PLoS ONE: MicroRNA-23b Fungerer som en tumorsuppressor ved at regulere Zeb1 i blærekræft

Abstrakte

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodende RNA, der regulerer genekspression ved målrettet undertrykkelse af transskription og translation. I denne undersøgelse viser vi, at miRNA-23b (MIR-23b) virker som en tumorsuppressor i blærekræft. Kvantitativ realtids-PCR-analyse viste, at MIR-23b er betydeligt nedreguleret i blæren cancercellelinier og tumorvæv sammenlignet med ikke-maligne celler og normale vævsprøver. Vi viser også, at miR-23b udtryk har potentiale til at være diagnostisk og prognostisk biomarkør i blærekræft. High miR-23b udtryk er positivt korreleret med højere samlet overlevelse af patienter blærekræft som afsløret ved Kaplan-Meier analyse. ROC-analyse viste, at MIR-23b-ekspression kan skelne mellem normale og blære cancervæv. Yderligere vi belyst den biologiske betydning af miR-23b i blærekræft. Over-ekspressionen af ​​miR-23b i blære cancerceller hæmmede celledeling og nedsat kolonidannelse. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) -analyse viste, at re-ekspression af MIR-23b i blære cancerceller inducerede G0 /G1 cellecyklusstop og apoptose, mens inhibering af cellemigration og invasion. Luciferasereporteren analyser viste, at Zeb1, en afgørende regulator af epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT), er et direkte mål for miR-23b i blærekræft. Disse resultater viser, at tabet af MIR-23b giver en proliferativ fordel og fremmer blærekræft cellemigration og invasion. Endvidere kan re-ekspression af MIR-23b være en gavnlig terapeutisk strategi til behandling af human blærecancer

Henvisning:. Majid S, Dar AA, Saini S, Deng G, Chang I, Greene K, et al. (2013) MicroRNA-23b Fungerer som en tumorsuppressor ved Regulering Zeb1 i blærekræft. PLoS ONE 8 (7): e67686. doi: 10,1371 /journal.pone.0067686

Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA

Modtaget: Marts 17, 2013; Accepteret: 20 maj 2013; Udgivet: 2 juli 2013

Copyright: © 2013 Majid et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National center for Research Resources af National Institutes of Health gennem tilskud numre RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, I01BX001123, VA Merit anmeldelse og VA Program Project. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den fjerde mest almindelige malignitet i USA og en af ​​de dyreste at klinisk styre [1]. Mere end 90% af urinblæretumorer består af overgangs- cellecarcinom (TCC), der hidrører fra overgangs- epitel [2]. Urinblæretumorer inddeles i to forskellige kategorier: ikke-muskler og muskel invasiv blærekræft [3], [4]. De fleste tumorer (75-80%) er til stede som lav kvalitet papillære non-invasive tumorer, der sjældent fremskridt at blive dødelig, men næsten altid gentages. Denne type kræft kaldes “overfladisk” blærekræft og kræver dyrt langsigtet forvaltning. Resten er af høj kvalitet muskel invasive tumorer (-15%), der hurtigt kan udvikle sig til at blive metastatisk og føre til dødsfald [4]. Ætiologiske faktorer involveret i blæren carcinogenese forblive uidentificerede, og effektive molekylære markører for sygdommen er begrænsede.

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodende RNA’er, der regulerer genekspression ved målrettet undertrykkelse af transkription og translation. Flere undersøgelser har gjort en global analyse af miRNA-ekspression i humane cellelinier og fundet væv og sygdomsspecifikke ekspressionsmønstre [5], [6]. Der er også stigende tegn på, at miRNA udtryk profiler kan være tegn på risiko for sygdom og byrde. Således er miRNA vurderes som potentielle biomarkører at hjælpe ved diagnose og prognose af forskellige kræfttyper [7], [8]. Flere humane miRNA har vist sig at blive dysreguleret i blærekræft, herunder MIR-1280 MIR-203, MIR-125b og MIR-133a [9], [10], [11], [12] og bidrage til udviklingen og progression af sygdommen. Her rapporterer vi, at miR-23b er signifikant nedreguleret i blære cancer væv og cellelinjer og at høj udtryk niveau af miR-23b positivt korrelerer med højere samlet overlevelse af patienter efter operationen. Derudover undersøgte vi den funktionelle betydning af miR-23b og identificeret Zeb1 som et direkte mål for miR-23b i blærekræft. For første gang i denne undersøgelse viser, at miR-23b er en potentiel biomarkør og tumor suppressor i blærekræft direkte rettet mod onkogen Zeb1.

