PLoS ONE: høj forekomst af mucosa-associeret E. coli Produktion Cyclomodulin og Genotoxin i Colon Cancer

Abstrakt

Nogle

Escherichia coli

stammer producerer toksiner, der er udpeget cyclomodulins (CMS), der interfererer med den eukaryote celle cyklus af værtsceller, hvilket tyder på en mulig forbindelse mellem disse bakterier og kræft. Der er relativt få tilgængelige data om kolonisering af kolon tumorer ved cyclomodulin- og genotoksisk-producerende

E. coli

. Vi gjorde en kvalitativ og fylogenetisk analyse af slimhinde-associerede

E. coli

huser cyclomodulin gener fra 38 patienter med kolorektal cancer (CRC) og 31 med diverticulosis. Funktionaliteten af ​​disse gener blev undersøgt på cellekulturer og genotoksisk aktivitet af stammer som mangler kendte CM-kodende gen blev undersøgt. Resultaterne viste en højere forekomst af B2 phylogroup

E. coli

huser colibatin-producerende gener i biopsier af patienter med CRC (55,3%) end i de af patienter med diverticulosis (19,3%), (p 0,01). Ligeledes en højere forekomst af B2

E. coli

huser CNF1-kodende gener i biopsier af patienter med CRC (39,5%) end i de af patienter med diverticulosis (12,9%), (p = 0,01). Funktionel analyse afslørede, at størstedelen af ​​disse gener var funktionelle. Analyse af evnen af ​​

E. coli

at overholde intestinale epitelceller Int-407 angivet, at stærkt vedhæftende

E. coli

stammer hovedsagelig tilhørte A og D phylogroups, uanset oprindelsen af ​​de stammer (CRC eller diverticulosis), og at de fleste

E. coli

stammer tilhørende B2 phylogroup vises meget lave niveauer af adhæsion. Derudover, 27,6% (n = 21/76)

E. coli

stammer blottet for kendte cyclomodulin gener induceret DNA-skader

in vitro

, som vurderet af kometen assay. I modsætning til cyclomodulin-producerende

E. coli

, disse stammer hovedsageligt tilhørte A eller D

E. coli

phylogroups, og udviste en ikke signifikant forskel i fordelingen af ​​CRC og divertikulose prøver (22%

versus

32,5%, p = 0,91). Afslutningsvis cyclomodulin-producerende

E. coli

tilhører meste til B2 phylogroup kolonisere colon mucosa af patienter med CRC

Henvisning:. Buc E, Dubois D, Sauvanet P, Raisch J, Delmas J, Darfeuille-Michaud A, et al. (2013) høj forekomst af mucosa-associeret

E. coli

Produktion Cyclomodulin og Genotoxin i tyktarmskræft. PLoS ONE 8 (2): e56964. doi: 10,1371 /journal.pone.0056964

Redaktør: John R. Battista, Louisiana State University og A M College, USA

Modtaget: 12. maj 2012; Accepteret: 18 januar 2013; Publiceret: 14 feb 2013

Copyright: © 2013 Buc et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministère Français de l’Education nationale, de la Recherche et de la Technologie, l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm U1071), l’Institut national de la Recherche Agronomique (USC-2018) og la Ligue contre le cancer. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er i dag den tredje mest almindelige kræftform hos mænd og kvinder, og den fjerde hyppigste årsag til kræft død på verdensplan, med 1,2 millioner estimerede tilfælde og 609,000 estimerede dødsfald om året [1]. Sporadiske CRC tegner sig for omkring 95% af kolorektal sager [2]. Genetiske faktorer er normalt menes at tegne sig for omkring 20% ​​af kræft årsagssammenhæng med miljø bidrager de resterende 80% risiko [3]. CRC er derfor stærkt forbundet med miljøeksponeringer herunder bakterier, der bidrager væsentligt til colon miljø. Beviser har akkumuleret viser, at sammensætningen af ​​human intestinal mikrobiota påvirker værtens sundhedstilstand. Mikrobiel dysbiosis observeres i CRC patienter og tegn på bakterielle interaktioner i CRC er blevet rapporteret for

Streptococcus bovis

,

Enterococcus spp.

