Abstrakte
Vi her vurderet potentialet anti-kolorektal cancer aktivitet ved erastin, en spænding-afhængige anion kanal (VDAC) -bindende forbindelser. Vores
in vitro
undersøgelser viste, at erastin udøvede potente cytotoksiske virkninger mod flere humane kolorektale cancer cellelinjer, eventuelt via inducere oxidativt stress og caspase-9 afhængig celle apoptose. Endvidere blev mitokondrie permeabilitet overgang pore (MPTP) åbning observeret i erastin-behandlede cancerceller, som blev stiftet ved VDAC-1 og cyclophilin-D (CYP-D) forening, mitokondrie depolarisering, og cytochrom C frigivelse. Caspaseinhibitorer, ROS scavenger MnTBAP, og MPTP blokkere (sanglifehrin A, cyclosporin A og bongkreksyre) samt shRNA-medieret knockdown af VDAC-1, alle signifikant svækket erastin-induceret cytotoksicitet og apoptose i kolorektale cancerceller. På den anden side, over-ekspression af VDAC-1 augmented erastin-induceret ROS produktion, MPTP åbning, og kolorektal cancer celle apoptose.
In vivo
undersøgelser viste, at intraperitoneal injektion af erastin på veltolereret doser dramatisk hæmmet HT-29 xenograft vækst i svær kombineret immundefekt (SCID) mus. Tilsammen viser disse resultater, at erastin er cytotoksisk og pro-apoptotiske til colorektale cancerceller. Erastin kan undersøges nærmere som et nyt anti-kolorektal cancer middel
Henvisning:. Huo H, Zhou Z, Qin J, Liu W, Wang B, Gu Y (2016) Erastin forstyrrer mitokondrier permeabilitet Transition Pore (MPTP ) og inducerer Apoptotisk død Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 11 (5): e0154605. doi: 10,1371 /journal.pone.0154605
Redaktør: Cong Cao, Suzhou Universitet, KINA
Modtaget: 23. marts 2016 Accepteret: 16. april, 2016 Udgivet: 12. maj 2016
Copyright: © 2016 Huo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Science grundlaget for den niende Folkets Hospital tilknyttet Shanghai Jiao tong University School of Medicine (nr 2.015.521, til YG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
kolorektal cancer er den største bidragyder af kræft dødelighed både i Kina [1] og i hele verden [2,3]. Det anslås, at over 100.000 nye tilfælde af kolorektal cancer diagnosticeres hvert år, som forårsager mere end 50.000 dødsfald årligt [4]. Kemoterapi er blevet bredt anvendt til behandling af kolorektal cancer, men lægemiddelresistens og /eller off-target toksicitet begrænse effektiviteten af de nuværende kemo-stoffer [5,6,7]. Således er vores gruppe [8,9] og andre [10,11] har fokus på udvikling af nye og mere effektive anti-kolorektale cancer.
Mitokondriel permeabilitet overgang pore (MPTP) er en multi- protein kanal kompleks liggende i mitokondrierne, hvis vigtigste funktion er at opretholde balancen i mitokondrie respiratoriske kæde [12]. MPTP primært sammensat af tre proteiner: herunder spændingsafhængig anion kanal (VDAC) i ud mitochondriemembran (OMM), adeninnukleotid translokatoren 1 (ANT-1) i den indre mitokondrielle membran (IMM) og matrix lokalisering cyclophilin-D ( Cyp-D) [12]. Det har vist sig, at flere stimuli vil fremkalde ANT-1 og Cyp-D forening og MPTP åbning, hvilket fører til reaktive ilt arter (ROS) produktion, ATP udtynding og pro-apoptotiske molekyle (
jeg
.
e
. cytochrom c) frigivelse [12,13]. Derefter caspaser (hovedsagelig caspase-9) og celle apoptose aktiveres [12,13].
Nylige undersøgelser har identificeret en første-in-class VDAC-bindende lille molekyle, nemlig erastin [14,15] . Det har vist sig, at erastin er selektivt cytotoksisk over for visse cancer cellelinjer [14,15,16,17]. F.eks Yagoda et al., Viste, at erastin binder til VDAC, hvilket resulterer i letale oxidative skader på cancerceller [18]. Den potentielle rolle erastin i kolorektal cancer celler og underliggende signalsystemer mekanismer er ikke undersøgt. I den aktuelle undersøgelse, viste vi, at erastin var cytotoksisk og pro-apoptotiske til kolorektal cancer celler, eventuelt via forstyrre MPTP.
