PLoS ONE: opreguleret Polo-Like kinase 1 Expression korrelerer med Dårlige Survival Outcomes i Rektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Menneskelig polo-lignende kinase 1 (PLK1) udtryk er blevet forbundet med ringere resultater i kolorektal cancer. Vores mål var at analysere PLK1 i endetarmskræft, og dets samarbejde med klinisk-patologiske variabler, samlede overlevelse samt tumorregression til neoadjuverende behandling.

Metoder

PLK1 udtryk blev kvantificeret med immunhistokemi i midten og periferien (invasiv front) af rektale cancere, såvel som i de involverede regionale lymfeknuder fra 286 patienter. Resultaterne var baseret på farvning intensitet og procentdelen af ​​positive celler, ganget at give vægtede scores fra 1-12 dikotomiseret i lav (0-5) eller høj (6-12).

Resultater

PLK1 scorer i tumoren periferien var signifikant forskellige fra tilstødende normale slimhinde. Overlevelse analyse viste, at lav PLK1 score i tumoren periferien havde en hazard ratio for død på 0,59 i multivariat analyse. Andre prædiktorer for overlevelse inkluderet alder, tumor dybde, metastatisk status, vaskulære og perineurale invasion og adjuverende kemoterapi. Der var ingen statistisk signifikant sammenhæng mellem PLK1 score og histologiske tumorregression i neoadjuverende kohorte.

Konklusion

Lav score PLK1 var en uafhængig prædiktor for overlegen samlet overlevelse, justere for flere klinisk-patologiske variabler, herunder behandling .

Henvisning: Tut TG, Lim SHS, Dissanayake IU, Descallar J, Chua W, Ng W, et al. (2015) opreguleret Polo-Like kinase 1 Expression korrelerer med Dårlige Survival Outcomes i endetarmskræft. PLoS ONE 10 (6): e0129313. doi: 10,1371 /journal.pone.0129313

Academic Redaktør: Kyung S. Lee, National Cancer Institute, NIH, UNITED STATES

Modtaget: November 30, 2014, Accepteret: 8. maj 2015; Udgivet: 5 Juni 2015

Copyright: © 2015 Tut et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er en af ​​de førende årsager til dødelighed i den udviklede verden. Rektal kræftformer omfatter en tredjedel af disse sager og bære en dårligere prognose end tyktarmskræft. I lokalt avanceret indstilling, bliver de behandles forskelligt for tyktarmskræft, med trimodality terapi bestående af neoadjuverende chemoradiation, kirurgi og adjuverende kemoterapi [1]. Rectosigmoid tumorer behandles beslægtet med colon tumorer, som er metastatisk rektal cancer. Der er behov for biomarkører for at informere prognose og valg af behandling, vurdere behandlingsrespons, og støtte i lagdeling af patientens risiko for at tilpasse og personliggøre patientpleje.

For nylig Rodel og kolleger rapporterede polo-lignende kinase 1 (PLK1) at være en roman prædiktiv biomarkør for stråling følsomhed i endetarmskræft [2]. Vi hypotese, at overekspression af PLK1 korrelerer med fattigere resultater i endetarmskræft. PLK1 er en mitotisk serin /threonin kinase cellecyklus regulator nødvendig for celledeling, der er involveret i reguleringen af ​​mitotiske indrejse, spindel dannelse og cytokinese [3-5]. Den funktionelle betydning af PLK1 i carcinogenese og malign progression er ikke klart forstået, men ikke desto mindre dets overekspression findes i mange cancertyper [2,6], herunder colorectal cancer [7,8]. Dens tumorigen evne er blevet vist i nøgne mus injiceret med PLK1-overekspression NIH3T3 fibroblaster [9]. Udnyttelse af små interfererende RNA [10,11] og antisense-oligonukleotider [12] i maligne celler til at nedbryder PLK1 niveauer også induceret apoptose og inddæmning af ondartet spredning i

in vitro

og

in vivo

modeller. PLK1 aktivitet er nødvendig reparation fra DNA skader som følge af kemo- og strålebehandling [13]. Derfor PLK1 synes at være en lovende prædiktiv og prognostisk biomarkør, og heri undersøger vi sin rolle i endetarmskræft. Vi sigter også at vise, at PLK1 er uafhængig af celledeling markør Ki67.