,

Helicobacter pylori

,

Bacteroides fragilis

og

Escherichia coli

(for gennemgang se [4]). Forskellige undersøgelser viser klart en sammenhæng mellem mucosalt klæbende

E. coli

og CRC. Studier af kræftpatienter i Storbritannien og Tyskland viste, at mucosa-associeret

E. coli

er hyppigere identificeret i tyktarmen væv fra patienter med adenokarcinomer end for kontrol [5], [6]. Swidsinski

et al.

Rapporterede, at kun 3% af kolon mucosa biopsier fra asymptomatiske kontroller testet positive for

E.

Coli med en bakteriel universal PCR [5]. I modsætning hertil biopsier fra 92% af patienter med colon adenomer eller carcinomer nærede bakterier, med

E. coli

være fremherskende hos 70% af patienterne [5]. Tilsvarende Martin

et al.

Fandt, at 70% af CRC patienter havde mucosa-associeret bakterier, og at en betydelig del af bakterier tilhørte

E. coli

arter. Interessant, viste Bronowski

et al. Hoteller, som nogle

E. coli

stammer bære virulensgener tidligere kategoriseret som specifikke for uropatogen

E. coli

(UPEC) [7]. En sådan

E. coli

stammer kan udløse celleproliferation i tarmkanalen [8], som set med andre bakterier [9], [10].

E. coli

er de fremherskende aero-anaerobe Gram-negative arter af den normale tarmflora og deltager i at fremme stabiliteten af ​​de luminale mikrobielle flora og i at opretholde normal tarm homøostase [11]. Som en kommensal,

E. coli

sameksisterer med sin pattedyrvært i god harmoni og forårsager sjældent sygdom. Men nogle stammer bærer en kombination af virulens gener, der gør dem i stand til at forårsage intestinal (InPEC, Intestinal Patogene

E. Coli

) og ekstra-tarm (coli

forventning, Ekstraintestinale Patogene

E.) infektioner (for anmeldelser se [12] – [14]). Fylogenetisk analyse har vist, at

E. coli

er sammensat af fire vigtigste fylogenetiske grupper (A, B1, B2, og D) [15], [16]. Patogene stammer tilhører hovedsageligt til grupper B2 og D, mens de fleste fecal stammer tilhører gruppe A og B1. Stammer af grupper B2 og D ofte bærer virulensfaktorer, der mangler i gruppe A og B1 stammer [17] – [19].

Blandt

E. coli

virulensfaktorer, flere giftstoffer, kaldet cyclomodulins, tiltrækker stigende opmærksomhed, fordi de er genotoksisk og /eller modulere cellulær differentiering, apoptose, og spredning (for gennemgang se [4]). Cytotoksisk nekrotiserende faktor (CNF) aktiverer Rho GTPaser, hvilket fører til cytoskelet ændringer og påvirker cellecyklussen. Cyklus-hæmmende faktor (CIF) målrette NEDD8-konjugeret Cullins at kapre vært-celle signalveje [20], [21]. Den genotoxin colibactin er en hybrid polyketid-non ribosomale peptid forbindelse [22]. Dens biosyntese maskiner er kodet af de

PKS

genomisk ø. Colibactin forårsager DNA dobbelt-strenget pauser og en kromosomal ustabilitet i humane eukaryote celler [22], [23]. Den cytoletalt distending toksin (CDT) inducerer også DNA skade sandsynligvis gennem DNAse aktivitet, og et nært beslægtet enzym produceret af

Helicobacter hepaticus

fremmer udviklingen af ​​hepatitis til at pre-maligne, dysplastiske læsioner og øger spredningen af ​​hepatocytter, giver den første bevis på, at CDT har carcinogent potentiale

in vivo

[24] – [26]

i den foreliggende undersøgelse sammenlignede vi forekomsten af ​​cyclomodulin- og genotoxin-kodende gener i slimhinden. associeret

E. coli

stammer fra resektion eksemplarer af CRC’er og diverticulosis. Vi undersøgte også genotoksisk aktivitet af mucosa-associeret

E. coli

blottet for kendte genotoxin gener og deres evne til at klæbe til epitel tarmcellerne.

