PLoS ONE: Reduktion af Decoy receptor 3 Forbedrer TRAIL-medieret apoptose i kræft i bugspytkirtlen

abstrakt

De fleste humane pankreatiske cancerceller er resistente over for tumornekrosefaktor (TNF) -relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) -medieret apoptose. Imidlertid er de mekanismer, hvorved bugspytkirtelkræftceller udnytter deres ekstracellulære molekyler til at modvirke den proapoptotiske signalering medieret af TNF-familien er stort set ukendte. I denne undersøgelse viser vi for første gang, at DcR3, et udskilt attrap receptor, maligne bugspytkirtelkræftceller udtrykker på et højt niveau, fungerer som et ekstracellulært antiapoptotisk molekyle ved binding til TRAIL og modvirke dens dødsfremmende funktion. Reduktionen af ​​DcR3 med siRNA umaskeret TRAIL og stærkt forbedret TRAIL-induceret apoptose. Gemcitabin, en første-line narkotika for kræft i bugspytkirtlen, reducerede også niveauet af DcR3. Tilsætningen af ​​DcR3 siRNA yderligere forbedret gemcitabin-induceret apoptose. Især vores

in vivo

undersøgelse viste, at den terapeutiske virkning af gemcitabin kunne øges via yderligere reduktion af DcR3, hvilket antyder, at nedregulering af DcR3 i tumorceller kunne tippe balancen af ​​pancreasceller mod apoptose og potentielt tjene som en ny strategi for kræft i bugspytkirtlen terapi

Henvisning:. Wang W, Zhang M, Sun W, Yang S, Su Y, Zhang H, et al. (2013) Reduktion af Decoy receptor 3 Forbedrer TRAIL-medieret apoptose i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 8 (10): e74272. doi: 10,1371 /journal.pone.0074272

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Marts 8, 2013; Accepteret: 29 Juli 2013; Udgivet: 25 oktober 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National Natural Science Fund af Kinas Tilskud (81071968) til WW og Key Program for Videnskabelig Forskning i Fujian Medical University (09ZD014) til WW. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: medforfatter Sunghee Kim er ansat af BioPowerTech. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Balancen mellem proapoptotiske og antiapoptotiske faktorer er en afgørende faktor i den skæbne af tumorceller . Disse celler formår at tippe balancen til overlevelse ved overekspression antiapoptotiske molekyler i intracellulære og intercellulære sites. Et organ af studier har vist, at intracellulær B-cellelymfom 2 (Bcl-2) fremmer malignitet i flere typer af tumorer, mens blokere dens funktion øger virkningen af ​​anticancerbehandlinger [1], [2], [3]. Bcl-2 stabiliserer den mitokondriske membran og forhindrer frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier og dannelsen af ​​apoptosomes i cytoplasmaet [4], [5], og derved reducere tumorcelle apoptose og forbedre evnen af ​​tumorer at vokse og metastasere.

størstedelen af ​​apoptotiske signalering aktiveres ekstracellulært via binding af proapoptotiske ligander fra en celle til dødsreceptorer på overfladen af ​​en anden celle [6], [7]. For eksempel ligander af tumornekrosefaktor (TNF) familien binder til deres receptorer (fx TNF til TNFR, FasL til Fas, LYS til HVEM /TR2) og derefter udløse apoptotisk signalering som respons på ugunstige begivenheder [8], [ ,,,0],9]. Det ekstracellulære mekanisme, hvormed celler beskytte sig før død ligander binder til deres receptorer har tiltrukket megen opmærksomhed [10], [11]. Selvom opdagelsen af ​​lokkefugle receptorer (f.eks DcR1, DcR2, og DcR3) har kastet lidt lys over dette fænomen [8], [12], er der behov for en mere detaljeret forståelse af disse mekanismer.