Materialer og metoder

Etik godkendelse blev opnået den 22.

nd juni 2012 Fra det Sydney Sydvest-området Health service etiske komité Review, referencenummer HREC /12 /lpool /102. Den institutionelle Review Board frafaldes behovet for skriftligt informeret samtykke fra deltagerne, da projektet blev anset for at være i den lave eller ubetydelig kategori risiko. Information var de-identificeret før analyse.

Prøver fra primær kirurgi for rektal eller rectosigmoid kræftformer blev opnået fra Syd-vestlige område Patologi database, Australien 2000-2010. Kirurgi bestod af total mesorectal excision, med forreste eller abdominoperineal resektion. Variabler af interesse inkluderet alder, køn, patologisk stadium af tumor, kvalitet, vaskulær invasion, perineural invasion, tumor-infiltrerende lymfocytter og behandling. Iscenesættelse var baseret på amerikanske Blandede Cancer (AJCC) tumor-node-metastaser (TNM) system. Resultater af interesse var samlet overlevelse (OS) og histologiske tumorregression (TRG) i resekterede tarm for sager, der er behandlet med neoadjuverende chemoradiation. OS blev defineret som tiden fra diagnose til sidste opfølgning eller død. TRG blev gradueret på grundlag af de AJCC kriterier, modificeret fra Ryan [14]: komplet respons uden levedygtige maligne celler (0), moderat respons med enkelt eller lille gruppe af maligne celler (1), minimal respons med residual malignitet overvokset af fibrose ( 2) og dårlig reaktion med omfattende resterende malignitet (3). RG 0, 1 og 2 blev kategoriseret som respondenter og TRG 3 som ikke-responders. Opfølgning bestod af regelmæssige klinik besøg, koloskopi, blodprøver og billedbehandling skøn den behandlende specialist.

For hver patient, donor- blokke af paraffin indlejret væv blev hentet fra den anatomiske patologi afdelingen. To kerner, hver en millimeter i diameter, blev opnået fra hvert prøveudtagningssted som omfattede tumoren center (TC), tumor periferi (TP), normal slimhinde tæt på tumor (NCT) og normal slimhinde fra tumor (NAT). To væv borekerner fra lymfeknuder (LN) i node-positive tilfælde blev også opnået. TC blev taget fra midten af ​​tumormasse, TP fra infiltrerende /invasive tumor periferi, NCT fra normal mucosa umiddelbart op til tumoren og NAT fra normal mucosa godt væk fra tumoren, sædvanligvis ved slutningen tilknytning til resekterede tarm. Disse blev overført til de forborede huller i vævet microarray (TMA) blok ved hjælp af Beecher Manual væv arrayer-1 (Sun Prairie, WI, USA). TMA blokke blev opvarmet i 5 minutter i 60 ° C varm ovn til at forsegle hullerne mellem væv kerner og omkringliggende paraffin.

Slide sektioner taget fra TMA’er blev deparaffinised med xylen, efterfulgt af absolut alkohol, derefter re-hydreret i alkohol-gradient. Antigen blev hentet i varmen i 98 ° C vandbad med Tris EDTA (pH 9,0) puffer. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med H

2O

2, før inkubation med PLK1 primært monoklonalt muse-antistof (1:50 fortynding sc17783, Santa Cruz Biotechnology). Antistoffet blev fremskaffede og farvet som pr tidligere publiceret metode [15]. Linker trin med musen linker løsning, efterfulgt af sekundært antistof inkubation (Envision polymer FLEX /HRP, Dako) forud for anvendelsen af ​​chromogen (Flex DAB, Dako) og modfarvning med hæmatoxylin. Ki67 blev plettet på Dako Autostainer hjælp af den medfølgende antistof ved 1: 100 fortynding, med varme epitopgenfinding ved pH 6,0 og 10 minutter primære antistof inkubationstid