Materialer og metoder
2.1. Celledyrkning
Som beskrevet [8,9], kolorektale cancer cellelinjer, herunder HT-29, DLD-1 og Caco-2, blev købt fra cellen bank kinesiske Academy of Science (CAS) Shanghai Biologisk Institute (Shanghai, Kina). Celler blev holdt i FBS-holdigt RPMI /DMEM-medium. Menneskelig NCM460 kolon epitelial cellelinje blev leveret af Fudan IBS Cell center (Shanghai, Kina). Celler blev dyrket i Hams F12 næringsmedium (Gibco) [19].
2.2. Reagenser og kemikalier
Erastin blev købt fra Selleck (Shanghai, Kina). MPTP blokkere herunder sanglifehrin A blev cyclosporin A og bongkreksyre indkøbt fra Sigma (Shanghai, Kina). Antioxidanten MnTBAP var også fra Sigma. Caspase-3 specifik inhibitor z-DEVD-fmk og caspase-9 specifik inhibitor z-LEHD-fmk blev indkøbt fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland). Alle antistoffer anvendes i denne undersøgelse blev opnået fra Santa Cruz Biotech (Shanghai, Kina).
2.3. MTT celleviabilitetstest
Celleoverlevelse blev målt ved 3- [4,5-dimethylthylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyltetrazoliumbromid (MTT, Sigma) assay [9]. Forskellige seeding densiteter blev optimeret ved begyndelsen af forsøgene.
2.4. Trypan blåfarvning assay
trypanblåt assay blev beskrevet i vores tidligere undersøgelser [9]. Kort fortalt, efter anvendt erastin behandling, antallet af døde (trypanblåt positive) celler blev talt. Den dødsfald-forhold (%) blev beregnet ud fra antallet af de trypanblåt farvede celler divideret med det samlede antal af cellerne.
2.5. Kolonidannelse assayet
Efter erastin behandling, celler (2 x 10
3) blev indledningsvis suspenderet i dyrkningsmedium med 0,25% agar (Sigma). Cellesuspensionen blev derefter beklædt på toppen af en forud størknet 0,25% agar på en 100 mm dyrkningsskål. Mediet blev udskiftet hver anden dag. Efter 10 dages inkubation blev overlevelse kolonier farves og manuelt tælles.
2.6. BrdU-inkorporering assay
Celler (3 × 10
3 per brønd) blev podet i plader med 96 brønde, efter anvendt behandling blev celleproliferationen vurderet via BrdU inkorporering ELISA kolorimetrisk assay (Roche, Indianapolis, IN ) med fabrikantens protokol. ELISA OD-værdien for behandlingsgruppe blev normaliseret med den for ubehandlede kontrolgruppe.
2.7. Cell apoptose assay gennem Annexin V farvning
Efter behandling blev celle apoptose detekteret af Annexin V FACS analyse som tidligere rapporteret [9]. Antallet af Annexin V farvede celler blev registreret.
2.8. Kvantificering af apoptose med enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA)
Som beskrevet [8,9], celleapoptosen ELISA Detection Kit Plus (Roche, Palo Alto, CA) blev anvendt til at kvantificere celle apoptose ifølge den producentens protokol.
2.9. Caspaseaktivitet assay
Efter behandling blev cytosoliske proteiner ekstraheret i den beskrevne buffer [8,9]. Tyve ug cytosoliske ekstrakter per prøve blev tilsat til caspase assaybuffer med substrater af caspase-3 /-8 /-9 (Roche, Shanghai, Kina). Frigivelsen af 7-amido-4- (trifluormethyl) coumarin (AFC) blev kvantificeret via et Fluoroskan ordning indstillet til en excitation værdi på 355 nm [8,9]. Resultaterne blev udtrykt som relative fluorescensenheder /ug protein.
2.10. Western blotting
Kort fortalt de portioner af 30 ug af lyserede proteiner af hver prøve blev separeret ved 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese og overført til PVDF-membraner (Millipore, Bedford, MA). Efter blokering blev membranerne inkuberet med det primære antistof natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med sekundært antistof i en time ved stuetemperatur. Bolten blev visualiseret ved ECL (forøget kemiluminescens) maskine. Hvert bånd blev kvantificeret via ImageJ software, og værdien blev normaliseret til hver lastning kontrol bånd.