Tumor celler udnytter 2 lags beskyttelse: (1) et aktivt forsvarssystem hvori lokke receptorer blokere dødsligand inden de når receptorerne af TNF-familien på celleoverfladen og forhindre initiering af døden signalering; og (2) et passivt forsvarssystem, hvor antiapoptotisk maskiner spiller en rolle, når først døden signal udløses inde i cellerne. Da dele af molekylerne af type I-celle-dødsreceptorer (f.eks DcR3, DR3, DR5, TNFR1, OPG, og OX40) og død ligander (f.eks FasL, LYS, TL1A, TRAIL, og LTA) deler funktionelt tilsvarende domæner, især blandt de 6 medlemmer af TNFR-familien [13], vi bruges flere tilgange til at udforske bindingen og interaktion af DcR3 med TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL). Vores resultater viste, at DcR3 binder ikke kun til FasL, TL1A (vegi), og LIGHT [14], [15], [16], [17], men også til TRAIL, som det fremgår af resultaterne fra flere assays, herunder Biacore binding, flowcytometri, immunopræcipitation, Western blotting og enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA). Maligne bugspytkirtelkræftceller udtrykker et højt niveau af DcR3, som kan nedreguleres af DcR3 siRNA eller kemoterapi narkotika, såsom gemcitabin. Kombinationen af ​​DcR3 siRNA med TRAIL eller gemcitabin forøger i høj grad apoptotiske proces

in vitro

og forsinker tumorvækst

in vivo

, hvilket tyder på, at nedregulering af ekstracellulær antiapoptotisk DcR3 kan øge anticancer-terapi. Dette gælder især for aggressiv kræft i bugspytkirtlen, som udnytter DcR3 som midlerne til dens progression.

Materialer og metoder

cellelinjer og reagenser

To humane kræft i bugspytkirtlen cellelinjer , AsPC-1 og MiaPaCa-2, og en koloncarcinomcellelinie, SW480, blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler blev opretholdt som monolag-kulturer i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin ved 37 ° C i en befugtet 5% CO

2 atmosfære. DcR3-relaterede reagenser blev leveret af BioPowerTech (Tuscaloosa, AL). Gemcitabin blev købt fra apoteket på University of Rochester Medical Center (Rochester, NY). Den siRNA for DcR3et blev syntetiseret ved integrerede DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). Rekombinant FasL og TRAIL og deres antistoffer blev indkøbt fra R derefter blev 100 pi 1:4000 streptavidin-peberrodsperoxidase (SA-HRP) blev tilsat og inkuberet i brønde i 45 minutter ved 37 ° C, vasket, visualiseret med 3, 3 ‘, 5, 5’ tetramethylbenzidin (TMB), og aflæst ved en bølgelængde på 450 nm. Omvendt blev pladerne overtrukket med DcR3 (100 pi 2 ug /ml) og derefter inkuberet med rekombinant FasL eller TRAIL (100 pi 1 ug /ml) med eller uden DcR3 (20-50 ug /ml, for konkurrence) efterfulgt af biotinyleret anti-FasL eller anti-TRAIL (0,5 ug /ml), SA-HRP, TMB og aflæst ved A

450.

ELISA for DcR3

DcR3 var kvantitativt målt som beskrevet tidligere 17]. Da DcR3 er et udskilt protein, blev 100 pi kulturmedier anvendes. Kort fortalt blev det inkuberet natten over med en ELISA-plade overtrukket med anti-DcR3 Mcab (2 ug /ml) ved 4 ° C. Efter diverse proteiner blev vasket væk, blev det bundne DcR3et detekteret med biotinyleret anti-DcR3 Mcab og SA-HRP og visualiseret med TMB-substrat. Den ukendte prøve koncentrationen blev bestemt ud fra standardkurven, der blev beregnet på samme tid.

nedregulering af DcR3 med Lille interfererende RNA (siRNA)

