PLoS ONE: Dll4-Notch Signalering Blokade synergistisk Kombineret Ultralyd-stimuleret Mikroboble og strålebehandling i Human Colon Cancer Xenografts

Abstrakt

Tumor vaskulatur fungerer som en vigtig livline for tumor progression og letter metastatisk spredning. Novel vaskulær målretning strategier for at opretholde vaskulær nedlukning potentielt kunne fremkalde betydelig skade, hvilket resulterer i en betydelig forsinkelse tumorvækst. Vi undersøgte kombinationen af ​​to hidtil ukendte komplementære vaskulære målrettede midler med strålebehandling i en strategi, der sigter til at opretholde vaskulær forstyrrelse. Eksperimenter blev udført med delta-lignende ligand 4 (Dll4) blokade (angiogenese deregulator) behandling administreres i kombination med en stråling-baserede vaskulære ødelæggelse behandling i en særdeles aggressiv godt perfuseret tyktarmskræft tumorlinje implanteres hos kvindelige athymiske nøgne mus. Tumorer blev behandlet med permutationer for stråling, ultralyd-stimuleret mikrobobler (USMB), og Dll4 monoklonalt antistof (mAb). Tumor vaskulær respons blev vurderet med tredimensionel effekt Doppler ultralyd til at måle aktive flow og immunhistokemi. Tumorresponsen blev vurderet med histokemiske assays og langsgående målinger af tumorvolumen. Vores resultater tyder på en betydelig tumorrespons hos dyr behandlet med USMB kombineret med stråling, og Dll4 mAb, hvilket fører til en synergistisk tumorvækst forsinkelse på op til 24 dag. Dette er sandsynligvis knyttet til hurtig celledød i tumoren og en vedvarende tumorvaskulær nedlukning. Vi konkluderer, at den tredobbelte kombinationsbehandlinger forårsage en vaskulær nedlukning efterfulgt af en vedvarende hæmning af angiogenese og tumor celledød, hvilket fører til en hurtig tumor vaskulær-baserede “sammenbrud”, og en væsentlig forsinkelse tumorvækst

Henvisning:. El Kaffas A, Nofiele J, Giles A, Cho S, Liu SK, Czarnota GJ (2014) Dll4-Notch Signalering blokade synergistisk kombineret Ultralyd-stimuleret Mikroboble og strålebehandling i human Colon Cancer Xenografter. PLoS ONE 9 (4): e93888. doi: 10,1371 /journal.pone.0093888

Redaktør: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, USA

Modtaget: August 7, 2013; Accepteret: 10 marts 2014; Udgivet 15. april, 2014

Copyright: © 2014 El Kaffas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Terry Fox Foundation gennem et program projekt tilskud “Ultrasound for Cancer Therapy”. Dr. Gregory Czarnota er en kliniker-videnskabsmand og er støttet af en CCO Research Chair i Experimental Therapeutics og Imaging. Dr. Stanley Liu er en kliniker-videnskabsmand og understøttes af en OICR (Ontario Institute of Cancer Research) tidligt investigator award og anerkender støtte fra PCC (prostatakræft Canada). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Song Cho er ansat af MedImmune. Dette ændrer ikke tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Tumorer kræver aktivering af en angiogen ‘switch’ til at vokse ud over 1-2 mm

3 i volumen. Vaskulær udvikling i tumorer forekommer via frigivelsen af ​​forskellige endothelial vækstfaktorer og angiogenese regulatorer (dvs. vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF), delta-lignende ligand 4 (Dll4)), hvilket fører til neo-vaskularisering overvejende via en spirende proces, der minder om embryonale udvikling [1] – [3]. Nydannede skibe giver en livline af næringsstoffer og ilt til at tillade yderligere vækst tumor. Anti-angiogenese lægemidler, der oprindeligt designet til at blokere for udviklingen af ​​tumorvaskulatur, er blevet vigtige behandlinger mod kræft. I nogen tid, tjente farmakologiske anti-VEGF agenter vigtigt terræn i at målrette angiogenese, men viste sig at være mindre effektiv end oprindeligt forventet på grund af tumor resistensmekanismer [4], [5]. Men disse midler blev vist, at være nyttige, når strategisk kombineres med andre anti-cancer terapier [6]. I øjeblikket er farmakologiske midler målrettet forskellige aspekter af tumor angiogenese udvikles og undersøges i samarbejde med forskellige eksisterende terapeutiske modaliteter.

