PLoS ONE: Udsættelse for bisphenol A korrelerer med tidlig debut prostatakræft og Fremmer centrosom Amplification og Anchorage-Uafhængig vækst i Vitro

Abstrakt

Menneskelig udsættelse for bisphenol A (BPA) er allestedsnærværende. Dyreforsøg viste, at BPA bidrager til udvikling af prostatakræft, men humane data er knappe. Vores undersøgelse undersøgte sammenhængen mellem urin BPA niveauer og Prostatacancer og vurderede virkningerne af BPA på induktion af centrosom abnormiteter som en underliggende mekanisme fremme prostata carcinogenese. Undersøgelsen, der omfatter 60 urologiske patienter, fundet højere niveauer af urin BPA (kreatinin-justeret) i Prostata kræftpatienter (5,74 pg /g [95% CI, 2,63, 12,51]) end hos ikke-Prostata kræftpatienter (1,43 mg /g [95% CI, 0,70, 2,88]) (

s

= 0,012). Forskellen var endnu mere markant hos patienter 65 år. En tendens mod en negativ sammenhæng mellem urin BPA og serum PSA blev observeret i prostatacancerpatienter men ikke i ikke-prostata kræftpatienter.

In vitro

studier undersøgte centrosomal abnormiteter, mikrotubuli nukleær og forankringsuafhængig vækst i fire prostatakræft-cellelinier (LNCaP, c4-2, 22Rv1, PC-3) og to udødeliggjort normale prostata epitelial cellelinjer (NPrEC og RWPE-1). Eksponering for lave doser (0,01-100 nM) på BPA øgede procentdelen af ​​celler med centrosom forstærkning to- til otte gange. Dosis respons enten toppet eller nåede plateauer med 0,1 nM BPA eksponering. Denne lav dosis fremmes også mikrotubuli nukleering og genvækst på centrosomer i RWPE-1 og forbedret forankringsuafhængig vækst i c4-2. Disse resultater tyder på, at urin BPA niveau er en uafhængig prognostisk markør i Prostatakræft og at BPA eksponering kan sænke serum PSA niveauer i Prostata kræftpatienter. Desuden kan afbrydelse af den centrosom overlapning cyklussen ved lavdosis BPA bidrage til neoplastisk transformation af prostata

Henvisning:. Tarapore P, Ying J, Ouyang B, Burke B, Bracken B, Ho SM (2014) Udsættelse for bisphenol A korrelerer med tidlig debut prostatakræft og Fremmer centrosom Amplification og Anchorage-Uafhængig vækst

In vitro

. PLoS ONE 9 (3): e90332. doi: 10,1371 /journal.pone.0090332

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: November 25, 2013; Accepteret: 30 Jan 2014; Udgivet: 3 marts 2014

Copyright: © 2014 Tarapore et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra National Institutes of Health (P30-ES006096, U01-ES019480, U01-ES020988), en Veterans Administration Merit Award (I01-BX000675), en intern finansieringskilde fra University of Cincinnati til SMH og PT og en Congressionally Directed Medical Research Program forsvarsministerium Award (PC094619) til PT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den anden mest almindelige malignitet blandt mænd i Nordamerika. Aldring er en veletableret risikofaktor for PCa [1]. En ud af seks mænd vil udvikle PCa løbet af deres levetid; dog kræft sjældent diagnosticeres hos mænd 40 år, med næsten to tredjedele tilfælde rapporteret [2], [3] hos mænd på 65 år fra 2006 til 2010 var den gennemsnitlige alder ved diagnose var 66 år efter statistikken fra National Cancer Institute Surveillance Epidemiologi og slutresultater Studier (2013) [4]. Større andre end alder medvirkende faktorer er race og familiens historie [1], mens lidt om virkningen af ​​hormonforstyrrende stoffer på PSA.