Små interfererende RNA-sekvenser til human DcR3 blev designet ved hjælp af BLOCK -Det RNAi Designer (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). SiRNA-sekvens var 5’CGCUGCAGCCUCUUGAUGGAGAUGUCC-3 ‘, og kontrollen siRNA-sekvens var 5′-AGGUAGUUCCAGAACUGCGUGUAGUGG-3’. De blev kemisk syntetiseret til transient knockdown af DcR3 i cellekultur. Desuden blev lignende sekvenser indsat i pSilencer ekspressionsvektor for en stabil lav-DcR3 expresser. Transfektion blev udført med Lipofectamine LTX reagens (Invitrogen Life Technologies) og Opti-MEM medier, ifølge producentens instruktioner. Cellerne med forbigående knockdown af DcR3 blev anvendt inden for 3 dage. De stabile transfektanter blev selekteret i 50 ug /ml hygromycin B. De overlevende celler blev puljede at undgå koloni variation og bruge til

in vivo

undersøgelse.

apoptoseassays

apoptotiske celler blev detekteret med 3 assays. Celler blev høstet ved 24-48 timer og farvet med Annexin V /propidiumiodid (PI) for apoptotiske celler eller fikseret i 75% alkohol efterfulgt af PI farvning for sub-G1 fraktion, ifølge standardprotokol fra producenterne. Resultaterne blev analyseret ved flowcytometri. Western blotting blev udført for spaltet PARP. De høstede celler blev lyseret med 1% NP-40-Tris lysepuffer indeholdende en cocktail af proteaseinhibitorer, og proteinkoncentrationen af ​​lysat blev bestemt ved BCA-metoden (Pierce, Rockford, IL). Protein (30 ug) blev fyldt på 10% SDS-PAGE, elektroforeret, overført til en nitrocellulosemembran, inkuberet med 0,5 ug /ml kanin-anti-spaltet PARP eller anti-GAPDH (som ladningskontrol) efterfulgt af anti-kanin-HRP og visualiseret med ECL kemiluminescerende substrat.

Animal etik

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med og godkendt af University of Rochester (Rochester, NY) Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC ), University Udvalg for Animal Resources (UCAR), som beskrevet i

Manuel på Responsible Care og brug af forsøgsdyr

. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse og begrænse antallet af dyr. Alle dyr, der viste tegn på svaghed og dehydrering som følge af behandling modtaget en våd fødevarer kost. Dyr, der fortsatte med at udstille svaghedstegn blev humant aflivet gennem cervikal dislokation.

tumorvækst i nøgne mus

kontroltransfektanter eller transfektanter med lav DcR3 udtryk (2 × 10

6 i 0,2 ml saltvand) blev injiceret subkutant i bagbenene på athymiske nøgne mus (5-6 uger gamle) med en 27,5-gauge nål. Tumorer fik lov til at vokse i 7 dage (ca. 0,1 cm

3) før behandling. Mus, der bærer tumorer dannet af enten kontroltransfektanter eller transfektanter med lav DcR3 ekspression blev tilfældigt inddelt i 2 grupper (8 mus /gruppe), blev behandlet med saltvand som kontrol eller gemcitabin (IV 100 mg /kg) to gange om ugen i 4 uger. For kurve tumorvæksten blev tumorstørrelsen målt to gange ugentligt med en skydelære. Tumorvolumenerne blev beregnet efter formlen

(L x W2) /2

ved måling tumor længde (L) og bredde (W). Ved slutningen af ​​forsøget blev tumorerne fjernet og vejet. En ELISA blev anvendt til at vurdere DcR3et niveau i tumor homogenat (30 ug). Western blotting blev udført for DcR3, TRAIL, og spaltes PARP.

Statistiske analyser

Alle data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD) på mindst 3 bestemmelser, medmindre andet er angivet. Forskellene blandt eller mellem kontrol- og behandlingsgrupperne blev bestemt ved Students

t-

test eller variansanalyse (ANOVA).

