PLoS ONE: 18β-glycyrrhetinsyre Undertrykker Cell Proliferation gennem Hæmning Thromboxan Synthase i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

18β-glycyrrhetinsyre (18β-GA) er en bioaktiv komponent i lakrids. Den anti-cancer aktivitet af 18β-GA er blevet undersøgt i mange cancertyper, paa grund af dets virkninger i lungekræft forbliver stort set ukendt. Vi først viste, at 18β-GA undertrykkes effektivt celleproliferation og inhiberede ekspression samt aktivitet af thromboxan-synthase (TxAS) i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler A549 og NCI-H460. Desuden har administration af 18β-GA ikke nogen yderligere hæmmende virkning på formindskelsen af ​​celleproliferation induceret af transfektion med TxAS lille interferens RNA (siRNA). Endvidere 18β-GA undladt at inhibere celleproliferation i de immortaliserede humane bronkiale epitelceller 16HBE-T og en anden NSCLC cellelinie NCI-H23, som begge udtrykkes minimalt niveau af TxAS sammenlignet med A549 og NCI-H460. Men 18β-GA afskaffet forstærkning af celleproliferation fremkaldt af transfektion af NCI-H23 med pCMV6-TxAS plasmid. Yderligere undersøgelse viste, at aktiveringen af ​​både ekstracellulære signal-regulerede kinase (ERK) 1/2 og cyklisk adenosinmonophosphat responselement bindingsprotein (CREB) induceret af TxAS cDNA transfektion kan blive helt blokeret af 18β-GA. Alt i alt har vi afgrænset, at ved at hæmme TxAS og dens indledt ERK /CREB signalering, 18β-GA undertrykker NSCLC celleproliferation. Vores undersøgelse har vist betydningen af ​​18β-GA med hensyn til forebyggelse og behandling af NSCLC

Henvisning:. Huang R-Y, Chu Y-L, Huang Q-C, Chen X-M, Jiang Z-B, Zhang X et al. (2014) 18β-glycyrrhetinsyre Undertrykker Cell Proliferation gennem Hæmning Thromboxan Synthase i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (4): e93690. doi: 10,1371 /journal.pone.0093690

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: December 3, 2013; Accepteret: 9 marts 2014; Udgivet: 2 April, 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: yde støtte : Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.302.799), Kina Postdoc Science Foundation (nr 2013M531838) og 2012 Fremragende Young Scientist Foundation fra Guangzhou University of kinesisk medicin (nr KAB111133K08). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De urter, der anvendes i traditionel medicin giver en rig reservoir til udvinding biologisk aktive forbindelser. For eksempel er lakrids været hyppigt anvendt i orientalsk medicin i tusinder år og dens alvorlige bioaktive komponent glycyrrhizinsyre besidder forskellige biologiske, farmakologiske og medicinske aktiviteter, som ligner dem af retinoider og steroider [1]. Glycyrrhizinsyre let hydrolyseres til 18β-GA i menneskekroppen, og derved udøver sine anti-inflammatorisk, anti-virus og endda anti-cancer effekter [2] – [4]. Selv kemopræventivt potentiale 18β-GA er blevet dokumenteret i mange typer af cancerceller, såsom human epitelial ovariecancer, brystkræft og glioblastom [5] – [7], lidt om virkningerne af 18β-GA i lunge tumorvækst .

