PLoS ONE: CD271 + subpopulation af pancreas Stjemeformige Cells korrelerer med Prognose for kræft i bugspytkirtlen og reguleres af Interaktion med Cancer Cells

Abstrakt

pancreas stjemeformige celler (PSC) spiller en afgørende rolle i den aggressive adfærd af kræft i bugspytkirtlen . Selv heterogenitet af kvikskranker er blevet identificeret, de funktionelle forskelle er fortsat uklare. Vi karakteriseret CD271

+ kvikskranker i human bugspytkirtelkræft. Immunhistokemi for CD271 blev udført i 31 normale pancreas væv og 105 pancreatiske ductale adenocarcinomer (PDACs). Vi udførte flowcytometri og kvantitativ RT-PCR, og vurderet CD271 ekspressionen i PSC’er isoleret fra pancreas væv og ændringerne i CD271 ekspressionen i kvikskranker dyrket sammen med kræftceller. Vi undersøgte også mønstret af CD271-ekspression i en SCID mus xenograftmodel. I den immunhistokemiske analyser, de CD271-high farvende satser i pancreas stroma i normale pancreas væv og PDACs var 2/31 (6,5%) og 29/105 (27,6%) (p = 0,0069). I PDACs blev CD271

+ stromale celler hyppigt observeret på kanten i stedet for midten af ​​tumorer. Stromal CD271 høj ekspression var forbundet med en god prognose (p = 0,0040). Flowcytometrisk analyser påvist CD271-positive rater i kvikskranker var 0-2,1%. Kvantitativ RT-PCR-analyser afslørede, at CD271 mRNA-ekspression blev øget i PSC efter cokultur med bugspytkirtelkræftceller. Men niveauet af CD271 mRNA-ekspression faldt derefter efter forbigående stigning. Endvidere blev CD271 mRNA ekspression faldt i kvikskranker migrerer mod bugspytkirtelkræftceller gennem Matrigel. I xenograft model, CD271

+ PSC’er var til stede på tumoren margener /periferi og var fraværende i tumoren kerne. Afslutningsvis blev CD271 udtrykkes i PSC’er omkring pancreas tumorer, men ikke i centrum af tumorerne, og ekspressionen faldt efter lange cokultur med bugspytkirtelkræftceller eller efter bevægelse mod bugspytkirtelkræftceller. Disse resultater tyder på, at CD271

+ kvikskranker vises på det tidlige stadium af pancreas carcinogenese og at CD271 ekspression er signifikant korreleret med en bedre prognose hos patienter med PDAC

Henvisning:. Fujiwara K, Ohuchida K, Mizumoto K , Shindo K, Eguchi D, Kozono S, et al. (2012) CD271

+ delpopulation af pancreas Stjemeformige Cells korrelerer med Prognose for kræft i bugspytkirtlen og reguleres af Interaktion med kræftceller. PLoS ONE 7 (12): e52682. doi: 10,1371 /journal.pone.0052682

Redaktør: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, USA

Modtaget: Juli 19, 2012; Accepteret: November 19, 2012; Udgivet: December 27, 2012 |

Copyright: © 2012 Fujiwara et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af JSP’er KAKENHI tilskud numre 24-1237, 23.390.327, 24.659.613, 23.659.654, 24.390.319, 22.591.524, 23-11109, 23659655, 24390318. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller tilberedning af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mest dødelige kræftformer, og dens 5-års overlevelse er kun 4% [1]. Det er kendetegnet ved overdreven desmoplasia, som spiller en afgørende rolle i dets aggressive adfærd [2], [3]. For nylig har forskning i kræft biologi med fokus på kræft-stroma interaktioner. Interaktioner mellem kræftceller og stromale væv er afgørende for udviklingen og progressionen af ​​tumorer [4]. Behandlinger rettet mod kræft-stroma interaktioner kan repræsentere en ny tilgang til styring af kræft i bugspytkirtlen.

pancreas stjemeformige celler (kvikskranker) er blevet identificeret som den vigtigste kilde til den overdrevne ekstracellulære matrix observeret i kronisk pancreatitis og pancreas adenocarcinom [ ,,,0],5], [6]. Svarende til hepatiske stjerneformige celler, en vigtig celletype til ekstracellulær matrix-produktion i hepatisk fibrose, kvikskranker opbevare fedtdråber indeholdende vitamin A i deres cytoplasma [7]. PSC bliver aktiveret ved stimulering af forskellige autokrine eller parakrine faktorer. De udtrykker α-glatmuskelactin (α-SMA) og producere forskellige ekstracellulære matrixproteiner [8], [9]. Opløselige faktorer udskilles af aktiverede PSC’er fremmer proliferation, migration, invasion, og overlevelse af kræft i bugspytkirtlen celler mod gemcitabin terapi [10]. Således PSC spiller en vigtig rolle i cancer-stroma interaktioner i bugspytkirtelkræft.