P

. 0,05 angivet statistisk signifikans

Resultater

DcR3et bundet til spor

TRAIL er en membran-bundne død ligand med lave niveauer under normal dyrkningsbetingelser, og DcR3 er et udskilt lokkedue receptor. Selvom FasL, TL1A, og LYS er blevet identificeret som ligander for DcR3 [14], [15], [16], [17], [18], har interaktionen mellem DcR3et med TRAIL ikke undersøgt i detaljer. Fordi TRAIL aktier funktionelt lignende domæner med FasL, TL1A, og LYS, vi spekuleret på, at DcR3, som binder til FasL, TL1A, og LYS, kan også bindes til TRAIL.

For at afgøre, om DcR3 binder til TRAIL, vi gennemført stade Biacore bindingsanalyse. Det rekombinante rene DcR3 blev kovalent bundet på strømmen chip overflade, og den rene rekombinante TRAIL og LIGHT (som en positiv kontrol) blev skyllet gennem overfladen ved forskellige koncentrationer. Figur 1 viser bindingen kurve af TRAIL til DcR3 ved forskellige koncentrationer (1-2048 nM). Som vist i tabel 1, selv om kontrol ligevægtskonstant (

K

ækv

) af rekombinant human let til DcR3 var 13,2 nM, foreningen hastighedskonstant (

K

en

) og afstandtagen hastighedskonstant (

K

d

) for rekombinant humant TRAIL til DcR3 var 1,97 × 10

4 1 /Ms og 1,04 × 10

-3 1 /s, henholdsvis og

K

eq

var 52,8 nM, hvilket indikerer binding mellem TRAIL og DcR3et; imidlertid affiniteten var lavere end den for LYS til DcR3.

Biocore assays, flowcytometri, Western blot, og ELISA-lignende Bindingsassays blev udført for at bestemme fysisk vekselvirkning mellem DcR3 og TRAIL. (A) Biacore-analyse. Den bindende kurve af TRAIL til DcR3 blev bestemt ved forskellige koncentrationer (1-2048 nM). Styringen

K

eq

af rekombinant human LYS til DcR3 var 13,2 nM, mens

K

eq

af TRAIL til DcR3 var 52,8 nM. (B) Flowcytometri for DcR3 med TRAIL på celleoverfladen. Suspenderede AsPC-1-celler blev inkuberet først med PBS, TRAIL (5 ug /ml) uden (bane 2) eller med DcR3 (bane 4), rekombinant DcR3 (bane 3), eller muse-anti-TRAIL MAb (1 ug /ml) med DcR3 (bane 5). Derefter blev 5 pg /ml af biotinyleret anti-DcR3 tilsat for at bestemme bindingen af ​​DcR3 på celleoverfladen med flowcytometri. (C og D) Flowcytometri for udsatte TRAIL. Gemcitabin blev tilsat til AsPC-1 (0-1000 nM) eller MiaPaCa-2 (0-100 nM) celler til at stimulere ekspressionen af ​​TRAIL. Celler blev også behandlet med PBS, 10 nM af DcR3 siRNA (for at reducere binding og maskering af TRAIL) eller supplerende rekombinant DcR3 (for at blokere have adgang af anti-TRAIL) for at detektere TRAIL ved flowcytometri. (E og F) co-lokalisering af DcR3 og TRAIL. AspC-1 celler behandlet uden (som kontrol) eller med 500 nM af gemcitabin (at øge ekspressionen af ​​TRAIL) blev farvet med anti-TRAIL-PE og anti-DcR3-FITC. Doublestained celler blev vurderet med flowcytometri. (G til L) Immunofældning og Western blotting for DcR3-TRAIL kompleks. 70-kDa DcR3-TRAIL kompleks i 100 ul ren blanding DcR3et og TRAIL (G og H), lysat (I og J), eller dyrkningsmedier (K ​​og L) i AsPC-1 celler blev fanget med Mcab anti-DcR3 ( G, i, K) eller anti-TRAIL (H, J, L) Mcab og immobiliseres med 30 pi protein A-perler. Komplekset af Mcab-DcR3-TRAIL elueres med Laemmli-buffer og underkastet Western blotting med biotinyleret anti-TRAIL (G, I, K) eller anti-DcR3 (H, J, L) efterfulgt af SA-HRP og ECL-detektor. (M og N) Bindende konkurrence mellem frie og immobiliserede former af DcR3 og TRAIL. M: Efter 100 pi 1 ug /ml rekombinant TRAIL eller FasL blev immobiliseret på en ELISA-plade, 1 ug /ml DcR3 sattes uden (ingen konkurrence gruppe) eller med 10 ug /ml TRAIL eller FasL (konkurrence gruppe) eller kogt TRAIL eller FasL (ingen funktion protein kontrol), efterfulgt af biotinyleret anti-DcR3 og SA-HRP og TMB-substrat. N: DcR3 blev immobiliseret på en ELISA-plade. TRAIL og FasL blev anvendt som ligander uden eller med kogt eller funktionelle 10 ug /ml TRAIL eller FasL i nærvær af DcR3, efterfulgt af biotinyleret anti-TRAIL eller anti-FasL, og SA-HRP og TMB-substrat.