Bisphenol A (BPA) er en organisk forbindelse med den kemiske formel (CH

3)

2C (C

6H

4OH)

2. BPA bruges til at gøre polycarbonat plast og epoxyharpikser, som er til stede i tusindvis af forbrugerprodukter [5], [6]. I USA, eksponering for BPA er udbredt på over 90% i den almindelige befolkning [7]. Dermal absorption, indånding, og indtagelse af forurenet mad og vand er de vigtigste eksponeringsveje [8]. Som et hormonforstyrrende stof, der efterligner østrogen og skjoldbruskkirtel hormon, BPA fungerer også som en metabolisk og immun disruptor. Således de sundhedsskadelige virkninger af BPA er omfattende [9], [10], og højere niveauer af BPA eksponering korrelerer med øget risiko for hjerte-kar-sygdomme, fedme, diabetes, immunsygdomme, og et væld af reproduktive dysfunktioner [11], [ ,,,0],12], [13]. Desuden

in vitro Salg og dyreforsøg har vist, at BPA eksponering kan øge risikoen for mælkekirtlen, hjerne, og prostatacancer [9]. Men humane undersøgelser forbinder BPA eksponering for forhøjet risiko kræft er knappe. En sådan undersøgelse i Kina viste, at forekomsten af ​​meningeom var 1,6 gange højere i voksne med højere koncentrationer af BPA i urinen end i dem med lavere koncentrationer [14]. Lignende undersøgelser til PCA har ikke været tilgængelige indtil nu.

En centrosom omfatter et par cylindriske strukturer, der kaldes

centrioler

omgivet af pericentriolar materiale. Centrosomer er involveret i tilrettelæggelsen af ​​mellemfasen mikrotubuluscytoskelettet, mitosespindler, og cilier. Centrosom dysfunktion (antal og integritet), et kendetegn for mange cancertyper, menes at initiere neoplastisk transformation og fremme sygdomsprogression [15], [16]. En unormal antal centrosomer kan resultere i mono- eller multipolær mitose, hvilket fører til øget aneuploidi [15], [16]. En anden funktion i centrosomal forstyrrelser er abnormiteter i mikrotubuli (MT) nukleation og forankring. Sådanne abnormiteter blev observeret hyppigere i brystkræftceller end i normale bryst epitelceller [15], [16]. Også et stort antal gener, der er forbundet med øget PCa risiko er i veje, der fører til centrosom dysfunktion [17], [18]. Disse observationer har fået os til at undersøge, i cellebaserede modeller, de negative virkninger af BPA på centrosom cyklus som en mekanisme, der bidrager til prostata carcinogenese.

Vi brugte et tværsnit klinisk undersøgelse for at undersøge sammenhængen mellem BPA eksponering og PCa. Vi antager, at BPA spiller en rolle i prostata carcinogenese. Vi fandt, at patienter med PCa er mere tilbøjelige end dem uden PCa at have højere niveauer af BPA i deres urin. Vi observerede en tendens til en negativ sammenhæng mellem urin BPA og serum PSA niveauer i PCA patienter. Vi udførte

in vitro

undersøgelser for at vurdere effekterne af BPA på centrosom nummer, dannelsen af ​​MT asters, og kolonisering i blød agar i to udødeliggjort normale prostata epiteliale cellelinier (RWPE-1 og NPrEC) og fire PCA cellelinier (LNCaP, c4-2, 22Rv1, PC-3). Vi fandt, at den procentdel af celler med centrosom amplifikation (CA) steg som reaktion på lav dosis BPA eksponering og at forholdet var ikke-monoton for de fleste cellelinjer. Endvidere eksponering til lavdosis BPA fremmes MT aster organisation i ikke-kræft RWPE-1 og forøget forankringsuafhængig vækst i androgen-uafhængige c4-2 PCa cellelinie. I aggregat, disse resultater afslører en hidtil ukendt sammenhæng mellem BPA eksponering og PCa og foreslå en mekanisme, der ligger til grund rolle BPA i neoplastisk transformation og sygdomsprogression.

Materialer og Metoder

Patienter og indsamling af urinprøver

Patienter blev rekrutteret fra den urologiske klinik på University of Cincinnati Medical center under en protokol godkendt af University of Cincinnati Institutional Review Board. Tabel 1 viser patientkarakteristika og diagnostiske oplysninger. Efter underskrivelsen et informeret samtykke formular, patienter gennemgik en digital rektal undersøgelse og blev bedt om at give en 20- til 50-ml urinprøve før deres planlagte ultralyd-vejledt prostata biopsi. Alle procedurer i denne undersøgelse blev godkendt af University of Cincinnati Institutional Review Board. Urinprøver blev centrifugeret blev sedimenter indsamles for et PCA biomarkør undersøgelse [19], og supernatanterne blev opbevaret i portioner ved -80 ° C i BPA-analyse. Blandt de 60 prøver, der anvendes til denne undersøgelse, 27 var fra patienter med PCa (PCA) og 33 var fra patienter uden PCa (ikke-PCA).