lungekræft er den ukontrollerede vækst af unormale celler i væv i lungerne. Mere end 1,5 millioner dødsfald på verdensplan er fra Lungekræft, som overstiger de fra andre maligniteter [6]. Blandt de mange undertyper, NSCLC udgør de 80% af alle tilfælde lungekræft [8]. Till sidst var der ingen tilfredsstillende terapeutiske strategier for forvaltningen af ​​NSCLC. TxAS er blevet observeret at være overudtrykt i NSCLC prøver, sammenlignet med normale lungevæv [9] – [11]. I cancervæv, er TxAS placeret nedstrøms for cyclooxygenaser (COX) -2, og det kan syntetisere thromboxan (Tx) -A2 fra prostaglandin (PG) H2, som omdannes ved Coxs fra arachidonsyre (AA) [12]. Den biologiske halveringstid af TxA2 er omkring 30 s i in-vitro-modeller, så TxA2 hurtigt og ikke-enzymatisk nedbrudt til en inaktiv form af TxB2 i vandig opløsning [12], [13]. Således TxA2 virker som en parakrin /autokrin hormon med potente virkninger af blodpladeaggregering, vasokonstriktion, tumorcelleproliferation og invasion [12], [14]. Virkningerne af TxA2 medieres gennem interaktion med dens specifikke receptor, thromboxan receptor (TP), som er medlem af G-protein-koblet celleoverfladereceptor familie [12], [13]. I løbet af de seneste 5 år har TxAS og dets forbundne TP blevet grundigt undersøgt i kræftforskning. derfor etableret Den positive rolle TxAS og TP i tumor patologi, og deres inhibitorer /antagonister er blevet foreslået at være de lovende anti-cancer stoffer [10], [15]. For nylig blev det rapporteret, at både TxAS og dets opstrøms COX-2 styres af TP, og TxAS er i stand til at fremme lungetumor vækst gennem denne auto-regulerende feed-back loop [16]. Interessant nok i humane endotelceller, virkningerne af TP-agonist kan efterlignes ved 18β-GA med en lignende tidsforløb og virkning [17], hvilket tyder på en associering mellem 18β-GA og molekylære TxAS.

Således har vi har undersøgt den mulige en-cancer effekt af 18β-GA i NSCLC celler. Vi rapporterer her, at 18β-GA kunne undertrykke celleproliferation og inducerer apoptose i NSCLC celler gennem, i det mindste delvist, inhibering TxAS ekspression og aktivitet. Sådanne virkninger kan forventes at være af stor klinisk relevans.

Materialer og metoder

Cell Kultur og kemikalier

De humane lunge adenocarcinom cellelinjer NCI-H23, NCI-H460 og A549 samt en immortaliseret human bronchial epitelcellelinie 16HBE-T blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). Begge NCI-H23 og 16HBE-T-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), og NCI-H460 og A549-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium. Alle celler blev holdt i dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en atmosfære indeholdende 5% CO2 ved 37 ° C.

18β-GA og arachidonsyre blev købt fra Sigma-Aldrich, og cisplatin blev leveret af ALADDIN Chemical Co., Ltd (Shanghai, Kina).

Cell proliferation assay

celler blev podet ved 5000 celler per brønd i 96-brønds plader og inkuberes natten over. Efter korrekt behandling blev antallet af levedygtige celler kvantificeret på angivne tidspunkter ved anvendelse MTS assay, udført i fire eksemplarer, ifølge instruktion af fabrikanten (Promega, Madison, WI). Absorbans blev bestemt ved anvendelse af en mikro-pladelæser ved en bølgelængde på 492 nm.

Flowcytometrisk analyse

Celler blev podet ved 1 x 10

5 celler /10 ml i plader med 6 brønde og inkuberet natten over. Levende celler blev opsamlet og vasket to gange ved iskold PBS. celler blev farvet med Annexin V fluorescein farvestof og propidiumiodid (PI) ved stuetemperatur i mørke i 15 minutter. celler blev efterfølgende resuspenderet i 400 pi Annexin-bindingspuffer (Beckman Coulter, Brea, CA). De farvede celler blev holdt på is og analyseret ved Beckman flowcytometre.

enzymimmunoassay (EIA) assay

TxAS aktivitet blev overvåget ved at undersøge niveauet af thromboxan B2 (TxB2), et stabilt produkt af den ikke-enzymatiske hydratisering af TxA2 [12]. A549 og NCI-H460-celler blev podet ved den samme tæthed på 1 x 10

5 celler /10 ml medium i en 6-brønds dyrkningsplade. Kultursupernatanten blev opsamlet og centrifugeret fulgte den rette behandling. TxB2 blev påvist ved peroxidase-mærkede TXB2 konjugater anvendelse af et enzym immunoassay kit ifølge producentens instruktioner (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).

Forbigående transfektioner Salg

Celler blev podet ved den samme tæthed af 1 × 10

5 celler /10 ml medium i en 6-brønds dyrkningsplade. 10 nM TxAS siRNA og ikke-mål siRNA (kontrol) blev transficeret ind A549 og NCI-H460, mens 2 ug ledig pCMV6 (kontrol) eller pCMV6-TxAS plasmid blev transficeret i NCI-H23, ved hjælp af Lipofectamine 2000 reagenser (Invitrogen , Carlsbad, CA, USA), ifølge fabrikantens instruktioner (OriGene teknologier, Rockville, MD). Omfanget af den specifikke gen knockdown eller overekspression blev opdaget af real-time PCR eksperiment.