for at bestemme, om DcR3 binder til TRAIL, vi forinkuberes AsPC-1 humane bugspytkirtelkræftceller med eller uden rekombinant DcR3, TRAIL, eller anti-TRAIL Mcab, og derefter farvet dem med biotinyleret anti-DcR3 efterfulgt af streptavidin-FITC. Flowcytometri (Fig 1B) viste, at rekombinant DcR3 mens biotinyleret anti-DcR3 og streptavidin-FITC alene resulterer i ringe farvning af DcR3, kunne binde til celleoverfladen og detekteres med anti-DcR3. På grund af konkurrencen mellem frie TRAIL og membranbundne TRAIL, rekombinant TRAIL reducerede DcR3 celleoverfladebindende. Denne binding blev også reduceret med præinkubation med anti-TRAIL, som blokerede adgangen til DcR3 til membranbundet TRAIL. Sammen de data indikerer, at rekombinant DcR3 binder til spor på overfladen af ​​AsPC-1 celler.

For bedre observere interaktionen mellem TRAIL og DcR3, brugte vi gemcitabin, en første-line antipancreatic kræft narkotika og kendt TRAIL inducer, at opregulere TRAIL. På grund af lægemiddelfølsomhed forskelle, AsPC-1-celler (Fig 1C) kræves en 10-fold højere niveau af gemcitabin at øge ekspressionen af ​​TRAIL, sammenlignet med MiaPaCa-2-celler (Fig 1D). Vi antager, at opløseligt DcR3 ville maskere TRAIL på celleoverfladen; således ville reduktionen af ​​DcR3 reducere maskering og forbedre farvningen af ​​eksponerede TRAIL. For at teste denne hypotese, vi udnyttet DcR3et siRNA tilgang. Reduktionen af ​​DcR3 reducerede maskering af TRAIL og øget tilgængelighed af anti-TRAIL i AsPC-1-celler (Fig 1C), mens kontrol siRNA ikke havde en sådan virkning. Ligeledes vi hypotese, at øget DcR3 omgiver cellerne ville øge maskering og reducere tilgængeligheden af ​​anti-TRAIL til TRAIL. Rekombinant DcR3 blev tilsat til cellerne, hvorved reduceret TRAIL-farvning som påvist ved flowcytometri (fig 1C). Et lignende mønster blev observeret i MiaPaCa-2 (Fig 1D), hvilket antyder, at fænomenet maskering TRAIL med DcR3 er almindelig i den testede cellelinie. Disse resultater støtter stærkt den opfattelse, at DcR3et er forbundet med TRAIL på celleoverfladen.