De immunfarvet sektioner blev undersøgt ved manuel optælling af celler i. hver TMA prik, med observatøren blindet til kliniske resultater. Procentdelen af ​​positive celler og farvning intensitet PLK1 blev bedømt (figur 1). Intensitet blev bedømt som negative (0), svag (1+), moderate (2+) eller stærk (3+) og procentdelen af ​​positive celler kategoriseret som 5% (0), 5-25% (1), 26 -50% (2), 51-75% (3) og 75% (4). Disse to foranstaltninger blev ganget at give vægtede score 0-12, dikotomiseret i lav (0-5) eller høj (6-12), som beskrevet af Rodel [15]. De to scoringer for hver to eksemplarer prøvetagningsstedet blev midlet, opnå de endelige gennemsnitlige vægtede score (S1 tabel). For Ki67 blev procentdel farvning scoret, og de to point for hver to eksemplarer prøvetagningsstedet blev midlet (S1 tabel).

Høje power billeder viser snesevis af (b) vægtet score på 0, (c) vægtet score på 3, fra en (procent 5-25%) x 3 (stærk intensitet) og (d) vægtet score på 4 (procent 75%) x 3 (stærk intensitet), bemærk kontrasten med tilstødende normale kirtler

Parret t-test blev anvendt til at sammenligne PLK1 i TC og TP, Fishers eksakte test for sammenhænge mellem PLK1 og clinicopathologic variabler, og Cox regression til OS. Kun sager med fuldstændige data om alle de variable domæner blev medtaget i de univariate og multivariate analyser. Signifikans blev fastsat til

s

0,05. Variabler, der univariate

s

-værdi ≤0.2 indgik i den oprindelige multivariate model. Ikke-signifikante variabler blev fjernet iterativt og koefficienter kontrolleres for at fastslå, om fjernelse af en variabel medført en stor effekt ændring for nogen af ​​de resterende variabler. Dette blev gentaget, indtil signifikante variabler forblev. Tovejs interaktioner mellem de resterende variabler blev undersøgt for signifikans og medtaget i modellen, hvis de var signifikante. Den supremum test for proportionel risiko antagelse blev anvendt til at bestemme, om de farlige funktioner over tid var konstant. For variabler, der ikke opfylder den proportionale farer antagelse, en interaktion sigt mellem tid og at variable blev medtaget i modellen for at tage højde for ikke-proportionalitet. Undergruppe analyser blev udført ved anvendelse af en lignende fremgangsmåde for patienter i lymfeknude positive gruppe at afgøre, om PLK1 i den involverede node korreleret med node nummer (Fishers eksakte test) og med overlevelse (Cox regression). En anden undergruppe analyse (Fishers eksakte test) blev udført for patienter, som havde gennemgået neoadjuvansterapi at bestemme, om der var en sammenhæng mellem PLK1 og TRG. Ki67 var korreleret med PLK1 scores ved hjælp af logistisk regression. Dataanalyse blev genereret ved hjælp af SAS Enterprise Guide software, Version 6.1 af SAS til Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

Resultater

Karakteristik af undersøgelsespopulationen

To hundrede og firs-seks sager blev identificeret, med en gennemsnitsalder på 73 år (S1 tabel). Den kohorte bestod af 34% kvinder, 66% mænd, 33% PT1 /2, 67% pT3 /4, 48% node-positive og 7% med metastatisk sygdom. Median opfølgning var 3,1 år og 5-års OS 58%. Toogtyve procent modtaget neoadjuvansterapi og 30% adjuverende behandling. Adjuverende kemoterapi bestod af infusion 5-FU, capecitabine eller FOLFOX (5-FU og oxaliplatin). Ud af den neoadjuverende terapi gruppe, 25% fik kort kursus (25 Gy på 5 fraktioner, 5 Gy per fraktion, over 5 dage) og 75% lange kursus samtidig chemoradiation (45-50,4 Gy, 1,8 Gy per fraktion, over 5 til 6 uger, med samtidig infusion 5-fluorouracil 225 mg /m

2 /dag).