Rækkefølgen af ​​TxAS siRNA er rGrUrArArCrUrUrUrArCrCrArArCrArGrArArUrGrGrCrGTC. Betingelserne for siRNA transfektioner er som følgende: celler blev dyrket ved densitet på 70% med standard medium. Efter fjernelse af mediet blev cellerne inkuberet med DMEM (uden antibiotika) indeholdende forblandet siRNA (10 nM) og 7,5 pi Lipofectamine 2000 reagens, og blev yderligere inkuberet i 72 timer.

reverse transkriptase (RT) -PCR og real-time kvantitativ PCR

RT-PCR og real-time kvantitativ PCR blev udført som tidligere beskrevet [16]. Følgende genspecifikke primersekvenser blev anvendt: 5′-AATAAGAACCGAGACGAACT-3 ‘(sense) og 5′-GGCTTGCACCCAGTAGAG-3′ (antisense) for humane TxAS; 5’-GGAAATCGTGCGTGACATT-3 ‘(sense) og 5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3’ (antisense) for human β-actin. Real-time PCR blev udført under anvendelse af CFX96 Touch Deep Well ™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc. Berkeley, CA). Den fold ændring i kontrollen i ekspressionen af ​​TxAS mRNA blev beregnet af 2

-ΔΔCT metode.

Western blot analyse

Samlet protein (20 ug) blev løst med 7% SDS- polyacrylamidgelelektroforese og udsat for Western blot-analyse under anvendelse af den mest avancerede kemiluminescerende påvisningssystem (Bio-Rad Laboratories). Western blots blev probet med et monoklonalt muse-antistof mod TxAS (OriGene Technologies), en ged polyklonale antistof mod β-actin (Santa Cruz Biotechnology), og kanin-polyklonale antistoffer mod GAPDH, PARP, total og phosphoryleret ERK1 /2 såvel som total og phosphoryleret CREB (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). For at sikre lige protein loading blev membraner strippet og efterfølgende undersøgt med anti-GAPDH eller anti-β-actin-antistoffer.

Statistiske analyser

Data er afbildet som middelværdi ± SD fra mindst tre uafhængige eksperimenter. Students t-test blev anvendt til sammenligninger mellem to grupper, mens Envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts test blev vedtaget at sammenligne forskellene mellem mere end to grupper. Statistiske analyser blev udført af SPSS 11.6 statistisk software (SPSS, Chicago, IL). En to-tailed P værdi. 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant for alle eksperimenter

Resultater

18β-GA undertrykte celledeling via induktion af apoptose

Begge A549 og NCI-H460 er NSCLC cellelinjer. Førstnævnte tilhører adenocarcinom, og sidstnævnte er en stor celle lungecancer-cellelinie. Vurdering af antallet af levedygtige celler ved MTS-assay viste, at 24 h behandling af 18β-GA undertrykt celleproliferation i begge cellelinier i en dosisafhængig måde (figur 1A). Tidligere in vitro undersøgelse viste, at IC

50 værdien af ​​18β-GA til inhibering lungekræft cellevækst var 145,3 pM [18]. Som vist i figur 1A og 1B, 18β-GA ved 160 uM faldt betydeligt procentdelen af ​​levedygtige celler til omkring 40,5 ± 10,5% i A549 og 38,3 ± 4,6% i NCI-H460 (p 0,01 henholdsvis). Når cellerne blev behandlet med 320 pM 18β-GA, blev en større inhiberende virkninger på celleproliferation viste, som procentdelen af ​​levedygtige celler var under 30% sammenlignet med ubehandlede kontroller (p 0,001). Det fremgik derfor, at 160 pM 18β-GA var en optimal koncentration for at opnå en signifikant undertrykkelse af celleproliferation i NSCLC-celler.