2.11. Reaktive ilt arter (ROS) afsløring
Intracellulær ROS blev målt ved flowcytometri via dichlorofluorescin (DCF) oxidation assay. DCFH-DA træder passivt i celler og spaltes af ikke-specifikke cellulære esteraser og oxideret i nærvær af ROS. Efter behandling blev celler (3 x 10
5 per prøve) blev inkuberet med DCFH-DA (5 uM) i en time ved 37 ° C. Derefter blev cellerne vasket med PBS og opbevaret i 1 ml PBS, blev ROS fluorescens analyseret under anvendelse af ovenstående Fluoroskan system.
2.12. Påvisning af mitokondrie potentiel reduktion (ΔΨ
m)
Som beskrevet [20], den ΔΨ
m blev målt gennem JC-10 fluorescens farvestof. Når mitokondriepotentialet er faldende, vil monomert JC-10 dannes i cytosolen, som udviser grøn fluorescens [20]. Kort fortalt, efter anvendt erastin behandling blev celler farvet med 5 pg /ml JC-10 (Invitrogen) i 10 minutter, og detekteres straks på et Fluoroskan ordning indstillet til en excitation værdi på 485 nm [20].
2.13. Mitokondrie immunpræcipitering (mito-IP)
Celler blev trypsinbehandlet, og mitokondriske fraktioner blev fremstillet via en Mitokondrier /Cytosol Fraktionering Kit (BioVision, Shanghai, Kina) ifølge producentens instruktioner. To hundrede ug cellelysater fra mitokondriske fraktioner blev præ-clearet med 20 pi protein A /G PLUS-agarose (Santa Cruz) i 1 time. Supernatanten blev derefter roteret natten over med 0,25 ug anti-ANT-1 (Santa Cruz Biotech). Derefter blev lysaterne centrifugeret i 5 minutter ved 4 ° C i en mikro-centrifuge til fjernelse af ikke-specifikke aggregater. Protein A /G PLUS-agarose (35 pi) blev derefter tilsat til supernatanterne i 4 timer ved 4 ° C. Pellets blev vasket seks gange med PBS, resuspenderet i lysepuffer, og derefter analyseret ved Western blotting [20].
2.14. Stabil knockdown af VDAC-1 ved lentiviral shRNA
De to sæt lentivirus-pakket VDAC-1 korte hårnål RNA (shRNA-1 og shRNA-2, ikke-overlappende sekvenser) blev udformet, syntetiseret og verificeret af Genechem (Shanghai, Kina). Ti pi /ml lentivirale partikler blev tilsat til HT-29-celler i 12 timer. Derefter blev lentivirus medium erstattet med komplet medium, og cellerne blev dyrket i yderligere 24 timer. Bagefter puromycin (5,0 ug /ml, Sigma) blev tilsat for at vælge resistente stabilt kolonier i 2-3 uger. Ekspression af VDAC-1 blev påvist ved Western blotting. Kontrol celler blev behandlet med scramble non-sense shRNA lentivirale partikler (Santa Cruz Biotech).
2,15 Over-ekspressionen af VDAC-1 og stabilt celler udvælgelse
fuld længde human VDAC-1 cDNA, købt fra Genechem (Shanghai, Kina), var sub-klonet ind pSUPER-puro-flag (en gave fra Dr. Bi Lab) [21]. Den tomme vektor (pSUPER-puro-flag) eller VDAC-1-udtrykkende konstruktion blev transficeret ind HT-29 celler via Lipofectamine 2000 protokol (Invitrogen). De stabilt kloner blev selekteret via puromycin (5 ug /ml). Efter 12-14 dages selektion, stabilt celler blev udsat for Western blotting assay af VDAC-1-ekspression.
2.16.