En række fysiologiske og biologiske faktorer stimulerer tumor vaskulær udvikling (dvs. hypoxi). Disse stimuli fungerer som eksterne køer til angiogen (dvs. VEGF, Dll4) molekylær signalering. Den Notch vej er blevet påvist at regulere spiring af nye skibe i tumorer [7], [8]. Den Notch ligand Dll4 viste sig at give kritisk nedstrøms regulerende signalering for at indlede VEGF stimuli [9], [10]. Denne vej er blevet identificeret som et lovende nyt mål kræftbehandling [9]. Undersøgelser har vist, at hæmme Dll4 signalering resulterer i overdreven, men ikke-funktionelle angiogenese i tumorvæv [11], [12]. Desuden Dll4 blokade bevirker en betydelig tumorvækstforsinkelse i forskellige tumorcellelinjer [11], [12]. Undersøgelser har også vist potentiale Dll4 blokade i kombination med andre cancerterapier [8], [11] – [15]. En nylig undersøgelse observeret synergistisk forøgelse af forsinkelse af tumorvækst, når en neutraliserende Dll4 monoklonalt antistof (mAb) blev kombineret med strålebehandling [15].

Ved siden af ​​de mange farmakologiske midler, der er udviklet til at målrette angiogenese, nye biofysisk vaskulær målrettede midler, herunder ultralyd-stimulerede mikrobobler og guld nanopartikler, er også blevet påvist at øge konventionel kræftbehandling virkning [16] – [19]. Disse er blevet foreslået at bevirke en hurtig indtræden af ​​tumorvaskulær nedlukning og /eller forøget karvæg permeabilitet, der handler til strategisk forbedre effektiviteten af ​​alle cancerpatienter lægemidler eller strålebehandling. . For nylig Czarnota

et al

[19] – [23] viste, at ultralyd-stimulerede mikrobobler (USMB) forøger tumorcelledød i prostata, blære og brystkræft cellelinier. De postulerede, at forøgelse af stråling reaktion var knyttet til den biofysiske membran beskadigelse af tumor endotelceller forbundet med mikroboble stimulation, efterfølgende fører til ceramid signalering og en vaskulær nedlukning på grund af endothelial celledød [22]. Observationerne er potentielt forbundet med for nylig rapporteret,

asmase

-afhængig, akut endotel apoptose efter enkeltdoser store doser af stråling [2], [24], [25].

I dette arbejde, vi har undersøgt Dll4-blokade efter kombineret ultralyd-mikrobobler og stråling-baserede vaskulær ødelæggelse i en meget aggressiv og godt perfunderet tyktarmskræft linje. Tumorer dyrkedes i bagbenet af mus og behandlet med permutationer af stråling, USMB og Dll4 monoklonalt antistof (mAb). Dyrene blev filmede med tredimensionel effekt Doppler ultralyd til at undersøge ændringer i tumor perfusion (blodgennemstrømning) med behandling.

Tre-dimensionel højfrekvente power Doppler ultralyd er en ideel imaging modalitet til den prækliniske vurdering af tumorvaskulatur i dyremodeller [26] – [28]. Det giver høj opløsning strukturel information og forbedret detektion Doppler flow signal. Desuden sin facile brug gør den velegnet til longitudinelle studier, hvor der kan vurderes relative ændringer i karsystemet. Doppler resultater blev suppleret med vaskulære densiteter bestemt ud fra CD31-farvning af tumor tværsnit. Tumor reaktion på Dll4 mAb, ultralyd-mikrobobler og strålebehandling kombinationsbehandling blev ligeledes vurderet med målinger af immunohistokemi og tumor vækst assays.