Adskillige rapporter tyder på, at stromale celler, såsom myofibroblasts og mesenchymale celler, isoleret fra forskellige humane væv udviser forskellige fænotyper [11], [12 ]. Vi har tidligere rapporteret, at CD10

+ PSC’er forbedre progression af bugspytkirtelkræftceller [13]. Disse observationer indikerer, at kvikskrankerne har funktionel heterogenitet og yderligere antyder, at kvikskrankerne kan indeholde flere andre cellesubpopulationer, som separat eller synergistisk påvirker udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen. Detaljeret karakterisering af kvikskrankerne i bugspytkirtelkræft vil bidrage til at klarlægge mekanismen bag samspillet mellem kræftceller og stromale celler, og kan tilvejebringe nye mål for stroma-rettet behandlingsformer.

CD271 (også kendt som nervevækstfaktorreceptor , NGFR eller p75NTR) er en neurotrophin receptor, som har været impliceret i parakrin vækstregulering af en række neuronale og ikke-neuronale tumortyper [14], [15]. Nylige undersøgelser har fokuseret på CD271 fordi det blev identificeret som en markør for humane mesenkymale stamceller [16] og det er blevet vurderet som en vigtig cancer stamcellemarkør i melanom [17]. CD271 kan være en markør for en specifik funktionel subpopulation, såsom stemness. I pancreas, er blevet detekteret CD271 ekspression i PSC [18]. Men CD271 ekspressionen hurtigt faldt efter celle isolation fra pancreas væv [19]. Derfor er fortsat uklart rolle CD271 ekspressionen i kvikskranker.

Formålet med denne undersøgelse var at identificere de specifikke kvikskranker, der påvirker udviklingen af ​​kræftceller ved at fokusere på ekspressionen af ​​CD271. Vi vurderede yderligere betydningen af ​​CD271-ekspression i kvikskranker.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Kyushu University (godkendelsesnummer, 23 -64) og udført i overensstemmelse med de etiske retningslinjer for menneskelige genom /Gene Research vedtaget af den japanske regering og Helsinki-erklæringen. Alle patienter skal have underskrevet informeret samtykke om godkendelse af brugen af ​​deres væv til uspecificerede forskningsformål. For alle forsøg med mus, blev dyrene anbragt i laminar flow kabinetter under specifikke patogenfrie betingelser, der er godkendt af Kyushu University (godkendelsesnummer, A24-112-0).

Patienter og pancreas væv

bugspytkirtelkræft væv blev opnået fra 105 patienter, som gennemgik bugspytkirtlen resektion for kræft i bugspytkirtlen på vores institution. De clinicopathologic karakteristika patienterne er beskrevet i tabel S1. Overlevelse blev målt fra tidspunktet for bugspytkirtlen resektion indtil døden. Prognose blev bestemt i september 2011. Den mediane samlede overlevelse var 23,5 måneder (interval, 1-114 måneder). Sixty-to patienter døde under opfølgning. Alle væv støder op til prøverne blev evalueret histologisk ifølge kriterierne af World Health Organization. Tumoren fase blev vurderet i henhold til den Union for International Cancer Control (UICC). Vi har også opnået 31 normale bugspytkirtlen (NP) prøver fra intakte bugspytkirtel væv resektion for galdegang kræft, godartet fast pseudopapillary tumor eller Neuroendokrin tumor til brug som kontrol væv. Vi yderligere samlet 10 pancreas intraepitelialneoplasi (Panin) og 39 intraduktal papillære mucinøs neoplasme (IPMN) prøver.