A og B, MTS forsøg viste, at 18β-GA inhiberede celleproliferation af A549 og NCI -H460 celler i en dosis-afhængig måde. Endvidere 18β-GA øget cytotoksicitet af kemoterapeutisk middel cisplatin. Data er udtrykt som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo. * P 0,05, ** p 0,01. C, Western blot-analyse viste den øgede spaltet PARP (85 kDa) med den formindskede fuld længde PARP (116 kDa) i A549 og NCI-H460-celler behandlet med 18β-GA. GAPDH (37 kDa) tjente som lastning kontrol. D, Flowcytometrisk analyse af celleapoptose. Procentdelen af ​​celler i tidlig eller sen apoptose leveres i nederste højre og øverste højre kvadranter hhv. Tallene er repræsentativt resultat udvalgt fra tre uafhængige forsøg.

Cisplatin er en del af standard for pleje af patienter med lungekræft. For at bestemme den mulighed, at 18β-GA kunne have en additiv virkning på cisplatin på tumorcelleproliferation blev begge testede cellelinier dyrket i nærvær af 5 ug /ml cisplatin alene eller 5 ug /ml cisplatin sammen med 80 pM 18β-GA. Ved behandling med cisplatin alene, blev procentdelen af ​​levedygtige celler kun faldt med 20,5 ± 6,8% i A549 og 38,7 ± 6,0% i NCI-H460 sammenlignet med kontrol (p = 0,076 og 0,041 henholdsvis figur 1A og 1B). Men når de kombineres med 80 pM 18β-GA, havde de en synergistisk virkning i begge cellelinier. I begge cellelinjer, undertrykkelsen sats efter kombineret behandling var under 40% af kontroller (p 0,01)., Svarende til effekten af ​​160 pM 18β-GA alene

For at bekræfte de observeret af MTS assays og data at bestemme, om suppression af celleproliferation var delvis skyldes en stigning i apoptose, blev spaltet PARP målt ved Western blotting under anvendelse af et kanin-polyklonalt PARP-antistof detektere både fuld længde og spaltede former. Som illustreret i figur 1C, behandling med 18β-GA 160 uM og 320 uM faldt niveauerne af fuld-længde PARP og øgede niveauer af spaltet-PARP. Dette resultat blev yderligere understøttet af flowcytometrisk analyse, som blev anvendt til måling annexin-V mærkning til phosphatidylserin, en membran phospholipid på overfladen af ​​apoptotiske celler [19]. Efter 24 h behandling med 160 pM 18β-GA blev celler farvet med annexin-V-fluoresceinisothiocyanat og PI. Som illustreret i figur 1D, den del af cellerne i tidlig apoptose, der angives med PI-positive celler, var signifikant højere i 18β-GA-behandlede grupper (ca. 3,5-fold for A549, og ca. 3,9 gange for NCI-H460, henholdsvis ; P 0,001). Derudover blev mere apoptotiske celler fundet i behandling af cisplatin kombineret med 18β-GA end behandling af cisplatin alene, hvilket yderligere understøtter, at 18β-GA har en additiv virkning over for cisplatin.

18β-GA inhiberede TxAS ekspression og aktivitet

Tidligere undersøgelser impliceret en potentiel rolle TxAS i patogenesen af ​​flere forskellige typer af kræft, herunder NSCLC [10], [16]. Vi undersøgte derfor hvis 18β-GA kunne påvirke TxAS udtryk og aktivitet. Western blot analyse viste, at 18β-GA faldt TxAS proteinniveauet på en tids- og dosisafhængig måde (figur 2A og 2B). I overensstemmelse med apoptotisk virkning af 18β-GA vist i figur 1, 12 h behandling af 18β-GA ved 160 uM og 320 uM faldt dramatisk niveauerne TxAS. Endvidere 18β-GA (160 uM) inhiberede niveauet af TxAS så tidligt som 3 timer i NCI-H460 og 6 timer i A549 efter behandlingen. mRNA blev også ekstraheret fra celler behandlet med 160 pM 18β-GA i 6 timer, 12 timer og 24 timer og efterfølgende udsættes for real-time PCR eksperimenter. Figur 2C viser, at TxAS mRNA-niveau blev signifikant reduceret med 18β-GA i en tidsafhængig måde, som er i overensstemmelse med de observerede ved Western blot-analyse af data.