Måling af BPA i urinprøver

BPA niveauer i prøverne blev bestemt i laboratoriet af Organic Analytisk Kemi i Wadsworth center, New York State Department of Health, (Albany, NY). Højtydende væskekromatografi (HPLC) koblet med elektrospray triple-kvadrupol massespektrometri (ESI-MS /MS) blev anvendt til at kvantificere BPA, en teknik svarende til den tidligere beskrevne, med visse ændringer [20], [21]. Kort fortalt blev 500 pi af hver urinprøve blandet med 1 ml glucuronidase (2 pl /ml) i fordøjelse og ekstraktion. For kvalitetskontrol, 5 ng

13C

12-BPA blev sat til hver blanding. Ekstrakter blev påført på en Agilent 1100 series HPLC interface med et Applied Biosystems API 2000 elektrospray MS /MS (Applied Biosystems, Foster City, CA) til kvantitativ af BPA. Data blev erhvervet ved hjælp af multiple-reaktion overvågning af overgangene af 227 212 for BPA, og 239 224 for

13C

12-BPA. Grænseværdien minimum detektion (MDL) af BPA i denne protokol var 0,05 ng /ml. For koncentrationer under MDL, blev en værdi svarende til den MDL divideret med kvadratroden af ​​2 anvendes i statistiske undersøgelser [22]. Rapporterede koncentrationer blev korrigeret for genfindelse af surrogat standard (isotop fortynding metode). Den BPA standard tilsat til udvalgte prøvematricer og passerede gennem hele analytiske fremgangsmåde gav en tilbagebetaling af 88% ± 8% (middelværdi ± SD). En ekstern kalibreringskurve blev fremstillet ved at injicere 10 pi 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 50 og 100 ng /ml standarder, og regressionskoefficienten var 0,99.

Normalisering af urin BPA

urin kreatinin niveauer blev brugt til at justere for variation i fortynding og at bestemme gyldigheden af ​​en urinprøve spot til vurdering kemisk eksponering [23]. En kreatinin (urin) assaykit fra Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI) blev anvendt ifølge producentens protokol til måling urin kreatinin niveauer. De kreatinin niveauer blev brugt til at justere urinen koncentrationer af BPA målt ved HPLC-ESI-MS /MS for at få den “kreatinin-justeret” BPA niveauer (BPA niveauer) i mg /g.

Celler

PCA cellelinjer PC-3, LNCaP, c4-2, og 22Rv1 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket under standard, anbefales, betingelser. En beskrivelse af oprindelsen af ​​den immortaliserede normal prostata epitelial NPrEC cellelinje er blevet offentliggjort [24]; den anden immortaliseret normal prostata epitelial cellelinje, RWPE-1, blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA) og blev dyrket i defineret keratinocyt-SFM-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) med vækstfremmende supplement. Cellekulturer blev holdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator med en CO 5%

2 atmosfære.

BPA behandlinger

Celler fra hver cellelinje blev podet i seks-brønds plader med dækglas på 25.000 celler /brønd. Efter 24 timer blev mediet ændret til phenolrødt-frit medium med 10% trækul-strippet serum i yderligere 24 timer, på hvilket tidspunkt BPA blev tilsat for at opnå en slutkoncentration på 0, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM eller 100 nM. Forsøget blev gentaget fem gange for at generere en i alt fem prøver pr cellelinje pr BPA koncentration.