Resultaterne indikerer, at Dll4 blokade efterfulgt af USMB og strålebehandling frembringer en synergistisk tumorvækstforsinkelse større end når strålingen er kombineret med Dll4 mAb alene. Disse resultater antyder også, at USMB og stråling handle akut at lukke tumorvaskulatur, som i andre typer af tumorer, men at på grund af den aggressive natur af tyktarmskræft cellelinien, en hurtig tumor rebound følger. Behandling med Dll4 mAb deregulerer derefter neo-vaskularisering, hvilket fører til minimalt funktionel tumorvaskulatur og en vedvarende tumor vaskulær ‘kollaps’. Kombinationen af ​​DLL4 blokade med USMB og stråling er en hidtil ukendt, meget effektiv metode til at forsinke tumorvækst gennem biologisk og biofysisk målretning af tumorvaskulaturen.

Materialer og metoder Salg

xenograft tumormodel

Alle dyreforsøg præsenteres i dette arbejde blev udført i overensstemmelse med internationalt anerkendte retningslinjerne i protokoller godkendt af Sunnybrook Research Institute institutionel dyr pleje og brug udvalg. Alle dyreforsøg blev udført under anæstesi, som er beskrevet nedenfor, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Til denne undersøgelse blev op til 90 dyr tilfældigt opdelt i 3 grupper. Dyr i kohorten 1 blev aflivet efter 24 timer blev dyrene i kohorten 2 aflivet efter 7 dage, og dyr i kohorten 3 blev holdt til vurdering af tumorvækst i op til 30 dage. For at initiere tumorvækst, LS174T (3 × 10

6) coloncancerceller (ATCC, Manassas, VA) blev injiceret subkutant i højre bagben på 6 til 7 uger gammel kvinde athymiske nøgne mus (Harlan, Indianapolis, IN). Alle tumorer voksede for 9-14 dage at nå en gennemsnitlig volumen på 200 mm

3. Et gennemsnit på 5 dyr blev anvendt per behandling betingelse for hver af de vurderingsmetoder behandling (dvs. magt Doppler, vækst forsinkelse, immunhistokemi).

Behandling Administration

Tumor-bærende dyr fik en af seks behandlinger: (1) ingen behandling (CTRL), (2) stråling (XRT), (3) Dll4 mAb, (4) XRT og Dll4 mAb, (5) ultralyd-stimulerede mikrobobler (USMB) kombineret med XRT, eller ( 6) en tredobbelt kombination af USMB, XRT og Dll4 mAb. Dyr blev bedøvet med isofluoran før billeddannelse eller til kateterindføring (da modtagende USMB behandling). Alle dyr, der modtager strålebehandling blev behandlet med en enkelt dosis på 5 Gy ioniserende stråling administreres under anvendelse af en Faxitron kabinet strålerøret (Faxitron Bioptics, Lincolnshire, IL) under anvendelse af røntgenstråler ved en energi på 160 kVp, en SSD på 35 cm og en dosishastighed på 200 cGy /minut. For strålebehandling blev liget af hvert dyr dækket med 3 mm tyk blyafskærmning, udsætter kun tumoren. Dyr, der gives Dll4 monoklonale antistof (mAb, MedImmune LLC, MD) blev indgivet mAb to gange ugentligt, startende på behandlingen efter billeddannelse, i en dosis på 5 mg /kg legemsvægt. Dyr, der modtager stråling i forbindelse med Dll4 mAb, modtog den oprindelige anti-Dll4 mAb behandling 1 time efter bestråling. Dll4 mAb behandling blev fortsat i dyr indtil aflivning (ved 24 timer eller 7 dage), eller indtil en tumor volumen nået mindst dobbelt af det oprindelige volumen. En skematisk af behandlingen levering og billeddannelse tidsplan er vist i figur S1A.