Materialer og metoder

Etik Statement

Etisk godkendelse til studiet blev ydet af Clermont-Ferrand videnskabsetisk komité. Denne IRB tilladt for ophævelse af skriftligt samtykke og godkendt processen med at få verbale samtykker fra potentielle emner, fordi forskning indebærer ingen procedurer, som skriftligt samtykke normalt kræves uden for forskningen kontekst og præsenterer ingen risiko for skade på emner. De biologiske prøver blev indsamlet fra kolon resektioner, der var nødvendige til behandling af patienter. Efterforskerne forklarede undersøgelsen til den potentielle emne verbalt, give alle relevante oplysninger, såsom formål, procedurer, formodede risici. Efter denne verbale forklaring blev den potentielle emne forsynet med en undersøgelse oplysningsskema. Efter at den potentielle emne tid til at læse undersøgelsen oplysningsskemaet, investigator besvaret yderligere spørgsmål den potentielle emne kan have haft. En mundtlig aftale om at deltage i forskning blev opnået for alle patienter, der indgår i undersøgelsen. Datoerne for verbal samtykke blev sporet i en ikke-identificerbar måde.

Patienter

For at studere makroskopiske prøver fra resektion af colon prøver, vi sammenlignet patienter med CRC og patienter med diverticulosis som en non-cancer gruppe. Sixty-ni patienter blev undersøgt mellem marts 2007 og november 2009 kl universitetshospitalet i Clermont-Ferrand, Frankrig. Otteogtredive havde CRC, og 31 havde kompliceret diverticulosis (tabel S1, S2, S3). Patienter fra CRC gruppe havde ukompliceret og resektable coloncancer udvikles enten i den proximale colon (fra coecum til den hepatiske bøjning af opstigende colon) eller i den distale colon (colon sigmoideum). CRC af den tværgående eller efterkommer colon blev udelukket på grund af deres lave forekomst, og for at undgå risikoen for bias. I alle tilfælde er driften bestod i segmental resektion af den berørte af tumoren med øjeblikkelig anastomose uden aflede stomi kolon. Patienter med kompliceret CRC (obstruktion, perforation eller infektion), blev udelukket fra undersøgelsen. Patienter fra diverticulosis gruppe havde diverticulosis involverer sigmoid tyktarmen og krævede operation på grund af en historie af komplikation (tilbagevendende diverticulitis, abcess, peritonitis). Vi ekskluderede patienter med akut eller kronisk inflammation på tidspunktet for kirurgi, og dem med stenose. I tilfælde af et angreb for nylig af diverticulitis, blev antibiotika stoppes mindst 3 uger før operation. Sex forholdet var 1,05 og 0,72 for CRC og DIV patienterne. Aldersgruppen var 35-95 år for kræftpatienter (median alder, 71 år og gennemsnitsalderen, 67 år) og 34-81 år for diverticulosis patienter (median alder, 58 år og gennemsnitsalderen, 60 år). Prøver blev taget på reseceret kolon, på stedet for maligne tumorer for CRC patienter og er i normal slimhinde for diverticulosis patienter. Patologisk analyse bekræftede de neoplastiske funktioner i prøverne i CRC patienter, og manglen på betændelse eller dysplasi i diverticulosis patienter. CRC serien omfattede 21 proximale og distale 17 kolon prøver. TNM fase er anført i tabel S1 og S2. Tarm præparat var ved oral natriumpicosulfat eller oral polyethylenglycol aftenen før operation. Alle resektion patienter havde fået cefoxitin (2 g intravenøst) på tidspunktet for indsnit og ingen havde fået antibiotika i de 4 uger før prøveudtagningen.

Sample behandling

mucosale prøver blev anbragt i 10 ml sterilt phosphatbufret saltvand, pH 7,4 (PBS) og transporteret på is til laboratoriet. Prøverne blev vejet (50 til 100 mg hver) og vasket grundigt tre gange i 10 ml PBS for at fjerne de fleste af de fækale bakterier. Hvert vasketrin blev fulgt af centrifugering ved 900 g i 5 minutter. Prøverne blev derefter knust (Ultra-Turrax, IKA) og inkuberet i 15 minutter på et rør rotator ved stuetemperatur i nærvær af Triton 0,1 x. Tifold fortyndinger af lysatet blev derefter udsået på Drigalski agar og kromogent agar chromID CPS3® (bioMérieux), der gør det muligt at identificere

E. coli

.