Indirekte immunofluorescens

I immunfarvning af centrosomer blev celler fikseret med methanol i 5 minutter ved -20 ° C og derefter bearbejdet for γ-tubulin (klon GTU88 antistof, Sigma Immunochemicals), α-tubulin (klon DM1A, Sigma Immunochemicals), og centrin (sc-50.452, Santacruz Biotechnology) farvning som tidligere beskrevet [25]. Kort fortalt blev celler ekstraheret i 1% NP-40 i PBS i 10 min. Celler blev probet med primære antistoffer og antistof-antigen-komplekser blev detekteret med Alexa Fluor 488- eller 594-konjugerede antistoffer (Molecular Probes). Celler blev også farvet for DNA med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, Invitrogen). Immunofarvede celler blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi.

mikrotubulus (MT) aster dannelse assay

Virkningen af ​​BPA på mikrotubulusdynamik blev bestemt ved et assay af MT aster dannelse beskrevet tidligere [25]. Kort fortalt blev celler behandlet med nocodazol (1,5 ug /ml) i 40 min på is for at depolymerisere interfase MTS, vasket med PBS til fjernelse af nocodazol og inkuberet i frisk varm medium i 10 minutter ved 37 ° C for at give mulighed for MT genvækst .

Målinger

antallet af centrosomer per celle blev scoret af fluorescens mikroskopi. Mindst 150 celler blev undersøgt per behandling, og procentdelen af ​​celler med en unormal antal centrosomer beregnet ud fra det totale antal celler undersøgte blev anvendt som endepunkt for analysen. En væsentlig abnormitet i CA blev defineret som en celle med mere end to centrosomer. Salg

forankringsuafhængig vækst assay

Celler blev analyseret for forankringsuafhængig vækst ved at måle effektiviteten af ​​kolonidannelse i halvfast medium som beskrevet [26]. Kort fortalt blev celler dyrket under betingelserne beskrevet ovenfor, i nærvær eller fravær af 0,1 nM BPA, for ~ 10 passager. Vi valgte 0,1 nM, fordi denne koncentration inducerede den højeste procentdel af celler med CA for de fleste cellelinjer (se resultater). Ca. 2.500 celler /35 mm brønd blev indlejret i blød agar. Celler blev fodret to gange om ugen med frisk medium med og uden BPA. Efter 2-3 uger blev kolonier talt under et mikroskop. Eksperimenter blev udført tre gange og gentages to gange. Kolonidannende effektivitet er antallet af opnåede kolonier divideret med det totale antal udpladede celler, multipliceret med 100.

Statistisk analyse

Det primære mål i den kliniske analyse var en kontinuerligt variabel af urin BPA niveau efter normalisering eller justering for urin kreatinin niveau. Indledende inspektion af fordelingen viste, at denne variabel var højst drejes mod højre. Derfor blev sin log-transformerede variabel (LnBPA) anvendes som den afhængige variabel i de statistiske modeller. Den væsentligste statistiske model var en fast virkning model til at vurdere sammenhængen mellem LnBPA og PCa status (1 = ja; 0 = nej). Vi anvendte både ujusterede og justerede metoder til vores faste-effekt model. I den ujusterede metode, PCA status var det eneste uafhængige variabel. I den justerede metode, vi medtaget alder (stratificeret som alder ≥65 vs. 65 år) og serum PSA niveauer som kontrollerende kovariater. Vi udførte

post hoc

sammenligninger af midler mellem PCa og ikke-PCA patienterne og en lignende sammenligninger i delmængder af patienter stratificeret efter alder. Wilcoxon Rank Sum tests blev anvendt til at validere resultaterne fra de faste effektmodeller at sikre, at alle deres resultater var robust (data ikke vist). For urin BPA og andre numeriske uafhængige variable såsom serum PSA-niveauer blev relationer vurderes med lineære regressionsmodeller og /eller korrelationskoefficienter.

I

in vitro

analyser for hver cellelinje, vi brugte den faste effekt model til at vurdere sammenslutning af procentdelen af ​​celler med CA til BPA koncentration anvendes til behandling af cellerne og

post hoc

analyser justeret for multipel sammenligning ved hjælp af en Bonferroni test. De forankringsuafhængige vækst assay blev analyseret af to stikprøver

t

-tests. Alle statistiske tests blev udført med en SAS 9.3-software (SAS, Cary, NC) pakke.

P

-værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Urinary BPA-niveau er forbundet med PCa og kan have prognostisk værdi

Vi studerede 60 urologi patienter, 27 med PCa og 33 uden PSA. Gennemsnitsalderen (± standardafvigelse [SD]) af PCA patienter var 69,7 ± 10,3 år (min, 56 yr; maks. 87 år); de var ældre end ikke-PCA patienter, som var 62,8 ± 7,15 år (min 46 yr;.. max 77 år,

s

= 0,003). Serum PSA niveauer af PCa og ikke-PCA patienter var ikke anderledes. Den Gleason score på 71% af PCA patienterne var 6, og 7 i de andre. Deres baseline karakteristika er sammenfattet i tabel 1.