I dyr behandlet med USMB, Definity mikrobobler (perfluorpropan gas /liposom shell, Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA) blev fremstillet ved anvendelse af en Vialmixeren indretning (Lantheus Medical Imaging) og administreres gennem en halevene kateter i en koncentration på 3% volumen /volumen volumen (1,08 × 10

9 mikrobobler i 90 pi), som er ca. 300 gange den anbefalede diagnostisk billeddannelse dosis af 10 ul /kg [19]. Dyr blev derefter neddykket i et vandbad ved 37 ° C for at blive udsat for ultralyd. Behandlingen system er designet på en sådan måde, at kun den nederste del af kroppen af ​​dyret er nedsænket i vandbad, udsætter kun tumorvolumenet til ultralydfeltet ved brændpunktet af transduceren. Ultralyd terapi systemet indebar en mikro-positioneringssystem, bølgeform generator (AWG520, Tektronix, Beaverton, OR), effektforstærker med impulsgiver /modtager (RPR4000, Ritec, Rochester, NY), og en digital Acquisition System (CC103, Agilent, Monroe , NY). Tumorer blev eksponeret i halvt maksimum toppen af ​​det akustiske signal (-6 dB strålebredde på brændpunkt på 3,1 cm, og fokuseres ved 8,5 cm) under anvendelse af en 16-cyklusser tone burst ved 500 kHz frekvens med en ultralyd element diameter 2,86 cm transducer (ILO509HP, Valpey Fisher Inc., Hopkinton, MA). En 3 kHz pulsrepetitionsfrekvens over 50 ms blev anvendt til lydbehandling, sammen med en peak negativt tryk indstillet til 570 kPa, svarende til en mekanisk indeks (MI) på 0,8. Samlet akustisk behandling tid var ~ 5 ms inden vinduet hver 50 ms. En intermitterende 1950 ms perioden mellem lydbehandling vinduer blev ansat for at minimere biologisk opvarmning i vævet under ultralyd eksponeringer. Den samlede tumor insonification tid var 750 ms over 5 minutter for en samlet cyklus på 0,25% [19] pligt. Denne særlige puls sekvens er blevet påvist at have gode strålingssensibiliserende virkning, samtidig med at blodkarrene til at genopfylde med bobler 150 gange under behandlingen. Tumorer blev bestrålet med en 5 Gy dosis af ioniserende stråling umiddelbart efter USMB behandling.

højfrekvent ultralyd Power Doppler Imaging

Alle dyr blev afbildet med tre-dimensionelle højfrekvente ultralyd umiddelbart før behandling og 24 timer efter behandling. Dataene blev erhvervet ved hjælp af en Vevo 770 højfrekvent ultralyd-imaging enhed (Visualsonics, Toronto, ON) med en 30 MHz center frekvens transducer (RMV-707:55 um aksial opløsning, 115 um lateral opløsning, brændvidde på 12,7 mm). En motoriseret scanning etape (Visualsonics, Toronto, ON) blev anvendt til at erhverve 3D B-mode billeder og power Doppler flow data, på et trin størrelse på 0,2 mm. Power Doppler data indsamlet med følgende indstillinger: en rod-filter cut-off på 1-2 mm /s, en scanning hastighed på 1 mm /s, en pulsrepetitionsfrekvens af 5 KHz, en magt Doppler gevinst på 20 dB og en frame rate mindre end 10 fps. Power Doppler billedanalyse blev udført ved hjælp af in-house udviklet software i MATLAB (The MathWorks, Natick, MA). Den vaskularisering index (VI) blev beregnet fra magten Doppler billeder ved at opnå volumen alle farvede objekter (farvede pixels) over omfanget af den valgte ROI’er. En relativ vaskularisering indeks blev anvendt til at vurdere den samlede vaskulær respons på terapi, beregnes som følger: ((VI

24 timer /VI

0 timer) × 100) -100) eller ((VI

7 dage /VI

0 timer) × 100) -100).

Histologisk Analyse

Musene blev aflivet 24 timer, og i et andet kohorte, på 7 dage efter behandling for histologi og immunhistokemi. Tværsnit af tumorxenografter blev farvet med hematoxylin eosin (H α = 0,05). Hver behandling betingelse blev sammenlignet direkte til 0 Gy kontrol betingelse. Desuden har p-værdier fra statistiske test af forskellige permutationer blevet oversigtsform i tabel S1 til S7 i de supplerende data. Statistiske tests blev udført ved anvendelse Prism (GraphPad Software version 5, La Jolla, CA).