For yderligere at bestemme bindingen af ​​DcR3 til TRAIL, vi brugte gemcitabin til at udløse overekspression af TRAIL [19], [20] og tilføjede rekombinant DcR3. Dobbelt farvning med anti-TRAIL-PE (rød) og anti-DcR3-FITC viste en forbedret colokalisering (Fig 1F), sammenlignet med kontrollen (Fig 1E), hvilket antyder, at DcR3 er fysisk forbundet med TRAIL.

for at bekræfte den fysiske sammenslutning af DcR3 med TRAIL, vi udførte immunopræcipitation og Western blotting. FasL, en kendt ligand for DcR3, blev anvendt som en positiv kontrol. Resultaterne viste, at anti-DcR3-fanget DcR3-TRAIL kompleks (ca. 70 kDa MW under mildt denaturerende betingelser) kunne påvises ved anti-TRAIL i en blanding af ren rekombinant DcR3 og TRAIL (Fig 1G), lysat (fig 1 i) , eller konditioneret medier (fig 1K) i AsPC-1 celler, der udtrykte både DcR3et og TRAIL. Ligeledes vil den anti-TRAIL-fanget DcR3-TRAIL kompleks påvises ved anti-DcR3 i de samme 3 indstillinger (fig 1H, 1J, og 1 I). Som en side-by-side positiv kontrol, FasL udviste et mønster svarende til den af ​​anti-FasL-fanget DcR3-FasL kompleks påvist ved anti-DcR3 (Fig 1G, 1I, og 1K), som kraftigt støtter den opfattelse, at TRAIL og FasL binder til DcR3. Især DcR3et-TRAIL dannede kompleks ikke kun i et rent protein tilstand (fig 1G og 1H), men også i en naturlig tilstand i membranbundne form (i lysat, fig 1I og 1J) og i den sekretoriske formular (i medier fig 1K og 1L). Båndene af DcR3-TRAIL kompleks i medierne var meget finere end båndene i lysat, hvilket indikerer, at komplekset var membranbundne. Disse resultater var i overensstemmelse med dem, der opnås gennem flowcytometri.

For yderligere at bekræfte sammenslutningen af ​​DcR3 med TRAIL, vi foretaget en ELISA-lignende assay. Når TRAIL eller FasL blev coatet på ELISA-plader, kan bindingen af ​​DcR3 til disse ligander detekteres med anti-DcR3 og reduceret ved tilsætningen af ​​fri rekombinant TRAIL eller FasL, som konkurrerede med DcR3 for det immobiliserede TRAIL eller FasL (fig 1M) . I modsætning hertil, når DcR3 blev coatet på ELISA-plader, den rekombinante TRAIL eller FasL bundet til immobiliseret DcR3 og blev påvist ved anti-TRAIL eller anti-FasL, som også delvist blokeret af den frie form af DcR3 (Fig 1 N).

i alle tests, den FasL-DcR3 kompleks tjente som en side-by-side positiv kontrol og viste et mønster svarende til den i DcR3et-TRAIL-kompleks (fig 1G, 1I, 1K. 1L og 1M), stærkt støtter, at TRAIL er faktisk en ny ligand af DcR3.

Ændring af DcR3 påvirkede gemcitabin-induceret apoptose

for at undersøge den biologiske funktion af DcR3 i bugspytkirtelkræft, vi målte niveauet af DcR3 ved en kvantitativ ELISA for DcR3 [21] i AsPC-1 og MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller. Sammenlignet med SW480, en human colon-adenocarcinom-cellelinie, der vides at udtrykke høje niveauer af DcR3, sammenlignet med andre 13 cellelinjer [22], aspC-1 og MiaPaCa-2-celler havde en endnu højere niveau af DcR3 (Fig 2 A), hvilket er i overensstemmelse med andre rapporter [23], [24]. Både DcR3et og TRAIL udtrykt på et højt niveau på de samme celler, hvilket antyder, at antiapoptotiske og proapoptotiske molekyler er afbalanceret på et højt niveau for at modvirke hinanden. Den naturlige ekspression af høje niveauer af begge molekyler gør studiet af deres interaktion meget lettere.