I alle fag (PCA og ikke-PCA), blev niveauer af urin BPA ikke er forbundet med alder og serum PSA og korrelerede ikke med Gleason score af kræft og kræft -relaterede karakteristika i PCA fag (tabel 2). Patienter med PCa havde højere niveauer af urin BPA (kreatin justeret), med et geometrisk gennemsnit på 5,74 [95% CI; 2,63, 12,51] gg /g (gennemsnit ± SD af LnBPA på 1,75 ± 1,97), hvorimod urin BPA niveauer af ikke-PCA patienter havde et geometrisk gennemsnit på 1,43 [95% CI; 0,70, 2,88] gg /g (gennemsnit ± SD af LnBPA på 0,35 ± 2,14;

s

= 0,012, Fig 1A . 1D). Stratificerede analyser viste, at den positive association var signifikant kun blandt de 30 urologiske patienter yngre end 65 (gennemsnit og median alder = 58 år, minimumsalder = 46 år). I de yngre patienter ( 65 år), det geometriske gennemsnit af urin BPA niveauer blandt PCA patienter var 8,08 [95% CI; 2,40, 27,15] ug /g (gennemsnit ± SD af LnBPA af 2,09 ± 1,71) vs. et geometrisk gennemsnit på 0,90 [95% CI; 0,36, 2,25] gg /g (gennemsnit ± SD af LnBPA af -0,11 ± 2,09) blandt ikke-PCA patienter (

s

= 0,006;. Figur 1B 1D). Desuden lineær regression analyser af denne yngre gruppe viste en tendens til en negativ sammenhæng mellem urin BPA niveauer og serum PSA koncentrationer i PCA patienter (n = 10, r = -0,52,

s

= 0,10), men ingen sådan tendens i ikke-PCA patienter (fig. 1C). Korrelationen nåede ikke signifikans på 5% niveau på grund af den lille stikprøve.

Urin BPA niveauer er forbundet med PSA. Log-transformerede BPA betegnes LnBPA. Værdier i grafen er gennemsnit ± SD af LnBPA. (A) Urin BPA er højere i PCA patienter end hos ikke-PCA patienter. Midler til LnBPA = 1,75 ± 1,97 i PCa (blå, n = 27) vs. 0,35 ± 2,14 i ikke-PCa (rød, n = 33),

s

= 0,012. (B) LnBPA i PCa vs. LnBPA i ikke-PCa, stratificeret efter alder = 65. Urin BPA niveauer er signifikant højere hos unge PCA patienter end i de respektive ikke-PCA patienter kun i aldersgruppen 65 år;

s

= 0,006. (C) Lineær regression analyser af Serum PSA vs. LnBPA patienter kun 65 år (n = 30). Blå udfyldte firkanter repræsenterer PCA patienter; røde inverse-cirkler repræsenterer ikke-PCA patienter. Blå og røde optrukne linjer repræsenterer deres regressionslinjer hhv. (D) Sammenligning af det geometriske gennemsnit af BPA i PCa og ikke-PCA-grupper. Den geometriske middelværdi (Geo) er defineret som den eksponentielle af gennemsnittet af LnBPA. Værdier er geometriske middel (95% CI) af BPA i enhed gg /g creatinin.

Lave doser af BPA forfremmet centrosom forstærkning (CA)