E. coli

kolonier blev opsamlet efter 24 timers inkubation ved 37 ° C, og identifikation af bakterier blev bekræftet med den automatiserede Vitek II® (bioMérieux) system. Når det er muligt maksimalt 96

E. coli

kolonier pr prøve blev indsamlet for molekylær typning. Bakterierne blev videredyrket i 24 timer ved 37 ° C i plader med 96 brønde i Luria Bertani-medium, suppleret med 15% glycerol og derefter opbevaret ved -80 ° C.

Molekylær typning og fylogenetiske gruppering

Ti kolonier pr prøve blev indtastet med molekylære metoder til at identificere den

E. coli

stammer (

E. coli

genotyper) koloniserer prøverne. To genotypebestemmelsesmetoder blev anvendt, en “enterobakterielle Repetitive intergenisk konsensus” sekvens (ERIC) -PCR anvendelse af primer ERIC2 (5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3 ‘) og en “Random Amplified Polymorf DNA” (RAPD) – PCR under anvendelse af primer 1283 (5’-GCG ATC CCC A-3 ‘) [27], [28]. En repræsentativ stamme blev efterfølgende analyseret og opbevaret ved -80 ° C i Luria-Bertani-medium suppleret med 15% glycerol.

E. coli

stammer blev derefter klassificeret i henhold til den

E. coli

Referenceeksempel Collection (ECOR) systemet [16] i fylogenetiske grupper A, B1, B2 og D under anvendelse af en multiplex-PCR-teknik [29]. Stamme RS218, som huser alle generne er mål for multiplex-PCR, blev anvendt som positiv kontrol.

Påvisning og identifikation af cyclomodulin-producerende gener

Cyclomodulin gener blev påvist ved dot-blot DNA hybridisering eksperimenter i alle

E. coli

stammer. Proberne blev opnået ved PCR som tidligere beskrevet [30] (tabel S4 og S5) ved anvendelse af PCR DIG probe syntese kit (Roche Applied Sciences, Switserland) ifølge producentens instruktioner. To mikrogram DNA-prøver blev fastgjort på positivt ladede nylonmembraner ved UV-belysning i 20 min. Hybridisering blev udført med Roche mærkning og påvisning kit (Roche Applied Sciences) som angivet af fabrikanten. Hver plet blev kontrolleret med en 16S rRNA-genet probe.

pks

ø, som indeholder den colibactin-producerende gen-klynge, blev screenet med en probe overlapper de

clbK

og

clbJ

gener.

CNF

gener blev påvist med en blanding af sonder specifikke for

cnf1

,

cnf2

, og

cnf3

.

cdtB

gener blev opdaget af to hybridisering eksperimenter med

cdtB-II-cdtB-III-cdtBV

cdtB-I-cdtB-IV

probe blandinger.

cif

genet blev opdaget ved hjælp af en intern specifik probe. De følsomheder og særlige forhold sonderne blev kontrolleret på hver membran ved spotting DNA ekstrakter af alle cylomodulin kontrol stammer. Positive hybridiseringer med en cyclomodulin probe blev underkastet bekræftende PCR-assays som tidligere beskrevet [30]. Reaktionsblandingen indeholdt 50 ng DNA-prøve, 0,2 mM hver deoxynucleosidtriphosphat (dNTP), 0,4 uM hver primer, 3 mM MgCl2, og 1,0 U RedGoldStar DNA-polymerase (Eurogentec, Belgien) i den tilsvarende reaktionspuffer. Primere placeret i 5′- og 3′-regioner af PKS øen (de clbA og clbQ gener) blev anvendt til at bekræfte den fulde tilstedeværelse af colibactin-producerende ø.