(A) Ekspression af DcR3 i AsPC-1, MiaPaCa-2, og SW480-celler (som positiv kontrol). DcR3et niveau i 100 pi konditioneret medium fra celler, der var dyrket i 6-brønds plader (4 ml) blev målt med en ELISA. (B og C) Gemcitabin reduceret DcR3 ekspression. AspC-1 og MiaPaCa-2-celler blev behandlet med gemcitabin i de angivne koncentrationer i 48 timer. DcR3et niveau blev målt i 100 pi medier fra hver gruppe. (D) siRNA slået ned DcR3 udtryk. Celler (1 x 10

5) i 6-brønds plader blev transficeret med 10 nM af DcR3 siRNA eller kontrol siRNA i Transfectin LTX (6,25 pl /brønd). Efter 24 timer blev DcR3 i dyrkningsmedier målt med en ELISA.

For at bestemme den interaktive virkning af DcR3 og TRAIL på cancerceller, gemcitabin og siRNA for DcR3 blev anvendt til at regulere størrelsen af ​​DcR3. AspC-1 og MiaPaCa-2-celler blev behandlet med forskellige doser af gemcitabin i 48 timer, og niveauet af DcR3 i medierne blev målt med en ELISA. Resultaterne viste, at gemcitabin reduceret DcR3 på en dosis-afhængig måde i begge cellelinier (figur 2B og C). En tilsvarende reduktion blev observeret med siRNA (Fig 2D).

Hvis funktionen af ​​gemcitabin-reducerede DcR3et er at tippe balancen i retning af apoptose, så tilsætning af DcR3 bør vende gemcitabin-induceret apoptose. Således blev AsPC-1 og MiaPaCa-2-celler behandlet med forskellige doser af gemcitabin med eller uden rekombinant DcR3 i 48 timer, og derefter de apoptotiske celler blev målt med Annexin V-farvning. Resultaterne viste, at 5-8% af cellerne apoptotiske i kontrolgruppen, som steg til ca. 30% i gemcitabin gruppen. Denne gemcitabin-induceret apoptose blev reduceret ved tilsætningen af ​​rekombinant DcR3 (0, 0,5, 1, og 2 ug /ml) i en dosis-afhængig måde (Fig 3A og 3B). Tilsvarende blev gemcitabin-inducerede stigning af caspase 3-aktivitet vendes ved DcR3 (Fig 3C og 3D). Disse resultater antyder, at DcR3 spiller en kritisk rolle ved inhibering af apoptose og at gemcitabin-induceret reduktion af DcR3 kan være relateret til dets antitumoraktivitet

Gemcitabin blev tilsat til mediet af AsPC-1 (500 nM). eller MiaPaCa-2-celler (50 nM) inkuberet med 0, 0,5, 1, eller 2 ug /ml rekombinant DcR3 i 24 timer. Celler blev derefter underkastet flowcytometri for sub-G1 fraktion (A og B) eller et enzym assay for caspase 3-aktivitet (C og D). Gemcitabin-udløst apoptose blev reduceret ved tilsætningen af ​​DcR3 på en dosis-afhængig måde (

P

0,01).

Nedregulering af DcR3 med siRNA fremmes TRAIL-medieret apoptose i vitro

for at teste, om afsløringen af ​​TRAIL kunne øge dens tilgængelighed til sin receptor og forbedre denne død vej, vi undersøgte effekten af ​​DcR3 på TRAIL-medieret apoptose. DNA fragmentering (sub-G1) assay viste, at når AsPC-1 celler blev behandlet med FasL eller LYS plus kontrol siRNA eller DcR3 siRNA, gjorde apoptose ikke stige væsentligt. Men når de behandles med TRAIL og DcR3 siRNA, AsPC-1-celler udviste en dramatisk stigning i apoptose, sammenlignet med celler behandlet med TRAIL plus kontrol siRNA (Fig 4A). MiaPaCa-2-celler udviste et lignende mønster (Fig 4C). Den forstærkede apoptose blev yderligere bekræftet ved forøget spaltet PARP, som bestemt ved Western blotting (Fig 4B og 4D). Resultaterne indikerer, at reduceret DcR3 i høj grad kan forbedre den proapoptotiske virkning TRAIL i disse 2 pancreas cancercellelinier (sammenlignet med FasL og LYS), hvorimod DcR3 udnyttes af disse celler til at modvirke den proapoptotiske virkning TRAIL.