CA er almindeligt observeret i humane tumorer og er en væsentlig faktor, der bidrager til kromosom ustabilitet [15], [27]. Afhængigt af, om cellen er i G1 eller S /G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus, normale celler viser en eller to centrosomer hhv. Vi afgjort, om behandling celler med BPA ændret antallet af centrosomer, ved at behandle cellekulturer med stigende koncentrationer af BPA (0,01-100 nM) (fig. 2 og 3). Ubehandlede celler, der tjente som kontrol viste det forventede normale centrosom profil, hvor de fleste af cellerne ( 90%) indeholdt enten en eller to centrosomer (fig 3-I, paneler A, C, E, G, I, K. ). Det ubehandlede NPrEC havde færrest celler med centrosomal aberrationer (1,7%), efterfulgt af c4-2 (2,9%), LNCaP (3,5%), 22Rv1 (4,9%), RWPE-1 (7,3%), og PC-3 ( 10,4%) (Fig.2). I modsætning hertil alle cellelinier behandlet med BPA viste en stigning (to- til otte gange, tabel 3) i antallet af celler med tre eller flere centrosomer (fig. 2, fig. 3-I panelerne B, D, F, H, J, L). De dosis-respons-kurverne for de to ikke-kræft cellelinjer, NPrEC og RWPE-1, og to PCA cellelinjer, LNCaP og 22Rv1, afslører en ikke-monoton (bifasisk) respons forhold, og den maksimale respons med 0,1 nM BPA ( fig. 2). På den anden side, de to andre PCA linjer, c4-2 og PC-3, viste en stigende dosis-respons-kurve, der plateauer ved samme lave koncentration af BPA (0,1 nM) (fig. 2). Den immortaliserede ikke-kræft prostata epitelial cellelinje NPrEC-1, viste den højeste fold ændring (middel ± SD, 8,1 ± 2,4) i centrosom profil (tabel 3), hvilket antyder, at dets centrosom overlapning cyklus kan være mest følsomme over for virkningerne af lav -dose BPA om fremme af CA.

de cellelinier NPrEC, RWPE1, LNCaP, c4-2, 22Rv1, og PC3 blev behandlet med medium indeholdende 10% CSS plus 0, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM og 100 nM BPA i 72 timer. Celler blev fikseret med 100% kold methanol og immunfarvet for centrosomer og kerner. Antallet af centrosomer per celle blev scoret af fluorescensmikroskopi. Resultaterne er vist som et gennemsnit bestemmes ud fra fem separate forsøg. Scatter plot blev frembragt af procentdelen af ​​celler med en unormal antal centrosomer som reaktion på BPA. Analyser blev udført under anvendelse af en fixed effect model for hver cellelinie.

post hoc

sammenligninger af midler blev justeret ved hjælp af Bonferroni tests. Den fold ændring er procentdelen af ​​celler med unormale centrosomer på 0,1 nM BPA /procentdelen af ​​celler med unormale centrosomer ved 0 nM BPA.

(I) En stigning i centrosom tal. Cellelinierne NPrEC, RWPE1, LNCaP, c4-2, 22Rv1 og PC3 blev behandlet med medium indeholdende 10% CSS plus 0 eller 0,1 nM BPA i 72 timer. Celler blev fikseret med 100% kold methanol og immunfarvet for centrosomer (anti-γ-tubulin, rød) og kerne (DAPI, blue). Cellerne blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi. Pile peger på holdninger centrosomer, og paneler på de rigtige show forstørrede billeder af de angivne områder. Scale bar, 10 um. (II) centrosom amplifikation i nærvær af BPA ikke skyldes centriole adskillelse. RWPE-1-celler blev behandlet med 0,1 nM BPA i 3 dage. Celler blev fikseret og immunfarvet for centrosomer (anti-γ-tubulin, rød), centrioler (anti-centrin, grøn), og kernen (DAPI, blue). Pile peger på positioner centrosomer. Paneler på højre viser forstørret billeder af de angivne områder. Scale bar, gjorde 10 um.

Lav-dosis BPA ikke påvirke centriole opsplitning

Strukturelt centrosom består af et par af cylindriske strukturer, der kaldes centrioler der fungerer som duplikere enheder. For at verificere integriteten af ​​centrosomer, vi immunfarvet celler til centrin, en stor bestanddel af centriole cylinder, tillader visualisering af centriole par i centrosom. Fig. 3 viser repræsentative billeder af RWPE-1-celler. Hver prik påvises ved antistof mod y-tubulin (fig 3-II. Panel A og D) blev løst til et par prikker (der repræsenterer en centriole par) afsløret ved antistof til centrin ved en større forstørrelse (fig 3-II.; paneler B og E, paneler en, en “d ‘, d”). Disse data viser således, at de centrosomer er intakte, som indeholder et par centrioler. De centrosom profiler bestemt ved at tælle centrin signal svarede til dem bestemt ved at tælle γ-tubulin signal (fig. 2). Resultater for LNCaP, c4-2, 22Rv1, og NPrEC celler var ens. Derfor BPA havde indvirkning på centrosom separation eller centriole spaltning.