Materialer og metoder

cellelinjer og Cell Culture

SV-HUC-1, T24 og J82-celler blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrkes efter ATCC protokoller. Disse human-afledte cellelinier blev bekræftet ved DNA kort tandemgentagelse-analyse af ATCC. Forsøgene med cellelinier blev udført inden for 6 måneder efter deres indkøb /genoplivning. SV-HUC-1-celler blev dyrket i F-12K medium (ATCC) med 10% FBS. T24-celler blev dyrket i McCoys 5A-medium suppleret med 10% FBS og J82-celler blev dyrket i Minimum Essential Media (MEM) suppleret med 10% FBS. Celler blev holdt i en inkubator med en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 ved 37 ° C.

Plasmider, prækursorer og transfektion

TaqMan prober og prækursorer for HSA -miR-23b og negativ kontrol præ-miR blev indkøbt fra Applied Biosystems (Foster City, CA). pmir-GLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector blev købt fra Promega. microRNA-23b blev kontrol-microRNA og siRNAs anvendt ved 50 nM koncentration og Lipofectamine 2000 (Invitrogen) blev anvendt til alle transfektioner.

RNA Extraction

miRNA og total RNA blev udvundet fra cellelinier ved anvendelse af en miRNeasy Mini Kit og et RNeasy Mini Kit (Qiagen). miRNA fra kliniske prøver blev udvundet ved hjælp af laser capture mikrodissektions teknikker med en miRNeasy FFPE (Qiagen).

Humane kliniske prøver

Kliniske prøver blev indhentet fra de San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center . Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af UCSF Udvalget om menneskelige Forskning (Godkendelsesnr: H9058-35751-01).

kvantitativ real-time PCR

Modne miRNA blev analyseret under anvendelse TaqMan miRNA tests i overensstemmelse med producentens instruktioner (Applied Biosystems). Alle RT reaktioner, herunder ikke-skabelon kontroller og RT minus kontrol, blev kørt i en 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). RNA-koncentrationer blev bestemt med en NanoDrop (Thermo Scientific, Rockford, IL). Prøver blev normaliseret til RNU48 (Applied Biosystems). Gene udtryk niveauer blev kvantificeret ved hjælp af 7500 Fast Real Time Sequence detection system Software (Applied Biosystems). Sammenlignende realtids-PCR blev udført tredobbelt, herunder uden template kontrol. Relativ ekspression blev beregnet ved hjælp af sammenlignende Ct.

cellelevedygtighed og Clonability Assays Salg

Cellelevedygtighed blev bestemt ved 24, 48 og 72 timer ved hjælp af CellTiter 96 Aqueous One Solution celleproliferationsassay kit ( Promega, Madison, WI) ifølge producentens protokol. Absorbans blev målt ved 490 nm under anvendelse SpectraMAX 190 (Molecular Devices). Data er præsenteret som middelværdien for tredobbeltforsøg forhold til den negative kontrol. For kolonidannelse assayet blev celler podet ved lav densitet (1000 celler /plade) og fik lov at vokse, indtil synlige kolonier fremkom. Derefter blev cellerne farvet med Giemsa og kolonier blev talt.

Migration og Invasion Analyser

Cytoselect 24-brønd celle migration og invasion assay kits (Cell Biolabs, Inc) blev anvendt til migration og invasion assays ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev T24 og J82-celler transficeret med Pre-miR miRNA precursor eller negativ kontrol høstet 72 timer efter transfektion og resuspenderet i serumfrit Opti-MEM. Celler (10 × 10

4 per 300 pi medier uden serum) blev tilsat til det øvre kammer, og det nedre kammer blev fyldt med 500 pi medium indeholdende 10% FBS. Celler blev inkuberet i 16 timer ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Efter 16 timer blev ikke-migrerede /ikke-invaderende celler fjernet fra oversiden af ​​trans-brønds membran filterindsatse bruger vatpind. Migrerede /invaderet celler på den nedre side blev farvet og absorbansen blev aflæst ved 560 nm ifølge producentens protokol. Salg

immunblotting

Protein blev isoleret fra konfluente (70-80%) plader af dyrkede celler under anvendelse af M-PER pattedyrprotein Extraction Reagent (Pierce Biotechnology, Rockfield, IL) ifølge producentens anvisninger. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved Bradford-metoden. Lige store mængder protein blev opløst på 4-20% natriumdodecylsulfat (SDS) polyacrylamidgeler og overført til en nitrocellulosemembran ved spænding gradient overførsel. De resulterende blots blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk og probet med specifikke antistoffer. Blots blev derefter inkuberet med passende peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer og visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Udtømning af Zeb1 Brug Lille interfererende RNA (siRNA)