In vivo
antitumor effekt evaluering
tumorvækst blev udført i svær kombineret immundefekt (SCID) mus xenograftmodel. Alle mus blev købt fra Animal Facility af Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (Shanghai, Kina). Kort fortalt, 2 × 10
6 levedygtige HT-29-celler i 100 pi vækstmedium (per mus) blev subkutant inokuleret, og mus med ~ 100 mm
3 tumorer blev tilfældigt opdelt i tre grupper med 10 mus pr gruppe . Mus blev behandlet dagligt med 10 eller 30 mg /kg legemsvægt af erastin (intraperitoneal injektion, i 4 uger) eller vehikelkontrol (saltvand). Tumorvolumener blev beregnet ved den modificerede ellipsoide formel: (π /6) × AB
2, hvor A er den længste, og B er den korteste vinkelrette akse i en tumormasse [22,23]. Mus legemsvægte blev også registreret hver uge. Humane endepunkter blev altid anvendt til at minimere mus lidelser. Dyrene blev observeret på daglig baser. Tegn såsom betydelig reduceret bevægelse, svær diarré, svær hårrejsning eller et pludseligt vægttab ( 20%) blev registreret. Hvis dyrene nåede disse endepunkter de blev aflivet ved afblødning under 2,2,2-tribromethanol anæstesi (4 mg /10 g legemsvægt, Sigma). Alle injektioner blev udført under 2,2,2-tribromethanol anæstesi metode. De dyreforsøg er blevet godkendt af Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) etiske komité (Kontaktperson: Dr. Jun Wang, 2.014.126).
2.17. Statistisk analyse
Alle data blev normaliseret til kontrolværdier for hvert assay og blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Data blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af en Scheffe F-testen ved anvendelse af SPSS 16.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL). Signifikans blev valgt som p 0.05.
Resultater
3.1. Erastin udøver cytotoksisk, men ikke cytostatiske effekter til dyrkede kolorektal kræftceller
For at teste erastin aktivitet på kolorektal cancer celle overlevelse blev HT-29 celler behandlet med stigende koncentrationer af erastin (0,1-30 uM). MTT assayet blev udført. Som vist i fig 1A, erastin potent inhiberede HT-29 celleoverlevelse, som blev påvist ved MTT OD reduktion. Erastin viste en dosisafhængig effekt (fig 1A), og 30 uM erastin viste den mest dramatiske effekt (Fig 1A). Erastin tog mindst 48 timer for at udøve betydelig cytotoksisk virkning i HT-29-celler (Fig 1A). Den cytotoksiske virkning af erastin blev også demonstreret ved trypanblåt-farvning-assay (fig 1B) og kolonidannelse assayet (fig 1C). Erastin (1-30 uM) behandling steget betydeligt antallet af trypanblåt-positive ( “døde”) HT-29-celler (Fig 1B), whiling faldende overlevelse HT-29 kolonier (Fig 1C).
Tyktarmskræft celler (HT-29, DLD-1 og Caco-2 linier) eller NCM460 kolonepitelceller blev behandlet med vehikelkontrol (0,1% DMSO, “Ctrl”) eller angivne koncentrationer af erastin til anvendt tid, blev celleoverlevelse testet ved MTT-assay (A og E) og kolonidannelse assayet (C); Procentdelen af trypanblåt-positive ( “døde” celler) blev registreret (B); Celleproliferation blev testet ved BrdU-inkorporering assay (D og F). For hvert assay, n = 5. Dataene præsenteret blev middelværdi ± SD. Forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater opnået. * P 0,05 over gruppen af ”Ctrl”.
Interessant erastin (1-30 uM) syntes ineffektive ved inhibering HT-29-celleproliferation, og BrdU-inkorporering blev ikke ændret i HT-29-celler efter cytotoksisk erastin (1-30 uM) behandling (fig 1D). Derfor er usandsynlig på grund spredning hæmning den cytotoksiske effekt ved erastin. MTT resultater i fig 1E viste, at erastin (1-30 uM) blev også cytotoksisk for to andre kolorektal cancer cellelinjer: DLD-1 og CaCo2. Men samme erastin behandling var generelt sikkert at de ikke-kræft NCM460 kolonepitelceller (Fig 1E). Igen blev BrdU-inkorporering, indikatoren af celleproliferation, ikke påvirket af erastin (10 uM) i DLD-1 og CaCo2 celler, ej heller i NCM460 epitelceller (Fig 1F). Baseret på disse resultater, viser vi, at erastin udøver cytotoksisk, men ikke cytostatisk, aktivitet til dyrkede kolorektal kræftceller.