Resultater Salg

Vi har udført eksperimenter for at vurdere effekten af ​​vaskulær målretning strategier, hvor USMB, stråling og anti-Dll4 behandlinger blev kombineret for at forstyrre tumorvaskulatur og opretholde vaskulære virkninger for at maksimere den samlede tumorrespons (fig S1B). Tumor kar respons blev vurderet med tre-dimensionelle højfrekvente power Doppler ultralyd på 24 timer og 7 dage efter behandling, i forhold til baseline. Figur 1A viser repræsentative billeder af tredimensionelle effekt Doppler data på 24 timer efter behandling til kontrol (1), Dll4 mAb (3), USMB + XRT (5) og USMB + XRT + Dll4 mAb (6) behandling betingelser. Et fald i flowsignalet var tydelig i tumorer behandlet med den tredobbelte kombination (6). Kvantificerede power Doppler resultater på 24 timer og 7 dage efter behandling er præsenteret for alle behandlingsgrupper forhold i figur 1B og 1C. Minimale ændringer i VI blev observeret for kontroldyrene (1) På begge gange. Vi observerede en ikke-signifikant stigning i ydelse Doppler signal relateret til blodstrøm efter 24 timer, og 7 dage efter XRT (2). Dyr, der modtog Dll4 mAb (3) alene blev der observeret et fald i flow signal (VI) 24 timer efter behandling (p 0,05). Derudover behandling med Dll4 mAb alene (3) bevirkede VI at falde yderligere 7 dage efter behandling (p 0,05). Behandlinger med USMB + XRT (5) forårsagede også en hurtig (indenfor 24 timer) og signifikant (p 0,05) fald i power Doppler signal. Men blodgennemstrømningen volumen forskelle ved magten Doppler de vendte tilbage til baseline niveau 7 dage, hvilket indikerer en midlertidig, kortvarig mikroboble-baserede vaskulær forstyrrelser. Der blev set en hurtig VI fald på næsten 60% for behandlinger med XRT og Dll4 mAb (4) samt de tredobbelte kombination betingelser (6) (p 0,05). Imidlertid VI dråbe varede 7 dage kun i dyr, der modtog den tredobbelte kombination (6) behandlinger eller dem, der fik Dll4 alene (3) (p 0,05). I modsætning hertil er en stigning på ~ 25% i VI til XRT + Dll4 mAb (4) behandlede dyr indikerer en potentiel reperfusion af tumor.

A) Repræsentative billeder af tre-dimensionelle maksimal intensitet projektion af magt Doppler signal ved 24 timer efter behandling, og kvantificeret power Doppler på B) 24 timer og C) 7 dage, er vist. Dyr, der modtager Dll4 mAb alene havde et fald i flow signal (VI) for 24 timer efter levering behandling; VI faldet yderligere 7 dage efter behandlingen. USMB + XRT forårsagede et hurtigt fald i power Doppler signal. Men den aktive volumen blod vendte tilbage til baseline niveau 7 dage. En hurtig VI fald på næsten 60% blev observeret for XRT og Dll4 mAb samt tredobbelt kombination betingelser. Imidlertid VI dråbe varede 7 dage kun i dyr, der modtog den tredobbelte betingelse behandling. Hver eksperimentel betingelse er repræsenterer gennemsnittet af 5 dyr. Fejl- søjler repræsenterer en standardfejl på middelværdien. Statistisk signifikante ændringer er markeret med * (p ≤ 0,05). Skalaen søjle repræsenterer 2 mm