T24 blærekræft celler blev udpladet 24 timer før transfektion. Ved 40 til 50% konfluens blev cellerne transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) med siRNA-duplexer specifikt for humant Zeb1 (SR304746; Origene Technology, Rockville, MD) eller kontrol-ikke-silencing (NS) siRNA i 72 timer . Først blev to forskellige sæt af siRNA-duplexer testet for at vurdere mål-specificiteten og knockdown effektivitet. One siRNA duplex blev anvendt til yderligere eksperimenter ved 50 nM koncentration.

Luciferase Reporter Assay

A pmirGLO Dual-Luciferase miRNA target ekspressionsvektor blev anvendt til 3′-UTR luciferase assays (Promega, Madison , WI). Målet onkogen af ​​miRNA-23b blev udvalgt på grundlag af online microRNA måldatabase https://www.microrna.org/microrna/home.do. Primersekvenserne for vildtype 3’UTR var: Fremad 5’CGCGGCCGCTAGTATTATGTTTTTTAAAATGTGAGT 3 ‘og Reverse 5’CTAGACTCACATTTTAAAAAACATAATACTAGCGGCCGCGAGCT 3’. For mutanten 3’UTR, primersekvenserne var: Fremad 5’CGCGGCCGCTAGTATCGTGCGCACTAAGGCTCACTT 3 ‘og revers 5’CTAGAAGTGAGCCTTAGTGCGCACGATACTAGCGGCCGCGAGCT 3’. For lucifease assay blev T24 og J82-celler cotransficeret med HSA-MIR-23b og pmirGLO Dual-Luciferase miRNA target ekspressionsvektorer med vildtype eller mutant målsekvens under anvendelse af lipofectamin 2000. ildflueluciferase aktiviteter blev målt ved anvendelse af Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI) 18 timer efter transfektion, og resultaterne blev normaliseret med Renilla luciferase. Hver reporterplasmid blev transficeret mindst tre gange (på forskellige dage), og hver prøve blev analyseret tredobbelt.

Statistical Analysis Salg

Statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism 5 og MedCalc versionen 10.3.2 . Alle kvantificerede data repræsenterer gennemsnittet af mindst tredobbelte prøver eller som angivet. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. Alle tests blev udført to halet og

p-

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Receiver Operating kurver (ROC) blev beregnet til at bestemme den potentielle af MIR-23b til at skelne mellem maligne og ikke-maligne prøver. For overlevelsesanalyse, Kaplan-Meier (log-rank test) analyse blev udført.

Resultater

miR-23b Expression er opbrugt i blæretumorer og cancercellelinjer

Indledende microRNA microarray data viste, at mIR-23b var stærkt nedreguleret i blæren cancercellelinier sammenlignet med den ikke-maligne SV-HUC1 cellelinie. Vi valideret mikroarraydata af miRNA-kvantitativ RT-PCR (MIR QRT-PCR) analyse og resultaterne bekræftede, at MIR-23b blev nedreguleret i blærekræft cellelinier J82, T24 sammenlignet med ikke-malign cellelinie SV-HUC1 (figur 1A) . For at undersøge den biologiske relevans af miR-23b, blev sit udtryk analyseret i laser fanget mikrodissekeres (LCM) menneskelig blære tumorvæv og sammenlignet med normale matchede kontrol væv. Ekspressionen af ​​MIR-23b viste sig at være betydeligt nedreguleret i alle tumorprøverne forhold til deres matchede normale prøver (figur 1A). Fremme ekspressionen af ​​MIR-23b i normale væv korrelerede med den af ​​den ikke-malign cellelinje og af tumor korreleret med cancercellelinier (figur 1A) indikerer, at disse cancercellelinier repræsenterer et modelsystem til analyse af MIR-23b funktion i blærekræft. Disse resultater tyder også på en formodet tumor suppressor rolle for miR-23b i blærekræft.