Cytopatiske assays

HeLa celler (afledt af livmoderhalskræft) købt fra ATCC (ATCC @ CCL-2

TM) blev holdt i en atmosfære indeholdende 5% CO2 ved 37 ° C i passende medium. Cellerne blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% (vol /vol) føtalt kalveserum (Lonza, Walkersville, MD USA), 1% L-glutamin (Life-Technologies), 200 U penicillin, 50 mg streptomycin, 0,25 mg af amphoterocin B per liter, og 1% HEPES bufret saltvandsopløsning (Lonza). De blev podet i 96-brønds vævskulturplader ved 5 × 10

4 celler /brønd i 24 H. De cytopatiske virkninger af CNF og CDT’er blev undersøgt i alle stammer fra celle-lysat, som tidligere beskrevet [31]. Kort beskrevet blev virkningerne af CDT og CNF detekteres af en celle-lysat-interagerende test. Efter 48 H dyrkning ved 37 ° C under omrystning i Luria-Bertani-bouillon medium, blev bakterieceller sonikeret og sterilt filtreret separat under anvendelse af 0,22-um-pore-size filtre. HeLa-celler blev behandlet med de sterile sonikerede lysater (endelig proteinkoncentration: 4 pg /ml), indtil analyse. Virkningerne af colibactin og Cif blev påvist ved en celle-bakterie-interagerende test, baseret på interaktionen mellem HeLa-celler og bakterier. Overnight Luria-Bertani bouillon kulturer af

E. coli

blev vasket tre gange og fortyndet i interaktion medium. HeLa-cellekulturer blev inficeret ved infektionsmultipliciteter (MOI, antal bakterier per celle ved indtræden af ​​infektion) af 100 og 200. Cellerne blev vasket 4 timer efter inokulering og inkuberet i celledyrkningsmedium med 200 ug /ml gentamicin indtil analyse . Efter 72 timers inkubation ved 37 ° C under en 5% CO2 atmosfære blev mediet fjernet ved tre vaskninger med HeLa cellemonolag. blev observeret morfologiske ændringer karakteristiske for CDT, CNF, colibactin, og Cif efter farvning med Giemsa farve. Identifikation var baseret på evnen af ​​enten bakterielysat indeholdende CNF og CDT eller hele levende bakterier producerer colibatin og CIF at inducere en cytopatisk virkning på epitelceller analyseret ved 3-dage efter infektion. Colibactin, CDT og CIF inducerede cytopatiske virkninger, som det fremgår af forstørrede kerner og celle distension (megalocytosis), mens CNF induceret multinukleation, og udvidelse af HeLa-celler. Multinukleation observeres i 50% af celler inficeret med CNF-producerende bakterier og i omkring 10% af ikke-inficerede celler eller celler inficeret med andre CM-producerende stammer. For CNF og CDT, den cytopatiske virkning er kun iagttages med bakterielysater. I modsætning hertil for colibactin og CIF, kontakt mellem bakterier og værtsceller er påkrævet. Påvisningen af ​​alfa-hæmolysin blev udført for alle stammer undersøgt af vækst natten over ved 37 ° C på Columbia fåreblod (5%) agar (Oxoid, Dardilly, Frankrig).

E. coli

25922 (ATCC) blev anvendt som reference stamme til alfa-hæmolysin produktion.

Single-celle gelelektroforese

genotoksisk aktivitet af

E. coli

stammer blottet for kendte CM-kodende gener blev undersøgt ved anvendelse af enkelt-celle-gelelektroforese (comet assay). HeLa cellekulturer blev inficeret ved MOI på 500 med

E. coli

dyrket natten over i Luria-Bertani-bouillon. Cellerne blev vasket to gange 3H efter inokulering og blev inkuberet natten over i cellekulturmedium med 200 ug /ml gentamicin ved 37 ° C under en CO 5%

2 atmosfære. De blev derefter vasket med PBS-medium og kombineres med 0,5% lav-smeltepunkt agarose (Bio-Rad, Marnes La Coquette, Frankrig) opløses i sterilt PBS ved 37 ° C. Celle-agarose blanding blev påført på et objektglas belagt med 1,5% normalt smeltepunkt agarose (Molecular Biology Grade, Bio-Rad) opløst i sterilt PBS ved 37 ° C. En dækglas blev påført og fik lov at størkne ved 4 ° C i 60 minutter. Objektglas blev derefter anbragt i 50 ml lysepuffer (10 mM Tris-HCl, 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA indeholdende 1% Triton X-100, 10% DMSO, pH 10) i 2 timer ved 4 ° C i mørke. Objektglas blev neddykket i elektroforese buffer (1 mM EDTA 300 mM NaOH pH 13) i 1 time ved 4 ° C og et elektrisk felt blev påført (1 V /cm) i 40 minutter. Objektglassene blev neutraliseret med 400 mM Tris-HCI pH 7,5 og tørres. 40 pi af en 1: 10.000 fortynding af SybrGreen blev påført direkte på objektglasset. Individuelle celler eller kometer blev set af Zeiss Axioplan2 fluorescens mikroskop. B2