Immunohistokemiske procedurer og evaluering

immunhistokemisk farvning blev udført ved hjælp af en Histofine SAB-PO Kit (Nichirei , Tokyo, Japan). Væv blev snittet til en tykkelse på 4 um og blev inkuberet med monoklonalt muse-anti-CD271-antistof (1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) eller muse-monoklonalt anti-α-SMA-antistof (1:50; Dako, Glostrup , Danmark) natten over ved 4 ° C. Celler blev anset for at være positivt immunfarvet når membranen eller cytoplasmaet var plettet. Vi identificerede aktiveret PSC’er baseret på cellemorfologien (spindelformede celler) og deres identiteter blev bekræftet ved α-SMA-farvning. Vi tælles antallet af celler i mindst 10 felter per sektion ved 200 ganges forstørrelse. For at tage højde for heterogenitet i CD271 ekspressionen, blev fordelingen af ​​CD271 immunfarvning vurderes som procentdele af de farvede celler og scorede som følger: 0, 0%; 1, 25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; eller 4, 76-100%. Tilsvarende blev farvningsintensitet scoret som følger: 0, ingen farvning; 1, svag farvning; 2, moderat farvning; eller 3, stærk farvning. Endelig har vi beregnet farvningen score ved at gange den procentvise score ved intensiteten score. I de bugspytkirtelkræftceller, vi delte prøverne i høj farvning 3 og lav farvning 2 grupper. Alle objektglas blev vurderet uafhængigt af to efterforskere uden nogen viden om de kliniske funktioner i hvert enkelt tilfælde.

Celler og dyrkningsbetingelser

Menneskelige kvikskranker blev isoleret fra friske pancreas kirurgiske prøver vha den udvækst metoden i vores laboratorium [5], [20]. PSC celletype blev bekræftet ved morfologi (stjerneformige-lignende eller spindelformede celler) og ved immunfluorescensfarvning for α-SMA og vimentin [10], [13], [20]. PSC 1 og PSC3-9 blev isoleret fra kræft i bugspytkirtlen. PSC2 og PSC10 blev isoleret fra godartet pancreas cyste. PSC11 og pSC12 blev isoleret fra normale pancreas område af pancreascancer væv. Desuden har vi evalueret to bugspytkirtelkræft cellelinjer, SUIT-2 (Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japan) og Capan-2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). SK-N-MC, en human neuroepithelioma cellelinje (American Type Culture Collection), blev købt som en positiv kontrol for CD271 ekspression. Celler ved passager 3 til 8, blev anvendt til assays. Cellerne blev holdt som tidligere beskrevet [21].

Immunfluorescensfarvning og Laser-scanning konfokal mikroskopi

PSC’er (1 × 10

5) blev udpladet på glas-bottom retter (Matsunami , Osaka, Japan) og inkuberet i 24 timer. I kulturer med supernatant blev cellerne inkuberet i 10% føtalt bovint serum (FBS) /DMEM med supernatant afledt af bugspytkirtelkræftceller i 72 timer. Cellerne blev derefter fikseret med methanol, blokeret med 3% bovint serumalbumin i phosphatbufret saltopløsning (PBS) og inkuberet med et monoklonalt muse-anti-α-SMA-antistof (1:50; Dako), en kanin monoklonalt anti- vimentin antistof (1:50; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) og et monoklonalt muse-anti-CD271-antistof (1:50; Santa Cruz Biotechnology) natten over ved 4 ° C. Efterfølgende blev cellerne inkuberet med Alexa 488-konjugeret anti-muse-IgG eller 546-konjugeret anti-kanin IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) i 1 time. Nuclear-DNA blev modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (0,05 ug /ml). En laser-scanning konfokal fluorescerende mikroskop. (A1R, Nicon, Tokyo, Japan) blev anvendt, og billeder blev forvaltet ved hjælp NIS-Elements software (Nikon)

Flowcytometrianalyse

Dyrkede celler var opnået fra subkonfluente monolagskulturer og inkuberet med et fluorescein-isothiocyanat (FITC) -konjugeret anti-CD271-antistof (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Muse IgG1 K-isotypekontrol FITC (Miltenyi Biotec) blev anvendt som en negativ kontrol. De mærkede celler blev analyseret ved flowcytometri hjælp af en FACS Calibur (Becton Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ).