A og B, fandt Western blot-analyse, 18β -GA inhiberede protein ekspression af TxAS (60 kDa) på en dosis- og tidsafhængig måde. Actin (45 kDa) tjente som lastning kontrol. Viste figur repræsenterer tre uafhængige forsøg, og densitometri for blots blev vist i højre panel af fig.A og den nedre panel af fig.B. * P 0,05 og ** P 0,01 sammenlignet med kontrol. C, realtids-PCR viste, at ekspressionen af ​​TxAS mRNA kunne reduceres med 18β-GA i en tidsafhængig måde. Dare er udtrykt som fold af kontrol, der blev beregnet ved 2

-ΔΔCT metode baseret på de observerede fra tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer data. * P 0,05 og ** P 0,01. D og E, TxB2 VVM-analyser viste virkningerne af 18β-GA på TxAS aktivitet i både A549 og NCI-H460 celler i fravær eller tilstedeværelse af 0.4μM AA. Data er udtrykt som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo. ** P 0,01 sammenlignet med kontrollen, # p 0,01 sammenlignet med AA behandling

Desuden blev virkningen af ​​18β-GA på TxAS aktivitet målt efterfølgende.. Som nævnt ovenfor TxA2 er kemisk ustabile in vitro, er TxAS aktivitet derfor overvåges ved at analysere niveauet af TxB2, et stabilt produkt af den ikke-enzymatiske hydratisering af TxA2 [16]. Både A549 og NCI-H460-celler blev behandlet med 160 pM 18β-GA i 24 timer, og dyrkningsmediet blev opsamlet for at udføre TxB2 EIA assay. I disse eksperimenter cellerne behandlet med 0,4 uM AA, som er forløber for TxA2 tjente som de positive kontroller, og cellerne behandlet med specifikke TxAS inhibitor furegrelate (1 mM) fungerede som de ekstra kontroller. De valgte doser af disse kemikalier er sammenlignelige med de anvendte koncentrationer i in vitro eksperimenter rapporteret i andre undersøgelser [16], [20]. Som vist i figur 2D og 2E, i begge cellelinier, biosyntesen af ​​TxA2 blev signifikant undertrykt af 18β-GA i fravær eller nærvær af AA. 0,4 uM AA induceret TxB

2-produktion ved 1,8 gange i A549-celler (p 0,01) og 2,8 gange i NCI-H460-celler (p 0,01) sammenlignet med kontrol. Men tilsætning af 160 pM 18β-GA signifikant svækket AA-induceret TxB

2-produktion med næsten 91% i A549 og 89% i NCI-H460 (p 0,001). Vigtigere, 18β-GA ved 160 uM svarer i effekt til 1 mM furegrelate. Disse resultater antyder kraftigt, at 18β-GA er i stand til at ophæve TxAS aktivitet i NSCLC celler.

Sammen dataene for at 18β-GA væsentlig grad kan hæmme både udtryk og aktivitet TxAS indebærer, at 18β-GA kan undertrykke celle spredning gennem hæmme TxAS handling.

18β-GA havde ingen yderligere virkning på celleproliferation da TxAS blev slået ned

for at verificere den mulighed, at 18β-GA kan undertrykke celledeling gennem hæmning TxAS, vi slået ned TxAS udtryk i A549 og NCI-H460 celler ved hjælp siRNA transfektion og 160 pM 18β-GA blev efterfølgende sat i 24 timer. Ikke-target siRNA blev også transficeret i begge cellelinier til at tjene som kontrol. Real-time PCR indikerede, at ekspressionen af ​​TxAS i begge cellelinier blev signifikant undertrykt ved 24 h transfektion af TxAS-siRNA, med næsten 90% af suppression effekt (figur 3A). Transfektionen effekt blev yderligere bekræftet ved Western blot-analyse (figur 3B). Efter tilsætning af 160 pM 18β-GA i yderligere 24 timer blev MTS-assays udført, og resultaterne viste, at proliferationshastigheder af A549-celler behandlet med 18β-GA, TxAS-siRNA, og kombinationen af ​​begge var 41,7 ± 1,7%, 38,3 ± 4,4% og 35,4 ± 6,4% af kontroller henholdsvis (figur 3C). I NCI-H460 celler, de var 38,9 ± 3,7%, 31,1 ± 3,4% og 28,4 ± 8,0% af kontroller, henholdsvis (figur 3D). Det fremgår, at i sammenligning med TxAS-siRNA transfektion, har yderligere administration af 18β-GA ikke nogen betydelige yderligere effekter på celleproliferation.