2A, S2A og S2B display repræsentant H . E og ISEL farvede tumor tværsnit for hver af behandlingerne. Data viser celledød efter 24 timer i den kombinerede XRT og Dll4 mAb (4) behandling, samt den tredobbelte kombination (6) behandling tilstand. Celledød regioner varede i tumorer på 7 dage efter behandlingen i begge disse betingelser. Kvantificerede celledød områder fra ISEL farves tumor tværsnit er vist i figur 2A og 2B. Signifikant (p 0,05) celledød blev observeret i tumorer behandlet med USMB + XRT + Dll4 mAb (6), mens der blev observeret en ikke-signifikant forøgelse i celledød for dyr behandlet med stråling kombineret med Dll4 mAb (3). 7 dage efter første behandling, vi bemærkede signifikant (p 0,05) mængder af celledød i både XRT + Dll4 mAb (4) og USMB + XRT + Dll4 mAb (6) behandling betingelser. Endvidere unikke tumor H E farvede tumor tværsnit for angivne behandling ved lave forstørrelse. Den nederste række er af stor forstørrelse billeder af repræsentative H E farvede tumor tværsnit for de angivne behandlinger. Den øverste række Målestokken repræsenterer 2 mm og den nederste række skala søjle repræsenterer 50 um. Kvantitetsbestemte ISEL farvning på B) 24 timer, og C) 7 dage. Signifikant (p ≤ 0,05) celledød blev observeret i tumorer er behandlet med USMB + XRT + Dll4 mAb, mens en ikke-signifikant mængde af celledød observeres for dyr behandlet med XRT og Dll4 mAb. 7 dage efter første behandling, vi bemærkede signifikante (p ≤ 0,05) mængder af celledød i både den kombinerede XRT + Dll4 Mab og USMB + XRT + Dll4 mAb behandling betingelser. Statistisk signifikans er angivet med * for p ≤ 0,05.

Power Doppler og celledød resultater blev suppleret med resultater fra CD31 farvning. Repræsentativ CD31 immunhistokemi er vist i figur 3A og S2C. Ved 24 timer efter behandling (figur 3B), bemærkede vi en ikke-signifikant, men nær fordobling af CD31-farvning med dyr behandlet med Dll4 mAb (3) alene. I mellemtiden observerede vi en signifikant fald i CD31-farvning hos dyr behandlet med USMB + XRT (5) samt de behandles med de tredobbelte behandlingsbetingelser (p 0,05). Ved 7 dage efter behandling (figur 3C), observerede vi en signifikant stigning i CD31 farvning for alle dyr, som modtager Dll4 mAb behandling, enten alene (3) eller i kombination med USMB og /eller XRT (4 og 6). Vi bemærkede også, at dyr behandlet med XRT alene (2), eller i kombination med USMB (5), havde CD31 farvningsresultater niveauer svarende til kontroldyr.

A) Repræsentative billeder af CD31-farvning af tumor tværsnit. Billeder er fire af de behandlingsbetingelser opnået ved 24 timer og 7 dage efter behandling. Skalaen søjle repræsenterer 100 um. B) Normalized CD31 farvning pr ROI på 24 timer og C) på 7 dage efter behandling start. Vi bemærkede en ikke-signifikant, men nær fordobling af CD31 farvning i dyr behandlet med kun Dll4 mAb. Der var et signifikant fald i CD31-farvning hos dyr behandlet med USMB + XRT såvel som dem behandlet med den tredobbelte behandlingsbetingelser. Ved 7 dage efter behandling, var der en signifikant stigning i CD31 farvede fartøjer for alle dyr, der modtog Dll4 mAb behandling, enten alene eller i kombination med USMB og /eller XRT. Dyr behandlet med XRT alene, eller i kombination med USMB havde kvantificeret CD31 farvede tællinger lignende med kontroldyr. Statistisk signifikans er indikeret med * indikerer en p ≤ 0,05.

Figur 4A viser den normaliserede tumorvækst kurve for hver af behandlingsgrupperne betingelser. Ud fra følgende betragtninger kontroldyr (1) fordoblet i volumen på mindre end 5 dage efter påbegyndelse af behandlingen, vi bemærkede en forsinket tumor vækst i alle andre forhold behandlingsmuligheder. Vækstkurver fulgte samme tendens for tumorvækst behandlet med XRT alene (2), Dll4 mAb alene (3), og USMB + XRT behandling (5). Tumorer behandlet med XRT og fortsatte Dll4 mAb-behandling (4) viste en signifikant og synergistisk tumorvækstforsinkelse (se figur 4B) på 14 dage (p 0,05). Tredobbelt kombinationsbehandlinger (6) forårsagede den største tumorvækstforsinkelse, med et mindre fald i tumorstørrelsen tydelig ved 5 dage efter behandlingens begyndelse, efterfulgt af en afbrydelse i vækst varede i næsten 15 dage. En gennemsnitlig tumorvækst forsinkelse på 24 dage blev observeret (p 0,05). For den tredobbelte kombinationsbehandling

