (cyan) (2) 2GS2 kæde (gul), narkotika bindende hulrum i magenta.

Docking beregninger blev udført med Molekylær Docking Server [49] . Merck molekylær kraftfelt 94 (MMFF94) [50] blev anvendt til energi minimering af narkotika molekyler, der anvendes som ligand: MIDOSTAURIN, enzastaurin og gefitinib. Gasteiger delvis debitering blev tilsat til ligand atomer. Ikke-polære hydrogenatomer blev kombineret, og roterbare bindinger blev defineret. Molekylær docking af hver ligand blev udført individuelt med (S100A8)

2 homo-lysdæmper (1MR8), og EGFR tyrosinkinasedomæne (2GS2) protein-modeller, at forudsige bindende orientering og interaktion. Essential hydrogenatomer, Kollman united atom typen afgifter, og solvatisering parametre blev tilføjet ved hjælp af Autodock værktøjer [51]. Autogrid program blev brugt til at generere affinitet (gitter) kort på 20 × 20 × 20 Å gitterpunkter og 0,375 Å bindingssted gitter generation afstand [52]. Autodock parameter indstilling og afstand-afhængige dielektriske funktioner blev anvendt i van der Waals og beregning af elektrostatiske vilkår hhv. Docking simuleringer blev opnået ved hjælp af den Lamarcks teorier genetiske algoritme (LGA) og Solis Væder lokal søgemetode [53]. Orientering, indledende position, og torsion vinkler ligandmolekyler blev sat tilfældigt. Hver docking eksperiment var resultanten af ​​10 forskellige kørsler, som blev sat til at ophøre efter maksimalt 250000 energi evalueringer. Befolkningens størrelse var sat til 150. Under søgningen, en translationel skridt på 0,2 Å, og quaternion og vridning trin på 5 blev anvendt i den aktuelle serie af docking-analyse.

Tilgængelighed understøtte data

de datasæt understøtter resultaterne af denne undersøgelse er tilgængelige i NCBI s Gene Expression Omnibus (GEO), er identificeret som GSE781, GSE7023, og GSE6344 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term= GSE781).

Resultater

Det primære fokus for denne undersøgelse var at opdage nye anticancer narkotika målet ved transkriptom profilering og at identificere mulige protein-lægemiddelinteraktioner ved molekylær docking-analyse. Vi identificerede S100A8 og EGFR som vigtige proteiner af KC og gjorde et forsøg på at vise deres anticancer narkotika target potentiale.

Identifikation af differentielt udtrykte gener

Vi profilerede frisk nyre vævsprøver og sammenlignede dem med normal kontrolprøver. Klare forskelle blev også observeret mellem tumorer og normale væv afslører tydelige udtryk profiler for hver vævstyper. Sammenligning af hele genomet ekspression af KC afslørede 1478 differentielt udtrykte gener, 943 opreguleret og 535 nedreguleres, med en ≥ 2 gange ændring og falsk opdagelse sats p 0,05 (fig. 3, tabel 1, S1 tabel). Identificerede differentielt udtrykte gener i vores datasæt blev sammenlignet med re-analyseret datasæt (GSE-781, -6344 og-7023) hentes fra GEO database. 876, 1200 og 1258 differentielt udtrykte gener blev fundet signifikant for GSE781, GSE6344 og GSE7023 datasæt henholdsvis afskåret værdi fold forandringer 2 og p-værdi 0,05. Som forventet var der hundredvis af gener, der viser lignende udtryk mønster herunder S100A8 og EGFR, både gen blev overudtrykt i alle datasæt under undersøgelse undtagen GSE7023, hvor fold ændring var 1,948 for S100A8 og 1,893 for EGFR. Forhøjet udtryk for S100A8 og EGFR i vores CEGMR datasæt og GEO datasæt er bekræfter vores konklusion (tabel 2, S2 tabel). Vejviser