E. coli

stammen IHE3034 og

E. coli

DH10β pBACpks blev anvendt som positive kontroller [22]. B2

E. coli

stammen IHE3034 Δ

clbP

og

E. coli

DH10β pBAC blev anvendt som negative kontroller [22].

Vedhæftning assay

Int-407 celler (afledt af human tarm embryonale jejunum og ileum) købt fra ATCC (ATCC ® CCL -6

TM) blev holdt i en atmosfære indeholdende 5% CO2 ved 37 ° C i passende medium. De blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% (vol /vol) føtalt kalveserum (Lonza, Walkersville, MD USA), 1% L-glutamin (Life-Technologies), 200 U penicillin, 50 mg streptomycin, 0,25 mg amphoterocin B per liter, og 1% HEPES bufret saltvandsopløsning (Lonza). Kort fortalt blev cellerne podet ved en tæthed på 2 x 10

5 celler /cm2 i dyrkningsplader i 48 H. Infektionen blev udført ved en infektionsmultiplicitet på 10 bakterier per celle. Inficerede celler blev centrifugeret ved 900 g i 10 minutter ved 25 C og anbragt ved 37 ° C i 3 H. Celler blev vasket tre gange i phosphatbufret saltvand (PBS; pH 7,2). Epitelcellerne blev derefter lyseret med 1% Triton X-100 (Sigma) i deioniseret vand. Prøver blev fortyndet og udpladet på Luria-Bertani (LB) agarplader for at bestemme antallet af CFU svarende til det samlede antal celleassocierede bakterier. Stammer

E. coli

K12 og

E. coli

LF82 blev anvendt som negative og positive kontroller henholdsvis [32]. Resultaterne er udtrykt som antallet af adhærente bakterier per celle efter en 3 H infektion periode.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af Fisher eksakt og chi-square tests. For flere gruppe sammenligninger, blev en indledende chi-square test for heterogenitet gjort, og kun hvis dette gav en P-værdi på 0,05 var de enkelte parvise sammenligninger testet

Resultater

E. coli

stammer i tyktarmskræft og diverticulosis prøver

Analysen af ​​

E. coli

stammer viste, at antallet af prøver uden

E. coli

var signifikant højere i diverticulosis patienter (19,4%, n = 6/31) end hos dem med CRC (2,6%, n = 1/38), p = 0,04 (tabel 1). Mange colon prøver nærede kun én

E. coli

genotype. Dette blev observeret hos 42,1% (n = 16/38) af CRC prøver og i kun 25,8% (n = 8/31) af diverticulosis men forskellen var ikke signifikant (p = 0,12). De fleste stammer isoleret fra CRC tilhørte B2 phylogroup (73,7%, n = 28/38) i modsætning til dem isoleret fra diverticulosis (41,9%, n = 13/31), s 0,01 (tabel 2). Ingen signifikant forskel i

E. coli

phylogroup fordeling blev observeret, herunder til B2

E. coli

stammer isoleret fra proximal (82,4%, n = 14/17) og distale colontumorer (66,7%, n = 14/21), p = 0,23 (tabel 2). Samlet

E. coli

stammer tilhørende de B2 phylogroup koloniserede kolon tumorer oftere end de gjorde diverticulosis prøver.