A) Kvantitativ RT-PCR-analyse af miR-23b i cellelinjer og i matchede laser-erobrede mikrodissekeret vævsprøver. B) spredning af J82 og T24 celler efter miR-23b transfektion blev væsentligt reduceret i forhold til cont-miR. C) miR-23b overekspression signifikant hæmmer kolonidannende evne blære cancerceller.

MicroRNA-23b Regulerer blærekræft Cell Proliferation og Colony Formation

For at bestemme den funktionelle betydning af miR-23b overekspression i blærekræft, vi transficeret blærekræft cellelinjer J82 og T24 med miR-23b forstadier. Ektopisk ekspression af MIR-23b faldt betydeligt celleproliferation sammenlignet med celler, der udtrykker cont-miR (figur 1B). MIR-23b transficerede celler havde lav kolonidannelse evne som antallet af foci i MIR-23b udtrykkende celler blev nedsat, når sammenlignet med cont-miR transficerede celler (figur 1C). Disse resultater indikerer anti-proliferative effekt af MIR-23b i blærekræft.

MIR-23b Udløser cellecyklusstandsning og inducerer apoptose i blære cancerceller

FACS (fluorescensaktiveret cellesortering) analyse afslørede at re-ekspression af mIR-23b ført til en betydelig forøgelse af antallet af celler i G0 /G1-fasen af ​​cellecyklussen (59% til 67%), mens S-fase population faldt fra 18% til 9% i J82 celler (figur 2A). Lignende resultater blev observeret i T24-celler med en stigning i G0 /G1-cellepopulation (70% til 84%) og et fald i S-fase population (15% til 5%) (figur 2B). Således tyder på, at miR-23b udløser G0 /G1 anholdelse i MIR-23b transficerede celler i forhold til cont-miR. FACS-analyse for apoptose blev udført under anvendelse Annexin-V-FITC-7-AAD farvestof. Den procentdel af de samlede apoptotiske celler (tidlig apoptotisk + apoptotiske) blev signifikant forøget (4% til 19%) som svar på miR-23b overekspression i forhold til cont-miR med en tilsvarende 14% fald i levedygtige cellepopulation i J82 celler (Figur 2C). I T24-celler, blev en stigning (4% til 9%) i apoptotiske celler observeret med MIR-23b overekspression sammenlignet med cont-miR (figur 2D). Disse resultater indikerer en tumor suppressor rolle for MIR-23b i blærekræft.

A-B) Repræsentative billeder af FACS-analyse viser MIR-23b overekspression inducerer G0 /G1 cellecyklusstandsning i J82 og T24-celler med et tilsvarende fald i S-fase celler. C-D) MIR-23b overekspression inducerer apoptose i J82 og T24-celler med et samtidigt fald i levedygtige antal celler. Data vist fra tredobbeltforsøg ± SD.

miR-23b Undertrykker blærekræft Cell Migration og Invasion

Over-ekspressionen af ​​miR-23b havde anti-migrerende og anti-invasive virkninger på blære cancer cellelinjer. Mindre absorbans blev observeret ved 560 nm med MIR-23b transficerede blære cancerceller sammenlignet med cont-miR i migration assay (figur 3A) og MIR-23b overekspression også signifikant reduceret invasivitet af blære cancerceller (figur 3B).

A) Migration analyser af J82 og T24-celler transficeret med miR-23b. B) Repræsentative billeder af migration assay. C) Invasion assays viser et signifikant fald i antallet af invaderende J82 og T24-celler transficeret med MIR-23b. D) Repræsentative billeder af invasion analysen.

Oncogene Zeb1 er et direkte mål for miR-23b

Zeb1 er blevet rapporteret til at være en vigtig molekyle, der driver blærekræft celle motilitet. Ved hjælp af en online microRNA måldatabase vi fundet onkogen Zeb1 at være et potentielt mål for miR-23b med en supplerende 3’UTR bindingssted for frø sekvens af miR-23b (figur 4A). Vi udførte Western-analyse med MIR-23b transficerede celler og fundet, at MIR-23b svækket ekspression af Zeb1 protein sammenlignet med cont-miR i både J82 og T24 blære cancerceller (figur 4B). For at kontrollere, om en direkte interaktion er involveret mellem miR-23b og sit mål onkogen Zeb1, vi udførte luciferase reporter assays. Vi fandt, at co-transfektion af MIR-23b sammen med vildtype 3’UTR af Zeb1 forårsagede et signifikant fald i luciferaseaktivitet sammenlignet med kontroller (figur 4C). Disse resultater tyder på, at miR-23b direkte rettet mod onkogen Zeb1.