A og B, den undertrykker effekt af siRNA på TxAS ekspression blev afsløret af real -tid PCR og Western blot-analyse. Real-time PCR-data blev observeret fra tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer og beregnet af 2

-ΔΔCT metode. Data er præsenteret som folden af ​​kontrol, ** P 0,01. C og D, viste MTS analyser, TxAS-siRNA transfektion hæmmede celle proliferation i A549 og NCI-H460, og den ekstra administration af 18β-GA havde nogen additiv effekt. Data er præsenteret som procentdele af kontrol og udtrykt som middel ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo. ** P 0,01

Af note, det resultat, at siRNA af TxAS væsentligt reduceret cellevækst, hvilket er i overensstemmelse med de observerede i vores tidligere undersøgelser der viser, at bestemte TxAS inhibitor furegrelate kan dramatisk hæmme. cellevækst i lungekræft celler [11], [16]. Til støtte for vores data, Cathcart MC et al viste, at en anden TxAS korrosionsinhibitor ozagrel hæmmede celledeling via induktion af apoptose i NSCLC celler [10], og Moussa O et al viste, at TxAS shRNA undertrykt blærekræft cellevækst [19]. Desuden Nie D et al observeret, at prostata tumorcellemotilitet blev svækket af hæmmere af TxAS [21].

Undertrykkelse af celledeling ved 18β-GA var forbundet med TxAS status

Resultaterne observeret ovenfor støttet, at de hæmmende virkninger af 18β-GA kan skyldes undertrykkelsen af ​​TxAS i NSCLC celler. For yderligere at verificere denne mulighed, vi næste screenede en serie af lunge-cellelinier til ekspression af TxAS. RT-PCR-forsøg viste, at sammenlignet med A549 og NCI-H460, en immortaliseret human bronchial epitelcellelinie 16HBE-T og en anden NSCLC cellelinie NCI-H23 udtrykte minimalt niveau af TxAS (figur 4A). Disse to cellelinjer blev behandlet med stigende koncentrationer af 18β-GA i 24 timer, og MTS-assay blev udført for at detektere celleproliferation. Som vist i figur 4B og 4C, 18β-GA undladt at afskaffe celleproliferation i både 16HBE-T og NCI-H23, om end med en mindre tendens til undertrykkelse. Undertrykkelsen hastighed dosis på 500 uM var ikke mere end 20% af kontrol i begge cellelinier.

A, det minimale niveau af TxAS i 16HBE-T og NCI-H23 og overekspression af TxAS i A549 og NCI-H460 blev afsløret ved RT-PCR. Viste figur repræsenterer tre uafhængige forsøg. B og C, MTS vist, at mens der var en mindre inhibitorisk tendens, 18β-GA undladt at kontrollere celleproliferation i 16HBE-T og NCI-H23. Data er præsenteret som procentdele af kontrol og udtrykt som middel ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo. D og E, TxAS udtryk i NCI-H23 blev over-udtrykt ved transfektion med pCMV6-TxAS plasmid. Real-time PCR-data blev observeret fra tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer og beregnet af 2

-ΔΔCT metode. Data er præsenteret som folden af ​​kontrol, ** P 0,01. F viste MTS analyser, at fremme af celledeling ved transfektion med pCMV6-TxAS blev ophævet af 18β-GA. Data er præsenteret som procentdele af kontrol og udtrykt som middel ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo. ** P 0,01 i forhold til kontrol, # p. 0,01 i forhold til pCMV6-TxAS transfektion

Fordi NCI-H23, der tilhører adenocarcinom, er en NSCLC cellelinje med minimalt niveau af TxAS, vi overudtrykkes TxAS i denne cellelinje ved transfektion med pCMV6-TxAS plasmid. Ledig plasmid blev også transficeret til at tjene som kontrol. Figur 4D illustrerede, at TxAS blev overudtrykt omkring 8,2 gange end kontrol efter 24 timers transfektion med TxAS cDNA. Western blot-analyse blev også udført for at bekræfte transfektion virkning (figur 4E). Celler blev efterfølgende behandlet med 160 pM 18β-GA i yderligere 24 timer. MTS eksperimenter viste, at transfektion med TxAS cDNA markant fremmet celleproliferation med 181,4 ± 3,6% sammenlignet med kontrollen (p 0,001), virkningen blev ophævet ved tilsætning af 18β-GA. Cellen proliferative var signifikant reduceret med 18β-GA til 111,2 ± 2,2% af kontrol, næsten selv med kontrol niveau (figur 4F). Disse resultater understøtter, at virkningen af ​​18β-GA i NSCLC er forbundet med ændringen af ​​TxAS udtryk.