Real-time kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

Total RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse af et High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og DNase i (Roche Diagnostics). Real-time QRT-PCR blev udført under anvendelse af en QuantiTect SYBR Green Reverse Transcription-PCR-kittet (Qiagen, Tokyo, Japan) og en Chromo4 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Primere til CD271 og β-actin blev indkøbt fra Takara Bio Inc. (Tokyo, Japan). Sekvenserne af oligonukleotidprimerne anvendt i denne undersøgelse var som følger: CD271, 5′-TCAGTGGCATGGCTCCAGTC-3 ‘(fremad) og 5′-GCAGTATCCAGTCTCAGCCCAAG-3′ (revers); p-actin, 5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3 ‘(fremad) og 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’ (revers). Hver reaktionsblanding blev oprindeligt inkuberet ved 50 ° C i 30 minutter for at tillade revers transkription. PCR-amplifikation blev derefter initieret ved inkubering ved 95 ° C i 15 minutter for at aktivere polymerasen, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 20 s og 72 ° C i 30 s. Ekspressionsniveauerne af gener blev beregnet under anvendelse af en standardkurve konstrueret ved anvendelse af totalt RNA fra SK-N-MC-celler. Ekspressionsniveauerne blev normaliseret til p-actin ekspressionsniveauer som en intern kontrol, og udtrykt som forholdet af ekspression af målgenet til den for β-actin. Alle prøver blev kørt tredobbelt. Ingen påviselige PCR-produkter blev amplificeret uden forudgående revers transkription. Nøjagtigheden og integritet PCR-produkterne blev bekræftet ved hjælp af en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA).

In vitro cokultur systemet

In vitro

cokulturer blev udført under anvendelse af 6-brønds celledyrkningsinsert companion plader og 3,0-um cellekultur skær (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) som tidligere beskrevet [22]. SUIT-2 og Capan-2-celler (5 x 10

5) blev podet separat i de øvre kamre ved 24 timer efter podning to typer af PSC (5 × 10

5) ind i de nedre kamre.

Kultur med en cancercelle-afledte supernatant

SUIT-2 og Capan-2-celler blev dyrket under FBS-fri betingelser i 48 timer. Derefter vi samlet supernatanterne fra cancercellerne og justeret dem til 10% FBS. Kræftcellen-afledte supernatanter blev derefter sat til tidligere seedet PSC’er til efterfølgende kultur.

funktionel adskillelse af Matrigel invasion assay

Six-såvel cellekultur insert følgesvend plader og 8,0-um cellekultur indsætter (Becton Dickinson Labware) blev coatet med Matrigel (150 ug /brønd; BD Biosciences, Bedford, MA). PSC’er (5 x 10

5 celler /2 ml) blev podet i de øvre kamre. Tidligere cancerceller (5 x 10

5) blev podet i de nedre kamre. Derefter blev cellerne dyrket i 72 timer. Efterfølgende fjernede vi cellerne fra begge sider af de øvre kamre ved anvendelse af trypsin. Efter to centrifugeringer, vi ekstraheret mRNA fra cellerne. Hvert forsøg blev udført i tredobbelte brønde, og uafhængige forsøg blev gentaget tre gange.

In vivo forsøg

SUIT-2 pankreatiske cancerceller og to typer af PSC blev anvendt til

i vivo

eksperimenter. Celler blev inddelt i tre grupper, der omfatter SUIT-2 celler alene, SUIT-2 celler med PSC1 celler og SUIT-2-celler med PSC2 celler. SUIT-2-celler (5 x 10

5) og PSC (5 x 10

5) suspenderet i 100 pi PBS blev cotransplanted i pancreas hale af 6 uger gamle SCID-mus (FOX CHASE SCID® , CB-17 /LCR-SCID /scidJcl; Clea Japan Inc., Tokyo, Japan). Seks mus blev anvendt i hver gruppe. Tumorerne blev reseceret på dag 8, 15 og 22 efter implantation. Vævene blev fikseret i 10% neutral-pufret formalin og indlejret i paraffin. Fire um vævssnit blev farvet med et monoklonalt muse-anti-α-SMA-antistof (Dako) og et kanin-monoklonalt anti-CD271-antistof (Millipore, Billerica, MA). Salg

Statistisk analyse Salg

Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. Sammenligninger mellem to grupper blev udført ved hjælp af Students

t

-test. Statistisk signifikans blev defineret som værdier af p 0,05. En χ

2 test blev anvendt til at analysere sammenhænge mellem CD271 udtryk og de clinicopathologic egenskaber observeret i den immunhistokemiske analyser. Overlevelse analyser blev foretaget ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og kurverne blev sammenlignet under anvendelse af log-rank test. At evaluere uafhængige prognostiske faktorer i forbindelse med overlevelse, blev brugt en multivariat Cox proportional-risiko regressions analyse, med CD271 udtryk, pT kategori, lymfeknude metastaser, UICC stadium, perilymfatisk invasion, perivaskulær invasion, og patologisk margin som kovariater. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af JMP 8.0 software (SAS Institute, Cary, NC).