PLK1 scoringer

Mean vægtet PLK1 score var 2,5 for tumor center (TC) og 3,4 for tumor periferi (TP). Fordelingen af ​​TC og TP vægtede scorer er vist i tabel 1, og de diskrete scorer er vist i S1 tabel. De dikotomiseret snesevis af positive versus negative er også vist. TC og TP vægtede score var signifikant forskellige (parret t-test

s

0,001). Farvning i TP og TC havde lignende proportioner 75% farvning (dvs. 35%), men andelen af ​​3+ farvning var 14% i TC og 25% i TP. Mean PLK1 score var 3,4 for NCT og 3,0 for NAT, og disse scoringer var signifikant forskellige (

s

= 0,025). NAT var signifikant forskellige fra TP (

s

= 0,011), men ikke til TC (0,08), hvorfor TP blev anset for at være en mere nøjagtig gengivelse af tumor-farvning, og vil blive anvendt heri til analyser. Fordelingen af ​​TP scores er illustreret i figur 2.

Foreninger mellem PLK1 scores og klinisk-patologiske karakteristika

En association blev fundet mellem TP scorer og metastatisk status, idet patienter med metastatisk sygdom havde en lav TP PLK1 score i 95% af tilfældene sammenlignet med 72% i den ikke-metastatisk sygdom (tabel 2). Der var ingen andre signifikante associationer.

Overlevelse analyser

De 12 variabler af interesse inkluderet TP PLK1 vægtet score, alder, køn, TNM stadie, histologisk klasse, vaskulær invasion, perineurale invasion , tilstedeværelse af tumor-infiltrerende lymfocytter, adjuverende kemoterapi og neoadjuverende behandling. Der var 219 tilfælde med fuldstændige data om alle disse domæner. Cox regression univariate analyser viste højere TP PLK1 score, højere alder, højere tumor T fase, metastatisk status, tilstedeværelse af vaskulære og perineurale invasion og fravær af adjuverende kemoterapi til at være betydelige prædiktorer for værre OS (tabel 3, figur 3). Den endelige multivariate model indeholder TP PLK1 score, nodal status, metastatisk status, et samspil mellem adjuverende kemoterapi og vaskulær status, og en vekselvirkning mellem adjuverende kemoterapi og tid (tabel 3). Høj TP PLK1 score, positiv nodal status, og tilstedeværelsen af ​​metastaser blev fundet at være forbundet med ringere overlevelse. Patienter, som ikke havde fået adjuverende kemoterapi haft værre overlevelse end patienter, der havde fået adjuverende kemoterapi og denne virkning blev observeret til at være værre for patienter, hvis kræft havde vaskulær invasion. Over tid, virkningen af ​​ikke at have adjuvans kemoterapi reduceret, og var ikke-signifikant efter 2 år for cancere uden vaskulær invasion. Men overlevelse forblev betydeligt værre for op til 10 år i kræft med vaskulær invasion (S1 Fig).

Lymfeknude positive undergruppe

Mean LN PLK1 score i 105 node-positive tilfælde var 3,1. Der var ingen statistisk signifikant sammenhæng mellem LN PLK1 scores og antal noder involverede (

s

= 0,097). Der viste sig imidlertid at være en tendens mellem højere LN PLK1 scores og større antal positive lymfeknuder, med 68% af high PLK1 scores der har N2 forhold til N1-status. Der var grænsetilfælde associationer mellem LN PLK1 scoringer og vaskulær invasion (

s

= 0,064), perineurale invasion (

s

= 0,070) og histologisk bedømmelse (

s

= 0,057) .