Veje og netværk underliggende nyrekræft

for at forstå de mekanismer, hvorved generne ændre en lang række fysiologiske processer, undersøgte vi biofunctions, molekylær netværk og stier er forbundet med KC. Interessant den biologiske proces, cellulær bevægelse blev signifikant overrepræsenteret i både nedreguleres og opreguleret gen lister peger at metastase sandsynligvis er knyttet til en anden ligevægt i at tænde og slukke. Funktionel analyse af KC-associerede gener fundet en overekspression af gener involveret i cellecyklusprogression, DNA-reparation, celledød, tumor morfologi og udviklingen væv. Pathway-analyse viste væsentlige forstyrrelser i visse signalveje, herunder atherosklerose signalering, LXR /RXR-aktivering, leukocyt ekstravasation signalering, leverfibrose /hepatisk stjerneformet celleaktivering hak signalering, og IL-12-signalering og produktion i makrofager (fig. 4, tabel 3) . Omfattende pathway analyse af differentielt regulerede gener kan tilvejebringe nye hypoteser underliggende tumor invasion og metastatisk progression af KC.

Red repræsenterer overekspression og grøn underekspression.

Docking undersøgelser

Molekylær docking studier forudsagde potentielle interaktioner af vores foreslåede mål protein stof med de udvalgte narkotika molekyler. Dette er en strukturel modellering tilgang til at studere mulige binding til kræftmedicin. For at forstå den molekylære samspil mellem narkotika og S100A8 blev serie af molekylær docking analyse udført ved hjælp af tredimensionelle struktur til rådighed (PDBID: 1MR8) med tre anti-cancer medicin, dvs. MIDOSTAURIN, enzastaurin og gefitinib. Ligandbindingsstedet var en hængselregion indeholdende to EF-hand motiver. På lignende måde, vi også simuleret docking af de ovennævnte lægemidler med tyrosinkinasedomænet af EGFR. Baseret på deres størrelse, stereokemi og strukturelle forskelle liganderne udviste varieret intensitet i binding med proteinet målmolekyler. De forudsagte parametre estimeret frie bindingsenergi, inhiberingskonstant (Ki), totale energi VDW + Hbond + desolvatisering + elektrostatisk energi, total intermolekylære energi og interagerende overfladeareal bedømtes til at estimere den gunstige binding af ligand lægemiddelmolekyler til målproteinet. Molekylær visualisering blev udført ved anvendelse PyMOL. Komplet interaktion profil (H-obligationer, polær, hydrofob, pi-pi, kation-pi og andre kontakter), og hydrogenbindinger (HB plot) interaktioner blev undersøgt (fig. 5 og 6, tabel 4).

ligand binding, ikke-ligand binding, hydrogenbinding og deres længder er markeret til MIDOSTAURIN, enzastaurin og gefitinib. . Hvor A, B, C viser interaktionen af ​​S100A8 (1MR8) med narkotika, og E, F viser interaktion af EGFR (2GS2) med MIDOSTAURIN og gefitinib henholdsvis

Red repræsenterer protein som tegneserie; grå betegner interagerende sidekæde som cylinder; og grøn repræsenterer lægemidlet som bold og stok model.

docking undersøgelser afsløre tilstedeværelsen af ​​én MIDOSTAURIN molekyle på underlaget-bindende site af S100A8 dimer (FBF kode 1MR8). Det bemærkes, at lægemiddelmolekylet er begravet i substratet-bindende hydrofob kanal i S100A8 ligandbindingsdomænet. De fleste af de interagerende rester er hydrofobe af karakter. Interaktion og tilgængelige overfladeareal analyse afslører, at hulrummet er involveret i bindingsstedet af lægemidler har en molekylær tilgængelige overfladeareal på 123,017 Å

2 og en opløsningsmiddeltilgængelig overfladeareal på 509,834 Å

2. De konformationer af bindingsstedet i S100A8 såvel som i lægemidler blev ikke ændret efter binding som stive docking simulering blev udført. Bindingen hulrum er den samme for alle tre lægemidler.