Resultater

Stromaceller udtrykker CD271 i bugspytkirtlen ductal adenocarcinom (PDAC)

For at evaluere CD271 ekspressionen i pancreas væv, udførte vi immunhistokemi for CD271. I overensstemmelse med en tidligere rapport [23], observerede vi en stærk farvning af nerver som en positiv kontrol. Epitelceller normale pancreas kanaler udviste ingen ekspression af CD271, og PDAC celler var ufarvede. I normal pancreas (NP) blev stromaceller omkring pankreasgangen sjældent farves (figur 1A-a). observerede vi imidlertid, at stromale celler kraftigt blev farvet omkring pancreas intraepitelialneoplasi (Panin) (figur 1A-b) og intraduktal papillære mucinøs neoplasme (IPMN) (figur 1A-C). I PDAC tumorer blev stromale celler omkring bugspytkirtelkræftceller delvist farves. Imidlertid CD271

+ stromaceller var ikke støder op til kræftceller i PDAC, og var stærkt farvet ved kanten snarere end midten af ​​tumorerne (Figur 1A-D). CD271 høj farvning i stromale celler var til stede i 6,5% (2/31) af NP, 30,0% (3/10) af Panin, 27,6% (29/105) af PDAC og 84,6% (33/39) af IPMN. De CD271 high farvende signifikant højere i stromale celler af IPMN (p 0,0001). Og PDAC (p = 0,0069) end i stromale celler af NP (tabel 1)

(A) Immunohistokemisk farvning for CD271 i pancreas væv. (A-a) I normal pancreas (NP), stromale celler sjældent farvet positive for CD271. (A-b, -c) Stromaceller stærkt farves omkring pancreas intraepitelialneoplasi (Panin) (b) og intraduktal papillære mucinøs neoplasme (IPMN) (c). (A-D) I pancreas duktale adenocarcinomer (PDAC), er stromaceller delvist farves, og CD271

+ stromale celler ikke støder op til bugspytkirtelkræftceller. Sorte pilespidser og pile angiver CD271

+ celler og nerver som positiv kontrol i de serielle snit. (A-E) α-glatmuskelactin (SMA) udtrykkes mest stromaceller omkring cancerceller og neoplastiske tubuli. Hvide pilespidser angiver a-SMA celler i serielle sektioner. Original forstørrelse: 200 ×, sten indlæg: 600 ×. (B) Kaplan-Meier overlevelsesanalyse for CD271 høj ekspression i stroma af PDAC. Stromal CD271 høj ekspression er forbundet med en god prognose (p = 0,0040).

Stromal CD271 udtryk uafhængigt korreleret med god prognose

Vi evaluerede korrelationer mellem stromale CD271 udtryk og de clinicopathologic faktorer af PDAC. Selvom forskelle ikke nåede statistisk signifikans, PT1 /pT2, ingen lymfeknude metastaser, UICC fase I, ingen perilymfatisk invasion, ingen perivaskulær invasion, og patologisk margin /negativ blev observeret hyppigere i det stromale CD271high farvning end i det stromale CD271 lav farvning gruppe (tabel 2). Interessant nok blev stromal CD271 ekspression er forbundet med en god prognose i pancreascancer (p = 0,0040) (figur 1B). De median overlevelse for CD271 høj farvning og CD271 lav farvning patienter var 62 og 18,5 måneder. Dernæst udførte vi en multivariat overlevelse analyse baseret på Cox proportional hazard model for alle parametre vist sig at være væsentlig ved univariate analyser, herunder stromale CD271 udtryk, pT kategori, lymfeknude metastaser, UICC stadium, perilymfatisk invasion, perivaskulær invasion, og patologiske margin positivitet (tabel S2). Stromal CD271 ekspressionen viste sig at være en uafhængig prognostisk markør i bugspytkirtlen kræftpatienter, og den relative risiko for stromale CD271 ekspressionen var 0,495 (tabel 3).