I univariate analyser (n = 78), LN PLK1 var ikke signifikant associeret med overlevelse (

s

= 0,114). I multivariate analyser (n = 78), var LN PLK1 ikke signifikant associeret med overlevelse (

s

= 0,7083) efter justering for adjuverende kemoterapi og vaskulær invasion interaktion; samt adjuverende kemoterapi og tid interaktion.

Neoadjuverende undergruppe

Ud af de 57 patienter, som gennemgik neoadjuverende chemoradiation. Tyve-tre procent havde TRG kvaliteter 1 til 2 (respondenter) og 77% havde TRG3 (ikke-respondenter). Der var ingen signifikant sammenhæng mellem TP PLK1 score og TRG (

s

= 0,096).

associering mellem PLK1 og Ki67

Ki67 betyder scores i TC, TP og LN var 9%, 8% og 4%. kerner i NAT og NCT var 1%. Logistisk regression afslørede ingen signifikante sammenhænge mellem PLK1 og Ki67 i TC (

s

= 0,539), TP (

s

= 0,406) og LN (

s

= 0,413).

diskussion

Mens der er en række publikationer om prognostiske virkninger af PLK1 i forskellige menneskelige maligniteter [6,16], dette er den første rapport til vores viden, undersøge PLK1 udtryk i forskellige sampling websteder fra samme tumor, som viser, opreguleret PLK1 udtryk i periferien af ​​den primære tumor korrelerer med ringere overlevelse resultat i endetarmskræft, og er uafhængig af proliferativ markør Ki67.

Vi fandt variable udtryk for PLK1 i centrum og periferi af den primære tumor, og i nodal aflejringer. Sammenlignet med normal slimhinde væk fra tumoren, den perifere PLK1 score var signifikant højere. Det perifere invasive fronten ville blive rationaliseret som værende mere reflekterende af tumor adfærd, da det er mere biologisk aktive med hensyn til interaktion med og destruktion af det omgivende væv. Periferien af ​​tumor masse er bedre iltet og forventes at være mere lydhøre over for stråling i modsætning til centret, som kan være iskæmisk eller nekrotisk. Vi foreslår, at tumoren periferien bruges som prøvetagningsstedet for rektal tumor PLK1 scoring.

Vi viste, at TP vægtet PLK1 score korreleret med samlede overlevelse, med en HR på 0,59. Det 5-års OS var 60% i gruppen med lave PLK1 score sammenlignet med 50% i gruppen med høj PLK1 scores. Væsentlige variabler for overlevelse inkluderet alder, tumor stadie, metastatisk status og interaktioner mellem adjuverende kemoterapi med vaskulær invasion, og med adjuverende kemoterapi og tid. TP PLK1 score var en uafhængig prognostisk faktor for at overleve, selv efter justering for disse variabler. Vigtigere, har vi justeret for adjuverende behandling. Vores median opfølgning var 3,1 år, hvilket ville være en afspejling af længere overlevelse sigt, eftersom treårige opfølgning er en passende endepunkt med en høj korrelation med den samlede overlevelse i kolorektal cancer [17].

PLK1 ekspression er også blevet dokumenteret i precursor /tidlige cancertyper i andre organer, såsom i æggestokkene cystadenoma [18] og i begyndelsen af ​​papillær thyreoideakarcinom [19] og tidligere PLK1 overudtrykker colorektale cancere er blevet rapporteret at vise en mere radioresistente fænotype [2 ]. Vi kunne ikke bekræfte dette i vores resultater, men vi erkender, at den neoadjuverende kohorte bestod kun en lille delmængde af vores undersøgelse befolkning og dermed kan have tilstrækkelig magt til at demonstrere dette forhold.

Vi undersøgte også PLK1 i lymfeknuder i node-positive population. Der syntes at være en tendens til en sammenhæng mellem højere LN PLK1 score og højere node nummer, hvilket er i overensstemmelse med vores hypotese, at overekspression af PLK1 korrelerer med fattigere resultater. LN PLK1 imidlertid ikke korrelerer signifikant med overlevelse, inden for de begrænsninger af små undergruppe analyser.