AsPC-1 eller MiaPaCa-2-celler blev transficeret med 10 nM kontrol siRNA eller DcR3 siRNA hhv. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med rekombinant FasL, lys eller TRAIL (100 ng /ml for AsPC-1 og 20 ng /ml for MiaPaCa-2-celler) i 24 timer. Celler blev høstet og udsat for flowcytometri for sub-G1 fraktion (A og C) eller Western blotting for spaltet PARP (B og D). DcR3 siRNA væsentligt forbedret TRAIL-induceret apoptose (

P

0,05).

DcR3 påvirket gemcitabin-medieret apoptose in vitro

DcR3 siRNA og gemcitabin reduceret ekspressionsniveauet af DcR3 (fig 3 og 4). Vi ønskede at bestemme, om yderligere nedregulering af DcR3 via kombinationen af ​​disse 2 faktorer kunne øge proapoptotiske virkning, sammenlignet med en enkelt faktor alene. Efter cellerne blev behandlet med enten siRNA eller gemcitabin alene eller i kombination, blev DNA-fragmentering og spaltes PARP målt. Resultaterne viste, at selv gemcitabin alene forårsagede øget apoptose (fig 5A og 5C) og spaltede PARP niveauer (Fig 5B og 5D), dets kombination med siRNA yderligere forøget apoptose og spaltede PARP niveauer (Fig 5). Uden en proapoptotiske ligand med til at binde og modvirke, DcR3 siRNA alene ikke havde nogen virkning; men når TRAIL blev opreguleret af gemcitabin, reduktion af DcR3 faldt maskering af TRAIL og derved fremme apoptose.

AsPC-1 eller MiaPaCa-2-celler blev transficeret med 10 nM kontrol siRNA eller DcR3 siRNA henholdsvis . Efter 24 timer blev cellerne behandlet med gemcitabin (250 eller 25 nM) i 24 timer. Celler blev høstet og udsat for flowcytometri for sub-G1 fraktion (A og C) eller Western blotting for spaltet PARP (B og D). Kombinationen af ​​DcR3 siRNA og gemcitabin væsentligt forbedret den proapoptotiske virkning.

Disse resultater er konsistente med dem i figur 3. I forbindelse med resultaterne vist i figur 1 og 4, tyder dataene, at DcR3 binding til TRAIL reducerer TRAIL-induceret apoptose og beskytter tumorceller, og som kunne forklare resistensen af ​​tumorer til TRAIL behandling.

Nedregulering af DcR3 forøgede kemoterapeutiske virkning på tumorvækst in vivo

Opmuntret af lovende

in vitro

resultater, vi ønskede at afgøre, om reduktionen af ​​DcR3et kan øge effektiviteten af ​​kemoterapi

in vivo

aSPC-1 celler blev transficeret med en pattedyrekspressionsvektor, der indeholdt siRNA til. knockdown ekspression af DcR3 og en kassette til G418-selektion. De poolede vektor mock transfektion celler (som kontrol) eller DcR3 siRNA transficerede celler med lav DcR3 ekspression (bekræftet ved ELISA) blev injiceret i nøgne mus, og de etablerede tumorer (60 mm3) blev derefter behandlet med gemcitabin. Resultaterne viste, at DcR3 siRNA alene ikke langsom tumorvækst (figur 6A) eller reducere tumorvægt (figur 6B);