Vi valgte krystalstrukturen af ​​det aktive EGFR-kinase-domæne har en længde på 330 rester (PDB-kode 2GS2) for docking studier. Lægemidlet bindende hulrum i EGFR tyrosinkinasedomænet er mere som en kanal og er dybere i forhold til S100A8 sagen og har en molekylær og opløsningsmiddeltilgængelig overfladeareal på 181,409 Å

2 og 875,519 Å

2. Hulrummet er beklædt med hovedsagelig polært samt få ikke-polære rester. Enzastaurin udviste ikke nogen binding med den valgte tyrosinkinasedomæne. Gefitinib er et tidligere kendt inhibitor af EGFR og dets co-krystalstruktur er blevet bestemt og præsenteres i FBF (3UG2), dog docking undersøgelser viste, at MIDOSTAURIN er mere egnet bindende partner af EGFR end gefitinib.

(S100A8 )

2 (1MR8) med MIDOSTAURIN.

MIDOSTAURIN binder på ligandbindingsstedet og danner en H-binding med en kritisk aminosyrerest i ligandbindingsdomænet site af S100A8 dvs. Gin 69 (B) dannet mellem N1 af ligand og terminalen O i Gin. De er involveret i ligand kavitetsdannelse rester er to polære rester Gin 69 (B) og Glu 70 (B) og andre hydrofobe rester Ile 60 (B), Ile 73 (A), Ile 73 (B), Ile 76 (A), ile 76 (B), Val 80 (A) og Leu 72 (B) som vist i fig. 2. Mere end 20 hydrofobe kontakter og van der Waals interaktioner er også noteret. Den inhibitor udviser favorable bindingskarakteristika med den forudsagte frie bindingsenergi-9,77 kcal /mol og anslået hæmning konstant, Ki på 68,48 nM. Disse resultater er lovende og er overlegen i forhold til andre docking resultater gjort i denne undersøgelse.

(S100A8)

2 (1MR8) med enzastaurin.

Det stof bindes til proteinmolekylet tilfredsstillende med en anslået frie bindingsenergi af-4,19 kcal /mol og Ki på 844,18 uM. Det viser binding med S100A8 dimer men uden dannelse af hverken eventuelle H-bindinger eller polære kontakter. Det viser fem hydrofobe kontakter medieret af alifatiske ikke-polære aminosyrer Leu 72 (B), Ile 73 (B), Ile 76 (A), Ile 76 (B), og Val 80 (A). Andre mærkbare interaktioner er med Lys 77 (A) og Gln 69 (B).

(S100A8)

2 (1MR8) med gefitinib.

Bindende evne gefitinib er god, men der er ingen H-bindinger dannes og den frie energi af bundet struktur er-4.21 kcal /mol. Et bemærkelsesværdigt polar interaktion med Lys 77 af protein kæde A. Der er omkring ti hydrofobe interaktioner med lægemidlet bindingssted foring hydrofobe rester-Ile 73 (A), Ile 73 (B), Ile 76 (A) og Val 80 (A ). Halogen atomer F og Cl af lægemidlet viser non-kovalent interaktion. For protein-ligand-komplekser, halogenlamper obligationer er energisk og geometrisk sammenligneligt lig med den for hydrogenbinding hvis donor-acceptor retningsbestemmelse forbliver foreneligt. Denne intermolekylære interaktion har vist sig at være stabiliserende og en konformationel determinant i komplekser [54]. F viser en vand-medieret binding og Cl viser interaktion med Gin 69 (A). Et par andre svage vekselvirkninger blev bemærket også.

EGFR-kinase domæne (2GS2) med MIDOSTAURIN.