Lav PLK1 score var signifikant associeret med tilstedeværelse af metastatisk sygdom. I betragtning af, at vores kohorte bestod af en lille procentdel af metastatiske tilfælde (7%), vil den kliniske anvendelighed af PLK1 må undersøges yderligere i denne patientpopulation. Det kan antages, at de fleste metastatiske tilfælde ikke gav mulighed for indsamling af opereret væv, og derfor begrænser evnen til at opdage tilfælde med høj PLK1 farvning. Større undersøgelser er nødvendige for at definere interaktionen mellem PLK1 score og metastatisk status med hensyn til resultater.

Vi udførte også bekræftende farvning med Ki67, og viste ingen signifikant sammenhæng mellem PLK1 og Ki67 farvning. Derfor PLK1, selvom vigtigt i celle cyklus regulering, er ikke blot et surrogat for celleproliferation.

Vores resultater er i overensstemmelse med observationer fra cellelinje studier, hvor genindsættelse af PLK1 aktivitet er afgørende i nyttiggørelse fra G2 /M checkpoint standsning efter DNA beskadigelse. Sidstnævnte hæmmer PLK1 hvilket normalt forudsætter fosforylering i sin aktivering loop threonin 210 af Bora i sortering med opstrømskinase. Threonin 210 phosphorylering af PLK1 toppe med den normale ophobning af Bora i G2 fase. PLK1 aktiverer efterfølgende downstream mål og celler fremskridt gennem mitose [20]. Fortsat PLK1 inaktivering resulterer i forsinket indgang til mitose. Derimod overekspression af konstitutivt phosphoryleret PLK1 underkender DNA beskadigelse induceret G2 /M checkpoint standsning [2,21,22]. Dette er vigtigt i rektal kræft som stråling inducerer dobbeltstrengede DNA-brud. Kemoterapeutiske stoffer, der anvendes i endetarmskræft, enten samtidige med stråling eller i adjuverende omfatter 5-fluorpyrimidin, som er en anti-metabolit, og oxaliplatin som er et alkylerende middel, der forårsager tværbindinger i DNA.

Aktuel terapeutisk behandling af endetarmskræft kan forbedres ved tilgængeligheden af ​​bedre prædiktiv og prognostiske biomarkører. Carcinoembryonalt antigen (CEA) er i øjeblikket den eneste biomarkør i National Comprehensive Cancer Network (NCCN) retningslinjer, som en del af baseline iscenesættelse og i den efterfølgende overvågning af behandlingen. I metastasebehandling,

K-ras

er en prædiktiv markør for respons på EGFR-hæmmere [23]. Vores resultater antyder, at PLK1 er en potentielt nyttig prognostisk biomarkør i rektale kræftpatienter. PLK1 inhibition betragtes i øjeblikket som en lovende anticancer terapeutisk middel. Den PLK1 inhibitor Volasertib (BI6727) har afsluttet fase II klinisk studie for at bestemme sin anti-maligne og sikkerhedsprofil [24,25]. Andre PLK1 inhibitorer i udvikling omfatter BI2536 (Axon), som, hvis leveret før eller efter stråling, kan henholdsvis resultere i enten øget celledød under mitosestandsning eller øget celle opsving efter DNA-reparation under G2 checkpoint anholdelse [13]. Yderligere prospektive undersøgelser validering af kliniske anvendelighed af PLK1, som påvist her, i rektal management kræft er nødvendig for at styrke vores resultater og omsætte dem til klinisk brug.

Støtte Information

S1 Fig. . Effekt af adjuverende kemoterapi stratificeret af vaskulær invasion status over tid, HR = hazard ratio

doi: 10,1371 /journal.pone.0129313.s001

(TIF)

S1 Table. Datasættet viser 286 patienter, herunder deres diskrete gennemsnitlige PLK1 scores, Ki67 værdier, klinisk-patologiske variabler og overlevelse resultater

doi:. 10,1371 /journal.pone.0129313.s002

(XLS)