A) Normaliserede tumor vækstkurver. En forsinket tumorvækst i alle behandlingsgrupper betingelser blev noteret. Tumor vækstkurver fulgte samme tendens til XRT alene, Dll4 mAb alene, og de USMB + XRT behandlinger. Kombineret USMB + XRT + Dll4 mAb blev observeret at inducere den største respons, med et fald i tumorstørrelse ved 5 dage efter behandling, efterfulgt af vækstinhibering varede i næsten 15 dage. B) Kvantificeret forsinkelse tumorvækst at nå to gange start volumen. Behandlinger med XRT og fortsatte Dll4 mAb oplevet en betydelig synergistisk tumorvækstforsinkelse på 14 dage. I mellemtiden, den tredobbelte kombinationsbehandling (USMB + XRT + Dll4 mAb) forårsagede en tumorvækst forsinkelse på 24 dage. Statistisk signifikante forskelle i forsinket tumorvækst er indikeret med * for p ≤ 0,05.

Diskussion

I denne undersøgelse vi satte os for at undersøge effekten af ​​strategisk kombinere en biofysisk, stråling -baseret, vaskulær forstyrre behandling efterfulgt af en angiogenese-deregulering farmakologisk middel. Det blev postuleret, at dette ville optimere behandlingsrespons. For at maksimere vaskulær ødelæggelse blev ultralyd-stimuleret mikroboble terapi anvendes til først radiosensitize tumor endotelceller, efterfulgt af en enkelt dosis af ioniserende stråling (XRT) for at inducere hurtig vaskulær effekt. Dll4 mAb blev efterfølgende indgivet som en “vedligeholdelse” terapi. En illustration af postuleret kombineret USMB, XRT og Dll4 mAb virkninger på tumorendotelceller er vist i figur 5. Forskellige permutationer af de tre modaliteter kombineret behandling blev også undersøgt. Resultater tyder på en 1.4X synergistisk tumorvækst respons i dyr behandlet med en session af tredobbelt kombinationsbehandling (6), hvor en ~ 24 dage forsinket tumorvækst blev opnået (Figur 4). Dette er sandsynligvis knyttet til en vedvarende tumorvaskulær nedlukning inducerende celledød i tumoren. Anti-Dll4 mAb behandling derefter virker til at opretholde vaskulær lukning. Til sammenligning kombinerer stråling og Dll4 mAb (4) forårsagede en signifikant vækstforsinkelse på ~ 14 dage. Ingen anden signifikans blev observeret i vækstforsinkelsesparametrene assays. Tumorer, der modtager strålebehandling alene oplevet den mindste tumorvækst forsinkelse (~ 3 dage), sandsynligvis forbundet med konventionelle ikke-kar radiobiologisk DNA skader.

Vi postulere, at pre-behandling af tumorer med ultralyd-aktiverede mikrobobler kan først radiosensitize cellerne via en biofysisk proces. Ved stråling levering, ville endotelceller først undergå apoptose, hvilket fører til tumorcelledød. Fortsat levering af en angiogenese deregulator ville forhindre tumor reperfusion, der tjener som en vedligeholdelsesbehandling.