3.2. Erastin inducerer ROS produktion og caspase-afhængig apoptose i dyrkede kolorektal kræftceller
Dernæst vi evaluerede den potentielle aktivitet af erastin på celle apoptose. Som beskrevet i vores tidligere undersøgelser [8,9], blev forskellige apoptoseassays udført. Caspase assayresultater viste, at aktiviteten af caspase-3 og caspae-9 blev signifikant forøget i HT-29-celler efter cytotoksisk erastin (1-30 pM) behandling (Fig 2A), hvilket indikerer mitokondrie apoptose-aktivering [24]. På den anden side, aktiviteten af caspase-8, en indikator for ydre apoptosecyklus aktivering [25,26], var uændret i erastin-behandlet HT-29-celler (fig 2A). Cell apoptose aktivering ved erastin blev også bekræftet af Annexin V FACS assay (Fig 2B) og histon DNA apoptose ELISA-assay (fig 2C). Erastin dosisafhængigt øget Annexin V procent og histon-DNA ELISA OD i HT, 29 celler (Fig 2B og 2C).
tyktarms cancerceller (HT-29, DLD-1 og Caco-2 linier) eller NCM460 kolonepitelceller blev behandlet med vehikelkontrol (0,1% DMSO, “Ctrl”) eller angivne koncentrationer af erastin for anvendt tid, blev celle apoptose undersøgt af børsnoterede assays (AC, G og H); ROS produktion blev også undersøgt (D og I). HT-29-celler blev forbehandlet med z-DEVD-fmk ( “zDEVD”, 50 uM), z-LEHD-fmk ( “zLEHD”, 50 uM) eller MnTBAP (10 uM) i 1 time før anvendelse erastin stimulation , celleoverlevelse og celledød blev testet ved MTT-assayet (E) og trypanblåt assay (F) hhv. For hvert assay, n = 5. Dataene præsenteret blev middelværdi ± SD. Forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater opnået. * P 0,05 over gruppen af ”Ctrl”.
# p 0,05 over gruppen af erastin kun (E og F).
Da erastin er en VDAC-bindende forbindelse, som kan forstyrre mitokondrie respiratoriske kæde og forårsage ROS produktion [18]. Dernæst testede oxidativt stress niveauet i erastin-behandlet HT-29-celler. Resultater i figur 2D viste klart, at erastin øget niveau af ROS i HT-29 celler. For at undersøge rollen af apoptose og ROS-produktion i erastin-induceret cytotoksicitet blev forskellige farmakologiske inhibitorer anvendes. Som vist i fig 2E og 2F, caspase-3 specifik inhibitor z-DEVD-fmk, caspase-9 specifik inhibitor z-LEHD-fmk, eller superoxid-scavenger MnTBAP [27] alle lindres erastin-induceret cytotoksicitet i HT-29 celler (fig 2E og 2F). I to andre kolorektale cancercellelinjer, erastin (10 uM) også induceret caspase-9 (fig 2G) og apoptose (fig 2H) aktivering samt ROS-produktion (fig 2I). Sådanne effekter ved erastin blev igen ikke set i colon epitel NCM460 celler (Fig 2G-2i). Derfor erastin inducerer ROS produktion og caspase-afhængig apoptose i kolorektale cancerceller.
3.3. Erastin inducerer MPTP åbning i dyrkede kolorektal kræftceller
Da erastin er en VDAC-bindende forbindelse [18], blev status for MPTP i erastin-behandlede kolorektal kræftceller derefter vurderet. Første, mitokondriel immunpræcipitering (Mito-IP) assay [28,29] viste, at ANT-1 og CYP-D dannet et kompleks i erastin-behandlet HT-29-celler (Fig 3A), som er kendt som det første trin af MPTP åbning [12,13]. For det andet blev niveauet af cytosol cytochrom C også steget i HT-29 celler efter erastin behandling (Fig 3B), som er en kendt hændelse efter MPTP åbning [12,13]. Endvidere er forhøjelsen af JC-10 grøn fluorescensintensitet angivet tab af mitokondriepotentiale (^ m) (fig 3C). Alle disse resultater viste klart, at MPTP åbning efter erastin behandling i HT-29-celler. Bemærk, at lignende resultater ved erastin blev også opnået i andre to kolorektale cancer cellelinjer (data ikke vist).
HT-29 celler blev behandlet med anvendt erastin for angivne tid, blev MPTP åbning fremgår af mitokondrie VDAC-1 -ANT-1 association (A), cytochrom C ( “Cyto-C”) frigivelse (B) og JC-10 intensitet stigning (C). HT-29-celler blev forbehandlet med sanglifehrin A (SFA, 2,5 uM), cyclosporin A (CsA, 0,5 uM) eller bongkreksyre (BA, 5 pM) før erastin (10 uM) behandling, celleoverlevelse (D) og apoptose (E) blev analyseret bagefter. Stabilt HT-29 celler, der udtrykker VDAC-1 shRNA-1 /-2 eller scramble kontrol shRNA ( “SCR shRNA”) blev behandlet med erastin (10 uM), VDAC-1 ekspression (F), celleoverlevelse (G) og apoptose ( H) blev testet. ANT-1-assocaited Cyp-D (A), cytosol cytochrom C ekspression (B) og VDAC-1 ekspression (F) blev kvantificeret. For hvert assay, n = 4. De viste data var gennemsnit ± SD. Forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater opnået. * P 0,05 over gruppen af ”Ctrl”.