Low-dosis BPA forbedret MT aster dannelse

forankring MTS og deres efterfølgende forlængelse til at danne radiale MT arrays (asters) er kritiske hændelser under interfase og også føre til dannelsen af ​​den mitotiske spindel er forbundet med normal centrosom funktion [28]. RWPE-1 prostataceller undersøgt for MT aster-dannelse (fig. 4). Celler blev først behandlet med nocodazol på is til helt depolymerisere interfasen MTS; nocodazol blev derefter fjernet, og cellerne blev inkuberet i frisk varm medium for MT genvækst. Evnen af ​​centrosomer at nukleere, anker, og langstrakte MT’er blev bestemt ved co-immunfarvning for centrosomer (anti-γ-tubulin) og MTS (anti-α-tubulin). MT aster danner aktivitet centrosomer blev vurderet i henhold til den tidligere fastsatte protokol [25]. Ubehandlede RWPE-1-celler udviste ubetydelig aster formation. Efter akut 2-h behandling med 0,1 nM BPA blev korte asters set 56% af cellerne. Tre dage efter behandling med BPA (kronisk eksponering), viste ~37% celler asters (fig. 4A, 4B paneler g-i). Vores data indikerer dermed, at BPA forbedrer MT aster formation.

mikrotubuli aster dannelse assay blev udført 2-immunfarvet for centrosomer (anti-γ-tubulin, rød) og MTS (anti-α-tubulin, grøn). Den centrosomal aster dannelse blev vurderet som positiv, hvis centrosomer havde en MT aster med mere end 15 meter. Resultaterne vist i (A) resultater er gennemsnit ± standardafvigelse (SE) fra tre eksperimenter. For hvert eksperiment 200 celler blev undersøgt. Signifikans blev beregnet ved anvendelse af Students t-test vs. 12:00. *

s

≤0.00002.

Kronisk BPA eksponering fremmer forankringsuafhængig vækst i c4-2 celler

evne kronisk BPA eksponering at omdanne eller fremme ondartet vækst af NPrEC, RWPE-1, LNCaP, og c4-2 celler blev bestemt ved en blød-agar koloni-dannelse assay. Cellerne blev dyrket i medium med eller uden 0,1 nM BPA i 10-14 passager, før de blev podet på blød agar. Colony formation til NPrEC, RWPE-1, og LNCaP var 2%, og eksponering til 0,1 nM BPA ændrede ikke effektiviteten af ​​kolonidannelse. Imidlertid BPA-eksponerede c4-2 celler produceret væsentligt mere, større, hurtigere voksende soft-agar kolonier (tabel 4, fig. 5). Den procent effektivitet kolonidannelse (gennemsnit ± SD) steg til 19,25 ± 7,05% med BPA behandling sammenlignet med 2,03 ± 0,40% i ueksponerede kontroller (

s

0,001). Kolonien diameter var 50-400 um i kontrol vs. 100-1,200 um i BPA-behandlede c4-2 celler.

Repræsentative billeder af kolonier efter 2 ugers inkubation i agar. C4-2 celler i nærværelse af 0,1 nM BPA dannede større kolonier (B, B ‘, 100-1200 um diameter) sammenlignet med dem, der dyrkes i fravær af BPA (A, A’, 50-400 um diameter).

diskussion

Dokumentation for, at BPA eksponering bidrager til PCa stammer fra dyreforsøg [29], [30], [31], [32] eller celle-baserede [33 ], [34], [35], [36] modeller. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der giver foreløbige beviser for en sammenslutning af BPA eksponering med PCa i et klinisk miljø. Vores resultater i 60 urologiske patienter viser, at urin BPA niveau er en uafhængig prognostisk biomarkør for PCa, som blev påvist højere urin BPA niveauer i de 27 PCA patienter (geometrisk gennemsnit, 5,74 [95% CI, 2,63, 12,51] gg /g kreatinin) i forhold til dem i de 33 ikke-PCA patienter (geometrisk gennemsnit, 1,43 [95% CI, 0,70, 2,88] gg /g kreatinin) (