MIDOSTAURIN primært at være en kinase inhibitor dokker godt med EGFR tyrosin kinase domæne med gratis bindende energi -6,58 kcal /mol og hæmning konstant 15.13 uM. Fire H-obligationer er muligvis involveret mellem proteinet og liganden molekyle. Cys 773 Sγ viser H-binding med N4 af lægemiddel ved en interatomar afstand på 3,28 Å. Desuden atom 0δ2 af Cys 773 sandsynligvis danner en anden H-obligation med H atom af ligand. Lignende mønster af H-binding ses med Asp 776. Rester Arg 817, Thr 830 og Asp 831 er involveret i polære interaktioner med liganden. Hydrofobe interaktioner medieres af Cys 773 og Leu 820. Andre interaktioner med lægemidlet medieres via Lys 721, Glu 738, Asp776, Arg 817, Leu 820, Thr 830 og Asp 831.

EGFR kinasedomænet (2GS2 ) med enzastaurin.

kuperet struktur viser positiv fri energi af binding hvilket indebærer, at bindingen ikke er muligt, da de fleste af de opløste interaktion energier har positiv værdi. Resultatet kan delvis forklares ved, at enzastaurin er hovedsagelig en serin /threonin kinase inhibitor, men vi har forankret det med EGFR tyrosinkinasedomæne. Ellers kan forbedrede docking egenskaberne muligvis opnås ved at øge simuleringen boksen størrelse.

EGFR-kinase domæne (2GS2) med gefitinib.

I vores docking analyse alt tre H-bindinger ses, to med Thr 830 (interatomar afstand på 2,99 og 3,89 Å) og en med Glu 738 (3,48 Å). Glu 738, Asn 818 og Asp 831 display polære interaktioner. Leu 764, Cys 773 og Leu 820 udviser hydrofobe interaktioner. To vand-medieret halogenlamper obligationer ses med F. Flere andre interaktioner er bemærket med Val 702, Lys 721, Glu 738, Thr 766, Cys 773, Arg 817, Asn 818, Leu 820, Thr 830 og Asp 831. Det monomere ( V948R) gefitinib /erlotinib resistent dobbelt mutant (L858R + T790M) EGFR kinasedomæne tidligere er blevet co-krystalliseret med gefitinib (FBF ID: 4I22) [55]

diskussion

nyrekræft omfatter. heterogene tumorer med forskellige molekylære og kliniske karakteristika som afspejlet i deres reaktion på specifikke behandlinger. For at forstå de mekanismer, som gener ændrer en lang række fysiologiske processer, udførte vi en transskriptionel profilering undersøgelse for at identificere væsentlige gener og undersøgte deres biologiske funktioner, og identificere KC tilhørende molekylære netværk og veje. Blandt hundredvis af differentielt udtrykte gener identificeret vi S100A8 og EGFR som potentiel biomarkør for KC og forsøgte at demonstrere deres anticancer narkotika target potentiale.

I silico

docking-analyse viste, at MIDOSTAURIN og gefitinib binder til S100A8 samt til EGFR og forudsigeligt inhiberer nedstrøms signalering i KC. Imidlertid enzastaurin kun binder til S100A8 dimer. Vores konklusion fører til den hypotese, at S100A8 og EGFR er lovende anticancer lægemiddelvirkninger og MIDOSTAURIN kan være en potentiel inhibitor. Denne hypotese sikkert brug for yderligere validering.

S100 proteiner deltager i en lang række funktioner, herunder protein fosforylering, enzymatisk aktivering, calcium homeostase, og interaktion med cytoskeletale komponenter [38]. De fleste gener, der koder S100-proteiner er grupperet på en region af humant kromosom 1q21 der er udsat for kromosomale omlejringer, hvilket antyder en sammenhæng mellem S100A8 /A9 proteiner og metastase og tumordannelse [38,56]. S100A8 har celle vækstfremmende aktivitet ved lave koncentrationer ved binding til RAGE. Denne binding forbedrer celle mesenkymale egenskaber, inducerer epitel-mesenkymale overgang og spiller vigtig rolle i at fremme kræft invasion og metastase i kræft [15,22]. Unormale udtryk for S100A8 proteiner blev observeret i en række forskellige cancere, såsom gastriske, lunge, bryst, lever, pancreas og pladecelle øsofageale carcinomer [15,17,20-23,57-60]. Disse undersøgelser viser potentialet i S100A8 som anticancer mål.