ERK /CREB signalering var involveret i 18β-GA effekter

I vores tidligere undersøgelser, vi viste, at aktiveringen af ​​både ERK og CREB kan inhiberes af TxAS inhibitorer eller TP-antagonister, og aktivering af CREB undertrykkes af specifik ERK inhibitor [11], [16]. TxAS /ERK /CREB vej behandles også af andre undersøgelser udført i lungekræft model [22], [23]. Derfor blev den sidste serie af Western blot eksperimenter gjort for at undersøge om ERK /CREB vej var involveret i tumor-suppression effekter af 18β-GA. Som vist i figur 5A, cellerne transficeret med pCMV6-TxAS præsenterede de højere niveauer af phosphoryleret ERK1 /2 (p-ERK1 /2) og phosphoryleret CREB (p-CREB), blev virkningerne dramatisk svækket ved behandling af 160 uM 18β- GA. Resultatet er i overensstemmelse med de observeret af MTS analyser (figur 4F) data. Desuden har vi bestemt effekter af 18β-GA på ERK /CREB aktivering i A549 og NCI-H460, som begge præsenterer høje niveauer af TxAS som set i figur 4A. Figur 5B viste, at nedregulering af TxAS af siRNA blokeret ERK1 /2 phosphorylering i A549 og H460 celler. Konsekvent, 160 pM 18β-GA effektivt undertrykt de høje niveauer af p-ERK og p-CREB i disse to cellelinjer. Ingen ændring var detekterbar vedrørende ekspression af total ERK eller total CREB i alle testede cellelinier.

A, demonstrerede Western blotting eksperimenter, at aktiveringen af ​​ERK1 /2 (42/44 kDa) og CREB (43 kDa) fremkaldt af pCMV6-TxAS transfektion kunne afskaffes ved 18β-GA i NCI-H23-celler. Viste figur repræsenterer tre uafhængige forsøg, og densitometri for blots blev vist i panelet til højre. * P 0,05 ** p 0,01 sammenlignet med kontrol; # P 0,05 og ## p 0,01 sammenlignet med 18β-GA behandling i celler transficeret med ledig plasmid. B, blev undertrykkelsen af ​​ERK1 /2 og CREB aktivering af TxAS-siRNA og 18β-GA i A549 og NCI-H460 afsløret ved Western blot analyse. I disse eksperimenter total ERK1 /2 (42/44 kDa), total CREB (43 kDa) og Actin (45 kDa) tjente som indlæsning kontroller. Et monoklonalt antistof, som kan detektere endogene niveauer af p-CREB og phosphorylerede form af CREB-relateret protein aktiverende transskriptionsfaktor-1 (p-ATF-1) blev anvendt i den aktuelle undersøgelse. Viste figur repræsenterer tre uafhængige forsøg, og densitometri for blots blev vist i panelet til højre. * P 0,05 sammenlignet med kontrol

Diskussion

Som en af ​​urter, der ofte anvendes orientalsk medicin med lav toksicitet, lakrids er en amerikanske Food and Drug Administration (FDA) godkendt. kosttilskud anvendes i mange produkter. Som anført ovenfor, glycyrrhizinsyre er den største bioaktive komponent, og det er let hydrolyseres til være 18β-GA i menneskekroppen at udøve forskellige virkninger, herunder anti-cancer aktivitet [1] – [4]. Denne undersøgelse har vist tumor-undertrykkende effekt af 18β-GA i NSCLC celler, og TxAS viste sig at være impliceret i denne effekt.