s

= 0,012). Detektionsgrænsen for denne undersøgelse var 0,05 ng /ml. Adskillige befolkningsundersøgelser har nu etableret BPA som en allestedsnærværende miljøforurening detekterbar i urinen fra de fleste individer i amerikanske populationer. I det første store tværsnitsundersøgelse i USA involverer 2.517 deltagere i 2003-2004 nationale sundhed og ernæring Undersøgelse Survey (NHANES) [7], blev BPA påvist i 93% af befolkningen på et geometrisk gennemsnit og en 95

percentil koncentration på 2,6 ug /g og 11,2 ug /g; detektionsgrænsen var 0,4 ng /ml vs. 0,05 ng /ml i vores undersøgelse. En senere undersøgelse af 2.747 voksne deltagere i 2003-2006 NHANES [37] rapporterede et geometrisk gennemsnit på 2,05 ug /g creatinin (25

percentil: 1:18 75

percentil: 3,33); den nedre detektionsgrænse var 0,36 ng /ml. Således det geometriske gennemsnit af urin BPA niveauer i PCA patienter i dette studie var ~2-2.5 gange højere end de geometriske middelværdier af dem i store amerikanske tværsnitsundersøgelser. I modsætning hertil den geometriske middelværdi i de ikke-PCA patienter i denne undersøgelse var -50% lavere end de geometriske middelværdier for disse to befolkningsundersøgelser.

En styrke med dette studie er vores brug af metoden anbefales af Centers for Disease Control og Forebyggelse, der involverer fast-fase ekstraktion kombineret med isotopfortynding-HPLC-MS /MS for at måle total urin BPA i et referencelaboratorium. Desuden vi korrigeret for variationer, der skyldes faktorer, der påvirker urin fortynding ved at udtrykke vores data i forhold til urin kreatininkoncentrationer. Endelig havde alle patienter biopsibekræftet, snarere end selvrapporteret, PSA. En potentiel begrænsning af vores undersøgelse var, at den samlede urin BPA i vores patienter blev målt én gang. Men i henhold til gældende litteratur, alt urin BPA koncentrationer (gratis plus konjugerede) i stikprøver (engangs-måling) er en pålidelig metode til at evaluere baseline eksponering fra alle kilder på tværs af tid, når prøven størrelse er tilstrækkelig stor [38]. Selv toksikokinetiske undersøgelser har vist, at BPA og dets hovedmetabolit, BPA-glucuronid, har temmelig korte halveringstider (~2.5 h) i blodet, og at de hurtigt udskilles med urinen [39], [40], tværsnit befolkning undersøgelser har antydet væsentligt længere halveringstider som følge af ikke-spiselige eksponering, bioakkumulering i kroppens væv, såsom fedt, og leverfunktion, især dem, der vedrører glucuronidering af BPA [12], [39]. Tilstedeværelsen af ​​høje BPA-koncentrationer i urinen kan antyde, at de livsstilsvaner af disse patienter kan opretholde højere niveauer af eksponering. I den forbindelse anvendes i en klinisk undersøgelse, BPA niveauer i urinprøver opsamlet på samme dag fra mandlige og kvindelige partnere korreleret [41], støtter den forudsætning, at lignende livsstilsvalg kan bestemme niveauet af BPA eksponering. Desuden er en nylig undersøgelse viste, højere inden-personers variation (over 1-3 år) i BPA niveauer i forhold til den samlede variation i 80 kvinder [42]. Kollektivt, disse undersøgelser fremhæver betydningen af ​​vores konklusion om, at en engangs-sampling af urin BPA korrelerer med PSA.

Stratificerede analyser viste, at sammenhængen mellem urin BPA niveauer og PCa er stærkt signifikant (

p

= 0,006) blandt de 30 patienter 65 år gammel (gennemsnit og median alder = 58, minimumsalder = 46), men at denne forening ikke når betydning blandt halvdelen af ​​patienterne 65 år (figur 1).. Disse resultater er spændende, men forvirrende. Taget for pålydende, de foreslår, at højere eksponering BPA er forbundet med tidligere debut af PSA. Men på baggrund af teorien om udviklingsmæssige omprogrammering af kræft risiko [43], vores resultater hæve, muligheden for tidlige liv omprogrammering af PCa i mennesker. I rotteundersøgelser, nyfødte fodret miljømæssigt relevante niveauer af BPA havde en øget risiko for at udvikle prostata neoplasmer [29], [44].