A) gratis miR-23b bindende sekvenser i Zeb1 3’UTR. B) Western blot-analyse viser, at MIR-23b undertrykker translation af Zeb1 protein i J82 og T24-blære cancerceller. C) Luciferase undersøgelser, som viser nedsat reporter aktivitet efter cotransfektion af enten vildtype eller mutant Zeb1-3’UTR med MIR-23b i J82 og T24-celler. Mut muterede Zeb1 3’UTR sekvens.

Udtømning af Zeb1 af RNA interferens efterligner miR-23b Tilberedning i Blærekræft

Phenocopy eksperimenter blev også udført af siRNA hæmning af Zeb1 (figur 5). Vi valideret to sæt siRNA (Si-1 og Si-2), som resulterede i signifikant knockdown af Zeb1 på proteinniveau (figur 5A) i T24-blære cancerceller og bruges én siRNA duplex til yderligere eksperimenter ved 50 nM koncentration. Vores resultater viste, at siRNA inhibering af Zeb1 forårsagede nedsat cellelevedygtighed (figur 5B), vandrende og invasive kapacitet (figur 5C-D) i T24 cancerceller. Vi observerede også, at siRNA inhibering af Zeb1 steg ca. 7% af den apoptotiske fraktion af celler i Zeb1 siRNA transficerede celler sammenlignet med 1% i ikke-specifik kontrol (figur 5E). Disse resultater antyder, at siRNA udtømning af Zeb1 efterligner virkningen af ​​MIR-23b over-ekspression i blærekræft.

A) Zeb1 proteinniveauer blev signifikant svækket med 50 nM siRNA-duplexer (SI) i forhold til en ikke-silencing siRNA duplex (Con) i T24-celler. B) Virkning på celleproliferation. C-D) Effekt på migration og invasion af T24 blære cancerceller. E) Apoptose assay viser induktion af apoptose efter Zeb1 knockdown af siRNA i T24-celler. * P. 0,05

Diagnostik og prognostiske Betydningen af ​​miR-23b i Blærekræft

For at bestemme om miR-23b udtryk kan skelne mellem blæretumorer og normale væv, og forudsige patient overlevelse, udførte vi ROC analyse og Kaplan-Meier-analyse. De kliniske demografi patientens kohorten er opsummeret i figur 6A. Arealet under ROC-kurven (AUC) af 0,885 (P 0,0001; 95% CI = 0,75-0,97) (figur 6B) foreslog, at MIR-23b-ekspression kan skelne mellem maligne og ikke-maligne væv og potentielt anvendes som et diagnostisk markør for blærecancer. For at bestemme om miR-23b har nogen prognostisk betydning, vi delte patient væv i lav (udtryk T /N 1,2 gange) og høj (udtryk T /N 1,2 gange) miR-23b grupper og udførte Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Kaplan-Meier-analyse viste, at den høje MIR-23b gruppe havde signifikant højere samlet overlevelse sandsynlighed i sammenligning med den lave MIR-23b gruppe (Logrank Test p 0,03, Hazard Ratio (HR) = 4,3, 95% Cl = 2-14) ( figur 6C). Disse resultater tyder på, at miR-23b er potentielt en diagnostisk og prognostisk markør for blærekræft selvom undersøgelser af flere prøver er nødvendige for at styrke disse resultater.

A) klinisk-patologisk kendetegn for patientens kohorte. B) ROC kurve analyse viser evne miR-23b udtryk til at skelne mellem maligne og ikke-maligne vævsprøver. C) Kaplan-Meier analyse for samlet overlevelse baseret på miR-23b udtryk.

Diskussion

MikroRNA’er kan have store effekter ved at regulere ekspressionen af ​​en række forskellige gener under pattedyr udvikling og carcinogenese. Som et resultat, forstå mekanismerne og funktion af individuelle miRNA har genereret stor interesse. På trods af den akkumulerende dokumentation for betydningen af ​​forskellige miRNA i kræft, meget begrænsede oplysninger om funktionen af ​​miRNA i blærekræft, og er blevet identificeret kun få miRNA targets.

Her er vi rapportere, at miR-23b til blive nedreguleret i blæren cancervæv sammenlignet med normale tilstødende væv og dette blev også observeret i blærecancer og ikke-maligne cellelinier. Vores data tyder på en potentiel diagnostisk /prognostisk rolle for miR-23b forudsige samlet overlevelse og diskriminerende maligne fra normale væv og indikerer, at miR-23b er en tumor suppressor i blærekræft.