CD271 stromale celler er en underpopulation af aktiverede PSC’er

for at karakterisere CD271

+ stromale celler, udførte vi immunhistokemi for α-SMA, en markør for aktiverede PSC’er på serielle PDAC sektioner. Vi fandt, at α-SMA blev udtrykt i de fleste stromaceller omkring cancerceller og neoplastiske tubuli (figur 1A-e). CD271

+ stromaceller var begrænset til områder med stærk α-SMA udtryk. Disse resultater viser, at CD271

+ stromale celler er en delpopulation af aktiverede PSC’er.

CD271 udtryk i menneskelige kvikskranker

Vi isoleret fem primære kulturer af kvikskranker fra friske humane pancreas væv, og deres identitet blev bekræftet ved immunfluorescensfarvning. PSC var stjerneformet-lignende eller spindel-formet og udtrykt α-SMA og vimentin (figur 2A). I disse immunfluorescens analyser, vi ikke registrere CD271 ekspression i kvikskranker (data ikke vist). Dernæst evalueres vi CD271 ekspression i 12 primære kulturer af humane PSC’er anvendelse af flowcytometri, og fundet CD271-positive satser på 0,0-2,1% i PSC (figur 2B).

(A) repræsentant mikrofotografi af immunfluorescensfarvning for a-glatmuskelactin (SMA) (grøn) og vimentin (rød) i PSC. Kerner blev modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (blå). PSC viser en stjerneformet-lignende eller spindel-formet morfologi og udtrykke α-SMA. Original forstørrelse: 200 ×. (B) De positive satser for CD271 udtryk i kvikskranker er 0,0-2,1% af flowcytometrisk analyser. Repræsentative flowcytometriske billeder af CD271 i aktiverede kvikskranker er også vist (til højre).

CD271

+ kvikskranker øges gennem kræft-stroma interaktioner

Vi undersøgte effekten af ​​kvikskrankerne på fænotypen af ​​cancerceller under anvendelse af en cokultur system. Vi brugte to bugspytkirtelkræft cellelinjer, søgsmål-2 og Capan-2, og to primære kulturer af humane kvikskranker isoleret fra PDAC og godartede bugspytkirtlen cyster. Efter monokultur eller co-kultur med bugspytkirtelkræftceller i 72 timer, vurderet vi CD271 ekspression i PSC’er anvendelse af flowcytometri og real-time QRT-PCR. Ved flowcytometri analyser, observerede vi procentdelen af ​​CD271

+ -celler højere i cokultur end i monokultur (0,7% vs. 0,1%) (figur 3A). Af real-time QRT-PCR-analyser, niveauet af CD271 mRNA-ekspression i to kulturer af PSC’er var signifikant højere i cokultur med bugspytkirtelkræftceller end i monokultur (p 0,001) (figur 3B). Dernæst vi samlet supernatant fra SUIT-2 i bugspytkirtlen kræftceller, og tilføjet det til to primære kulturer af kvikskranker. Vi sammenlignede niveauerne af CD271 mRNA-ekspression blandt monokulturer, kulturer med cancercellen-afledte supernatant, og cokulturer med bugspytkirtelkræftceller i 72 timer. Niveauet af CD271 mRNA-ekspression var højest i cokulturer med bugspytkirtelkræftceller. Desuden er niveauet af CD271 mRNA-ekspression var højere i kulturer med cancercellen-afledte supernatant end i monokulturer (p = 0,0053) (figur 3C). Ved immunfluorescens analyser, vi har registreret CD271 ekspressionen i kvikskranker blev let øget i kultur med kræftcellen-afledte supernatant i modsætning til monokulturer (Figur 3D).

(A) I flowcytometri analyser, procentdelen af ​​CD271

+ -celler højere i cokultur end i monokultur (0,7-0,8% vs. 0,1%). (B) Niveauerne af CD271 mRNA ekspression i to kulturer af kvikskranker er betydeligt højere i cokultureme med bugspytkirtelkræftceller end i monokulturer (p 0,001). (C) Niveauet af CD271 mRNA-ekspression er højere i kulturer med en cancercelle-afledte supernatant end i monokulturer (p = 0,0053). (D) repræsentant mikrofotografi af immunfluorescensfarvning for CD271 (grøn) og α-glatmuskelactin (SMA) (rød) i PSC. Kerner blev modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (blå). CD271 i PSC’er var lidt udtrykt i kulturer med cancercelle-afledte supernatant, selv om det var vanskeligt at påvise CD271 ekspression i monokulturer. Original forstørrelse: 200 ×. * P 0,01; ** P. 0,001