# p 0,05 over gruppen af erastin kun (D og E) eller “SCR shRNA” gruppe (G og H). “Trans” står for transfektion kontrol (FH).
For at undersøge betydningen af MPTP i erastin-forårsaget cytotoksicitet, vi anvendes flere kendte farmakologiske MPTP blokkere, herunder sanglifehrin A (SFA) [30], cyclosporin A (CsA) [31] og bongkreksyre (BA) [28,32]. Som påvist, forbehandling med disse MPTP blokkere væsentligt svækket erastin-induceret HT-29 celledød (Fig 3D) og apoptose (fig 3E). For yderligere at understøtte vores hypotese, var shRNA strategi anvendt til selektivt og stabilt knockdown VDAC-1, den nøglekomponent i MPTP og bindende protein erastin [12]. To Stabilt HT-29, der udtrykker distinkt VDAC-1 shRNAs (-1 /-2) blev fastsat (fig 3F). Vigtigere, blev erastin-induceret cytotoksicitet (Fig 3G) og apoptose (fig 3H) inhiberede signifikant i VDAC-1-tavshed HT-29-celler. Disse farmakologiske og genetiske beviser tyder på, at erastin-induceret cytotoksicitet mod kolorektal cancerceller kræver VDAC-1 binding og efterfølgende MPTP åbning.
3.4. VDAC-1 overekspression potenserer erastin s cytotoksicitet
For yderligere at understøtte den centrale rolle, VDAC-1 i erastin-induceret cytotoksicitet, vi eksogent udtrykte VDAC-1 i HT-29 celler. Western blotting-resultater i fig 4A bekræftet VDAC-1 overekspression i stabilt HT-29-celler med VDAC-1-konstruktionen. Som følge heraf blev erastin-induceret levedygtighed reduktion (fig 4B) og apoptose (fig 4C) augmented. Yderligere undersøgelser viste, at overekspression af VDAC-1 lettet erastin-induceret ROS-produktion (fig 4D) og JC-10 OD stigning (indikatoren MPTP åbning, Fig 4E). Interessant nok viste vi, at NCM460 kolonepitelceller udtrykt lavt niveau af VDAC-1 (fig 4F). Men når vi overudtrykt VDAC-1 i NCM460 celler (Fig 4F), disse celler blev udsat for erastin (Fig 4G). Derfor er disse resultater bekræfter endvidere, at VDAC-1 er en afgørende faktor for erastin aktivitet.
stabilt HT-29 celler eller NCM460 kolon epitelceller udtrykker tom vektor (pSUPER-puro, “Vec”) eller VDAC-1 cDNA ( “VDAC-1”) blev behandlet med designet erastin for anvendt tid, VDAC-1-ekspression, celleoverlevelse og apoptose blev testet ved Western blotting assay (A og F), MTT assay (B og G) og histon-DNA ELISA-assay (C), henholdsvis; blev også analyseret ROS-produktion (D) og JC-10 intensitet (E). For hvert assay, n = 4. De viste data var gennemsnit ± SD. Forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater opnået. VDAC-1-ekspression blev kvantificeret (F) * p 0,05 over Ctrl gruppe af “Vec” celler (B-E).