For at bestemme den biologiske relevans af miR -23b i blærekræft, udførte vi funktionelle assays. Ektopisk ekspression af MIR-23b resulterede i signifikant inhibering af celleproliferation, kolonidannelse, migration /invasion og induktion af cellecyklus og apoptose i blære cancerceller. Ekspression af MIR-23b i cancer er noget kontroversiel, fordi det har vist sig at være enten opreguleret og oncogen i nyrekræft hvor det forårsagede translationel undertrykkelse af tumor suppressor PTEN genet [13] eller nedreguleres og en tumorsuppressor i prostatacancer hvor det direkte er rettet mod Src kinase og Akt onkogener [14], mens vores undersøgelse viser det er en tumor suppressor i blærekræft. Tidligere undersøgelser har vist, at microRNA er yderst vævsspecifik og de kan fungere som tumor suppressor eller onkogener [15], [16]. MikroRNA’er har flere funktioner, der gør dem attraktive kandidater som nye prognostiske biomarkører og kraftfulde værktøjer til tidlig diagnosticering af kræft [17]. I denne undersøgelse fandt vi, at miR-23b var prædiktiv for samlet overlevelse sådan, at patienter med højere miR-23b udtryk havde længere samlet overlevelse sammenlignet med patienter med lav miR-23b udtryk. MicroRNA-23b udtryk var også i stand til at skelne maligne fra normale væv indikerer den diagnostiske betydning af miR-23b i blærekræft selvom der kræves yderligere undersøgelser med et større kohorte af vævsprøver.

En væsentlig hindring for forståelsen miRNA-funktion har været den relative mangel på eksperimentelt validerede targets. For at bestemme effektorer af miR-23b, i-silico algoritmer og funktionelle analyser identificerede Zeb1 som sit mål. Vi viste, at miR-23b direkte rettet mod 3’UTR af Zeb1, som dens overekspression var forbundet med undertrykkelse af luciferaseaktivitet. Desuden blev en signifikant nedregulering i niveauet af Zeb1 protein observeret efter MIR-23b overekspression, hvilket indikerer post-transkriptionel regulering af Zeb1 via målrette sin 3’UTR. Funktionelle analyser udføres efter Zeb1 tømt af siRNA transfektion efterlignede de opnåede resultater med miR-23b overekspression. Disse resultater indikerer, at virkningerne af MIR-23b i blærekræft er dels ved direkte målretning Zeb1, selv om andre mål også kan være involveret, da microRNA kan målrette tusinder af gener. Zeb1 er en af ​​de afgørende regulatorer af epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) [18] og er blevet vist at spille en vigtig rolle i invasionen og metastase af epiteliale tumorer [19]. Relevansen af ​​ZEB proteiner til tumorprogression er blevet undersøgt i adskillige humane cancere. Ekspression af ZEB1 korreleret med en aggressiv fænotype i forskellige histologiske typer af endometrisk carcinom og blev påvist i sarcomatous rum for endometrisk carcinosarcoma [20]. I tyktarmskræft, blev ZEB1 udtryk på den invasive forsiden af ​​tumorer, i samarbejde med forbigående tab af basalmembraner [21]. Gensidig ekspression af ZEB1 og E-cadherin er også blevet observeret i ikke-småcellet lungekræft [22]. En direkte korrelation mellem ZEB1 immunreaktivitet og Gleason grad er blevet rapporteret i humane prostatatumorer [23] og i blærekræft, har ZEB1 blevet rapporteret at være overudtrykt og ansvarlig for øget motilitet [18]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at overekspression af MIR-23b resulterede i suppression af onkogen Zeb1 i blæren cancerceller antyder, at MIR-23b kan mediere EMT og udgør derfor en mulig mekanisme, gennem hvilken det påvirker blærekræft migration og invasion.

som konklusion, denne undersøgelse viser, at miR-23b har diagnostisk /prognostisk betydning og direkte rettet mod onkogen Zeb1 i blærekræft. miR-23b overekspression resulterede i undertrykkelse af blærekræft celledeling og invasion, inducere apoptose, og cellecyklusstop. Endelig er denne undersøgelse viser, at miR-23b overekspression kan være et terapeutisk nyttig strategi til behandling af blærekræft.

Tak

Vi takker Dr. Roger Erickson for hans støtte og bistand med udarbejdelsen af ​​manuskriptet.