Fordeling af CM-kodende gener i henhold til

E. coli

fylogenetiske grupper

Fordelingen af ​​CM-koder gener i

E. coli

stammer er vist i tabel 3 og tabel S1, S2, S3. Den hyppigste træk var colibactin-kodning

pks

ø (80% af CM-producerende

E. Coli

, n = 28/35 og 24,1% af den samlede

E. Coli Salg stammer, n = 28/116). Alle stammer forbundet med colon mucosa af patienter med CRC eller diverticulosis huser colibactin-kodning

pks

ø tilhørte phylogroup B2 (p 0,001 for gruppe B2

versus

grupperne A, B1 og D, individuel eller kombineret). Desuden 16,4% (n = 19/116) af stammer besad

CNF

gen; af disse var kun én

cnf2

-positiv og ingen var

cnf3

-positiv, hvilket indikerer, at disse stammer var ikke af animalsk oprindelse [33], [34]. Alle

cnf1

-harboring stammer tilhørte også phylogroup B2, og tegnede sig for 36,7% (n = 18/49) af stammer af denne phylogroup. Som for

pks

ø, foreningen

cnf1

med phylogroup B2 var stærk (p 0,001 for gruppe B2

versus

grupperne A, B1 og D, individuelle eller kombinerede ), og 33% (n = 16/49) af B2 stammer besad både

pks

øen og

cnf1

gen (p 0,001 for gruppe B2 versus grupperne A, B1 og D , individuel eller kombineret), som tidligere observeret [30], [35]. Alle undtagen tre stammer huser

cnf1

gen udstillet alfa-hæmolytiske fænotype. Men de tre ikke-hæmolytisk

cnf1

-positive stammer nærede den

hlyC

gen.

cdtB

gener blev observeret i seks stammer. Selvom fire ud af seks

CDT

-positive stammer tilhørte phylogroup B2, blev ikke signifikant sammenhæng med en bestemt phylogenetisk gruppe observeret, selv med de forskellige

cdtB

gen undertyper.

cdtB-I-service /

cdtB-IV

gener (n = 5) blev observeret hyppigere end for

cdtB-II-cdtB-III-cdtBV

gen gruppe (n = 1). Det eneste

CDT-III

-positiv belastning nærede også

cnf2

gen, en kombination af gener ofte rapporteret i pVir plasmidet og hovedsagelig set i stammer fra kvæg [36], [37 ].

cdtB

gener viste ingen særlig tilknytning til colibactin-kodning

pks

ø eller

cnf1

gen. Da

CDT

gener er blevet grundigt undersøgt i Shiga toksin-producerende

E. coli

(STEC) stammer [38] – [40], blev det besluttet at undersøge

cdtB

-positiv stammer for

stx

EAE

gener. Nej

stx

eller

EAE

genet blev påvist i

cdtB

-positive stammer.

cif

genet blev påvist i tre stammer, der tilhørte phylogroups A (n = 1) og B1 (n = 2) og nærede ingen andre CM-koder gener. CIF er en effektor af typen 3 sekretion der kodes ved locus af enterocytterne udslettelse (LEE) observeret i enteropatogen

E. coli

(EPEC) og enterohæmoragisk

E. coli

(EHEC) [41], [42] og de tre positive stammer i denne undersøgelse havde den

EAE

gen, men hverken

stx1

eller

stx2

gener , og derfor tilhørte EPEC patotype.

Fænotypisk påvisning af cyclomodulins

Cell-lysat-interagerende tests blev anvendt til at undersøge CNF og CDT produktion i alle stammer. Detekteringen af ​​colibactin og CIF produktion, som kræver celle-bakterie-interagerende tests, var kun mulig i de ikke-hæmolytiske stammer, fordi hæmolysinet-producerende stammer, i modsætning til de tilsvarende lysater, inducerede hurtig celledød. Resultaterne er anført i tabel S1, S2, S3. Colibactin, CDT og CIF inducerede cytopatiske virkninger, som det fremgår af forstørrede kerner og celle distension (megalocytosis), mens CNF induceret multinukleation i ≥50% af celler og udvidelse af HeLa-celler (figur 1). For CNF og CDT, den cytopatiske virkning var kun iagttages med bakterielysater, hvorimod en kontakt mellem bakterier og værtsceller var nødvendig for colibactin og CIF, som tidligere rapporteret (figur 1) [22], [31], [42]. Observationen af ​​en cytopatisk virkning var forbundet med tilstedeværelsen af ​​CM-kodende gener. Tre stammer huser en

pks

ø isoleret fra diverticulosis, distal og proksimale colon prøver inducerede ikke nogen cytopatisk effekt. En stamme, isoleret fra en diverticulosis prøve havde en ikke-funktionel

cnf1

gen og to

CDT

-positive stammer viste ingen cytopatisk effekt. For stamme, der huser

cnf2

og

CDT

-III gener, 50% celle multinukleation attesteret til produktion af CNF og den brede megalocytosis tilskrevet CNF produktion eller dens kombination med CDT-III . En cytopatisk effekt blev observeret for stammerne huser

cif

gen. Samlet set de fleste CM-koder gener var funktionelle, især

CNF

cif Hotel (93% og 100%, henholdsvis).