Vi oprindeligt viste, at 18β-GA dosisafhængigt nedsat celledeling i NSCLC celler A549 og NCI-H460. Den ID50 af 18β-GA i HepG2-celler var 80 uM [24], mens det i vores model dosis på 160 uM faldt celledeling sats under 50% af kontrol, hvilket er på linje med en tidligere rapport, der viser, at IC

50 værdien af ​​18β-GA var 145,3 uM i et stærkt potentielt metastatisk lungecancer-cellelinje PGCL3 [18]. 80 pM 18β-GA i kombination med cisplatin gav en signifikant tumor-undertrykkende virkning, på trods af 18β-GA alene ved 80 uM havde ingen effektiv virkning til at dræbe kræftceller. Dette resultat antyder den synergistiske virkning af 18β-GA på kemoterapeutisk middel. A549 viste højere resistens over for cisplatin sammenlignet med NCI-H460 celler, hvilket er i overensstemmelse med andre undersøgelser der viser, at A549 er mere modstandsdygtige over for cisplatin end nogle andre cellelinjer [25], [26]. Western blot-analyse yderligere præsenteret den øgede spaltet-PARP med nedsat fuld længde PARP i celler behandlet med 18β-GA i doser på 160 pM og 320 pM. Dermed er ændringen i total antal levedygtige celler ved 24 timer efter behandling med 18β-GA bemærkede i MTS eksperimenter kan tilskrives øget apoptose, hvilket bekræftes af de observerede ved flowcytometrisk analyse af data. Kollektivt, fremgår det, at 18β-GA er en lovende anti-cancer middel til anvendelse i NSCLC forebyggelse og behandling.

Vi fortsatte med at undersøge de molekylære mekanismer, hvorved 18β-GA udøver tumor-undertrykke effekt i NSCLC celler. I kraft af at katalysere dannelsen af ​​TxA2 som fungerer via dets receptor TP har TxAS vist sig at have en potentiel rolle i cancerfænotypen [10], [11], [14] – [16]. Vigtigere, blev TxAS og dets produkt TxA2 fundet at være overudtrykt i lungekræft væv, sammenlignet med normale lungevæv [9] – [11], [27]. En tidligere rapport, der viser, at 18β-GA er modværdien i effektivitet til en TP-agonist i humane endotelceller [17] førte os til at spørge, om TxAS blev impliceret i 18β-GA effekter i NSCLC. Denne hypotese blev også oplyst af et faktum, at glycyrrhizinsyre, forløberen for 18β-GA, virker dels gennem at hæmme COX-2 [28], som giver PGH2 for TxAS at katalyserer TxA2 dannelse [12], [29]. Kombineret med de resultater, 24 h behandling af 18β-GA dosisafhængigt undertrykt celleproliferation og apoptose, faldt TxAS med 12 h behandling af 18β-GA foreslår, at 18β-GA induceret inhibering af TxAS er en opstrøms tilfælde af væksthæmning og apoptose i NSCLC, som er yderligere understøttet af følgende tidsforløb eksperimenter. Desuden kunne mRNA-niveauer af TxAS reduceres ved 18β-GA i en tidsafhængig måde, hvilket indebærer, at 18β-GA inhiberede TxAS ekspression på transkriptionelt niveau. Endvidere blev TxAS aktivitet afspejles af TxB2 niveau udskilles i dyrkningsmediet, dramatisk inhiberet af 18β-GA. Disse resultater antyder, at TxAS kunne være en afgørende molekylære basis for 18β-GA effekt i NSCLC-celler. Ved transfektion med TxAS-siRNA, celle proliferative evne både A549 og NCI-H460 blev effektivt hæmmet, yderligere støtte den positive rolle, TxAS i lungekræft [10], [11], [16]. Vigtigt er det, gjorde den ekstra administration af 18β-GA ikke de additive virkninger på TxAS-siRNA transfektion. For at bekræfte disse resultater, vi screenet en række lunge cellelinjer for at bestemme ekspressionen af ​​TxAS. NSCLC er enhver type epitel bortset småcellet carcinom (SCLC) lungekræft, så vi brugt 16HBE-T, som er en immortaliseret human bronchial epitelcellelinie at tjene som kontrol for NSCLC cellelinier. I overensstemmelse med andre undersøgelser [9] – [11], TxAS niveau viste sig at være minimal i 16HBE-T, mens det var over-udtrykt i NSCLC celler A549 og NCI-H460. En anden NSCLC cellelinie NCI-H23 udtrykte også minimalt niveau af TxAS, hvilket gør den ideel model for transfektion af TxAS cDNA. Som forventet, 18β-GA ikke effektivt at undertrykke celleproliferation af 16HBE-T og NCI-H23. Det fremgik, at de forskellige virkninger af 18β-GA i alle disse cellelinjer var på grund af forskellen af ​​TxAS ekspression.