# p 0.05 vs. erastin gruppe af “VEC” celler (B-E). “Trans” står for transfektion kontrol (D og E).
3.5. Erastin administration undertrykker HT-29 xenograft vækst i SCID-mus
in vivo
aktivitet ved erastin blev også testet. SCID-mus HT-29 xenograft-modellen blev anvendt. Den ugentlige tumor vækstkurve resultater i fig 5A viste, at erastin intraperitoneal injektion dramatisk inhiberede HT-29 xenograft vækst i SCID-mus. Erastin s
in vivo
aktivitet var igen koncentrationsafhængig. Erastin ved 30 mg /kg var klart mere potent end 10 mg /kg til undertrykkelse HT-29 xenotransplantater (figur 5A). Det skal bemærkes, at de mus legemsvægt var ikke signifikant forskellige mellem de enkelte grupper (Fig 5B). Heller gjorde vi bemærker nogen tegn på tilsyneladende toksicitet i disse mus. Disse resultater viste, at disse dyr blev veltolereret til erastin regimer her. Endvidere tumor daglig tilvækst, beregnet som mm
3 /dag, blev reduceret med erastin administration (Fig 5C). Ved slutningen af eksperimenterne, vægtene af erastin-administreres xenotransplantater var også meget lavere end den for køretøjets kontrolmus (Fig 5D). Disse resultater viste, at erastin administration inhiberer HT-29 tumorvækst
in vivo
.
HT-29 tumorbærende SCID-mus blev intraperitonealt administreret med erastin (10/30 mg /kg legemsvægt eller ” bw “, dagligt, i 4 uger) eller vehikel (saltvand) kontrol, tumorvolumener (A) og mus legemsvægte (B) blev registreret ugentligt i fem uger; Daglig tumorvækst blev også beregnet (C). Ved afslutningen af forsøgene, alle xenotransplantater blev isoleret og vejet (D). For hvert assay, n = 10. De viste data var gennemsnit ± SD. Forsøg blev gentaget to gange med lignende resultater opnået. * P 0,05 vs. gruppe af “køretøj”.
# p 0,05 vs. gruppe af erastin på 10 mg /kg legemsvægt.
Diskussion
I den foreliggende undersøgelse, vi viste, at erastin udøvede potent cytotoksisk virkning mod flere humane kolorektal kræftceller eventuelt via induktion oxidativ stress og caspase-9 afhængig celle apoptose. MPTP åbning blev observeret i erastin-behandlede cancerceller, som blev stiftet ved VDAC-1 og Cyp-D forening, mitokondrie depolarisering og cytochrom C frigivelse. Caspaseinhibitorer, ROS scavenger MnTBAP, og MPTP blokkere (sanglifehrin A, cyclosporin A og bongkreksyre) samt shRNA-medieret knockdown af VDAC-1, alle signifikant svækket erastin-induceret cytotoksicitet og apoptose i kolorektale cancerceller. På den anden side, over-ekspression af VDAC1 forstærket erastin s cytotoksicitet. Baseret på disse resultater, foreslår vi, at erastin binder til VDAC1 at forstyrre normal mitochondriel funktion, der forårsager MPTP åbning, og i sidste ende fører til caspase-9-afhængig apoptose aktivering i kolorektale cancerceller.
Det skal bemærkes, at erastin var ikke-cytotoksisk for NCM460 kolonepitelceller. Vi undlod også at opdage nogen væsentlig caspase-9-aktivering eller MPTP dysfunktion i erastin-behandlede NCM460 celler. En mulig årsag kan være, at disse ikke-kræft epitelceller udtrykker meget lavt niveau af VDAC (-1), derfor celler ikke målrettet efter erastin (se figur 4). Som en kendsgerning, når vi exogent overudtrykt VDAC-1 i NCM460 celler, disse celler, ligesom kræftceller, blev udsat for erastin (se figur 4). En anden mulighed er, at kræftceller er alle hurtige voksende celler, som muligvis kræver høj grad af mitokondrie respiratoriske kæde til at producere ATP. Disse celler kan være mere følsomme over for VDAC eller MPTP forstyrrelser. Det faktum, at erastin kun retter sig mod kræftceller indikerer, at det kunne være en ideel kandidat for anti-cancer behandling.
Selv om flere undersøgelser har undersøgt den potentielle anti-cancer aktivitet ved erastin
in vitro
[ ,,,0],14,16,33],
in vivo
beviser mangler stadig. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at intraperitoneal injektion af erastin ved godt tolererede doser (10 eller 30 mg /kg, dagligt) dramatisk inhiberede HT-29 xenograft vækst i SCID-mus. Vigtigere er det,
in vivo
erastin regimer påvirkede ikke mus vægte, eller introducerede eventuelle væsentlige toksiciteter til forsøgsdyrene. Disse prækliniske resultater antyder, at erastin kunne være en lovende anti-kolorektal cancer middel.
Konklusioner
Sammenfattende erastin forstyrrer MPTP og inducerer apoptotisk død kolorektal kræft celler. Erastin kan undersøges nærmere som et nyt anti-kolorektal cancer middel.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.