For CNF og CDT, den cytopatiske effekt kan kun iagttages med bakterielysater. I modsætning hertil for colibactin og CIF, en kontakt mellem bakterier og værtsceller er påkrævet. Colibactin, CDT og CIF inducerede cytopatiske effekter, som set af forstørrede kerner og celle udspiling (megalocytosis), mens CNF induceret multinukleation og udvidelse af HeLa-celler.

Fordeling af CM-kodende gener i henhold til modellen oprindelse og phylogroupe

resultaterne er vist i tabel 4, figur 2 og tabel S1, S2, S3. Femogtyve CRC prøver blandt 38 (65,8%) indeholdt CM-positive

E. coli

og kun 6 diverticulosis prøver blandt 31 (19,4%), hvilket indikerer, at CM-huser stammer fortrinsvis var forbundet med CRC (p 0,01). Denne forskel var forbundet med et stort antal CM-positive B2

E. coli

i CRC prøver sammenlignet med observationerne i diverticulosis prøver (Figur 2). Følgelig stammer, der huser colibactin-kodende

PKS

ø var til stede i 55,3% af CRC prøver (n = 21/38), og kun i 19,3% af diverticulosis prøver (n = 6/31), hvilket indikerer, at

PKS

positive stammer var signifikant (p 0,01) mere udbredt i CRC. I mindre grad,

CNF

CDT

positiv

E. coli

var signifikant (p≤0.02) mere udbredt i CRC end i diverticulosis prøverne. Disse forskelle var primært på grund af den høje forekomst af

pks

-,

CNF

– og

CDT

-positiv

E. coli

i distale CRC prøver sammenlignet med den i diverticulosis prøver (p≤0.01). Tilsammen indikerer disse resultater, at CM-positive

E. coli

fordeling varierer efter specimen oprindelse.

A,

E. coli

stammer (n = 70) isoleret fra CRC prøver (n = 38), og B,

E. coli

stammer (n = 46) isoleret fra diverticulosis prøver (n = 31).

Genotoksicitet af

E. coli

blottet for CM-gener

Vi undersøgte, om

E. coli

blottet for kendte CM-kodende gener kan inducere DNA-beskadigelse i værtsceller. Brug HeLa dyrkede celler, blev genotoksicitet af stammer undersøgt ved en enkelt-celle gelelektroforese assay (eller komet assay), state-of-the-art teknik til påvisning af DNA-skader forårsaget af kemiske genotoxins. I alt 76 kliniske

E. coli

stammer blev undersøgt; 15 stammede fra proximal coloncancer, 21 fra den distale colon cancer og 40 fra diverticulosis. Disse stammer tilhørte A (n = 29), D (n = 21) og B2 (n = 17) phylogroups. Interessant, 27,6% (n = 21/76) af

E. coli

stammer blottet for kendte CM-kodende gener inducerede dannelsen af ​​kometer, som er typiske for værtscelle-DNA beskadigelse (figur 3 og tabel S1, S2, S3). Endvidere i modsætning til CM-producerende

E. coli

stammer, der hører primært til B2 phylogroup disse komet positive stammer tilhørte hovedsageligt til A (52%, n = 11/21) og D (29%, n = 6/21) phylogroups. Kometer blev observeret med 13 stammer (32,5%) blandt 40 isoleret fra patienter med diverticulosis, og med 8 stammer (22%) blandt 36 patienter med CRC. Fordelingen af ​​disse formodede genotoksiske stammer i prøverne var derfor forskellig fra CM-koder stammer.

DNA-skader blev ikke påvist i HeLa celler inficeret med

E.