Et fald i tumorstørrelse blev observeret inden for 5 dage efter den tredobbelte kombinationsbehandling (6), hvilket viser en akut reaktion og hvilket tyder på en hurtig tumor vaskulær-baserede “sammenbrud”. Vi observerede en amplitudedoppler VI fald på mere end 50% efter 24 timer i både XRT + Dll4 mAb (4) og tredobbelt kombinationsbehandlinger (6), i sammenligning med stråling alene (2), hvor der blev observeret noget fald i VI ( Figur 1). Den VI Faldet blev kun opretholdt til 7 dage i den tredobbelte kombinationsbehandlinger. Tumor volumen recession sandsynligvis forbundet med omfattende vaskulær lukning, hvilket fører til hurtig dannelse af nekrotiske regioner i kernen af ​​tumoren. Vi postulere, at døde celler hurtigt nedbrydes og ryddet i tumorer behandlet med den tredobbelte kombinationsbehandling, hvilket ville forklare den mindre omfattende kvantificeret ISEL farvning for de tredobbelte kombinationsbehandlinger (figur 2), og reduktion tumor størrelse. Vi har også observeret en betydelig mængde af celledød 24 timer efter denne tripel kombinationsbehandling (6) mens ingen anden betydning blev fundet i andre tilstande behandling (figur 2). Her, ISEL-kvantificerede celledød områder pr tumor tværsnit fastholdt på lang sigt (efter 24 timer) og nåede næsten en middelværdi på 30% af tumoren tværsnit af 7 dage efter behandling. Stråling kombineret med Dll4 mAb (4) forårsagede også signifikant celledød 7 dage efter behandling, men tumorvolumener hos denne tilstand blev bemærket at være større end tumoren, der behandles med den tredobbelte kombinationsbehandling. H & E farvede billeder viste en vedvarende heterogen og nekrotisk tumormikromiljøet 30 dage efter behandlingen (fig S3). Disse resultater viser klart styrken af ​​at kombinere USMB, stråling og Dll4 mAb ovenfor (6), og ud over enhver behandling alene.

I dyr behandlet med XRT + Dll4 mAb (4) eller USMB + XRT + Dll4 mAb (6 ), blev en betydelig og hurtigt fald i vaskulær indeks observeret af 24 timer efter behandlingen (figur 1). antager vi imidlertid, at den resulterende vaskulære nedlukning i nogle af disse behandlinger er af forskellig art. I USMB + XRT + Dll4 mAb (6) behandlede dyr, endotelceller sandsynligvis undergår hurtig apoptose forbundet med en membran forstyrrelse grundet mikrobobleprecursorer mekaniske påvirkninger, og resulterer i ceramidproduktion [29], [30]. Returnering af funktionelle skibe i behandlede tumorer derefter undertrykt af Dll4 mAb behandlinger. I modsætning hertil er behandlinger med XRT + Dll4 mAb (4) sandsynligvis forårsager nogle endothel- celledød (som foreslået i CD31-farvning), hvilket fører til en midlertidig vaskulær nedlukning [15]. Ved 7 dage efter XRT + Dll4 mAb (4) behandlinger, vises den vaskulære indeks, der skal tilbage til baseline niveau, mens det vaskulære indeks depression fortsætter i den tredobbelte kombination behandlet-dyr.

Behandling med Dll4 mAb alene (3) inducerede en lignende reaktion på de tidligere rapporteret [9] – [12]. Som forventet, den kvantificerede CD31 farvning steg efter behandlingsstart, mens aktiv blodgennemstrømning, som vurderet ved hjælp power Doppler ultralyd, faldt (figur 3). Dette er karakteristisk for Dll4 blokade, hvor overdreven angiogenese forekommer, men paradoksalt vaskulære perfusion aftager. I denne undersøgelse blev nedlukning af vaskulær funktion opretholdes i op til 7 dage efter starten af ​​Dll4 mAb behandling (3) (figur 1). Men en tumorvækstforsinkelse ligner stråling alene (2) blev observeret, hvilket indikerer, at Dll4 mAb baseret vaskulær lukning ikke er tilstrækkelig til at inducere betydelig tumor skader (figur 4).

Nylige undersøgelser har vist, at forbehandling af tumorer med USMB kan radiosensitize endotelceller for stråling, dernæst øge den samlede respons af tumorer [19]. Vi har fundet, at USMB rensning efterfulgt af XRT (5) forårsager en akut og signifikant fald i VI, som målt med Doppler ultralyd (figur 1).