CD271 udtryk falder efter den forbigående stigning i udtryk, når dyrket sammen med bugspytkirtelkræftceller

Vi brugte et cokultur system bestående af to bugspytkirtelkræft cellelinjer, SUIT -2 og Capan-2, og to primære kulturer af humane kvikskranker at evaluere de tidsafhængige ændringer i CD271 mRNA ekspression. Efter monokultur eller cokultur af kvikskranker med bugspytkirtelkræftceller for 1 til 5 dage, vi vurderet niveauet af CD271 mRNA ekspression i kvikskrankerne. I monokulturer, havde ekspressionen af ​​CD271 mRNA i kvikskrankerne ikke ændre. Men i cokultureme med bugspytkirtelkræftceller, niveauet af CD271 mRNA-ekspression steget på dag 3 (p = 0,0249) og toppede på dag 4 (p 0,0001). Interessant niveauerne af CD271 mRNA-ekspression faldt dagen efter topekspression (p 0,0001) (figur 4A). Dernæst vi samlet supernatant fra Capan-2 bugspytkirtelkræftceller, tilføjet det til to primære kulturer af kvikskranker og vurderet de tidsafhængige ændringer i CD271 mRNA ekspression. I kulturer med supernatant, niveauet af CD271 mRNA-ekspression øget på dag 2 (p 0,0001) og faldt derefter på dag 4 (p 0,0001) (figur 4B). Svarende til co-dyrkning med bugspytkirtelkræftceller, CD271 ekspressionen faldt efter forbigående stigning i udtryk, når dyrket sammen med supernatant.

(A) Real-time QRT-PCR-analyser viste, at niveauerne af CD271 mRNA ekspression i kvikskranker i cokultur med bugspytkirtelkræftceller begynde at stige på dag 3 (p = 0,0249), er højest på dag 4 (p 0,0001), og derefter falde den følgende dag efter højdepunktet udtryk (p 0,0001). (B) I kulturer med tilsætning af cancercelle-afledte supernatant, niveauet af CD271 mRNA-ekspression begyndte at stige på dag 2 (p 0,0001) og faldt derefter på dag 4 (p 0,0001). (C) Vurdering af forskellene i CD271 udtryk afhængig af funktion af PSC ved real-time QRT-PCR. Niveauet af CD271 mRNA ekspression i oversiden-afledte PSC’er, som ikke bevæger sig i retning af kræftceller gennem Matrigel og forblev på øverste kamre, er lavere end i bunden-afledte PSC’er, som ikke bevæger sig i retning af bugspytkirtelkræftceller gennem Matrigel (p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ikke signifikant.

CD271 udtryk er faldet i kvikskranker migrerer gennem Matrigel mod bugspytkirtelkræftceller

Dernæst vi evaluerede CD271 ekspressionen i kvikskranker efter funktionel adskillelse hjælp Matrigel invasion assay. I denne kultur, der involverer øverste kamre belagt med Matrigel, vi evalueret SUIT-2 bugspytkirtelkræftceller og to primære kulturer af humane kvikskranker. PSC’er i de øvre kamre blev inkuberet i 72 timer i kultur med bugspytkirtelkræftceller i de nedre kamre, eller som kontroller uden bugspytkirtelkræftceller i de nedre kamre. PSC blev opsamlet fra de øverste og nederste sider af de øvre kamre separat. Oversiden-afledte PSC’er var celler, som ikke migrerer mod cancercellerne gennem Matrigel og forblev i de øvre kamre. De nederste side-afledte PSC’er var celler, der migrerede mod bugspytkirtelkræftceller gennem Matrigel og opsamlet på undersiden af ​​de øvre kamre. Vi analyserede derefter CD271 mRNA-ekspressionsniveauer i de øverste eller nederste side-afledte PSC’er at vurdere de funktionelle forskelle mellem CD271

+ og CD271

– kvikskranker. Niveauet af CD271 mRNA-ekspression var højest i oversiden-afledte PSC’er efter kultur med bugspytkirtelkræftceller (p 0,001). Interessant niveauet af CD271 mRNA-ekspression i bundsiden-afledte PSC’er migrerer mod bugspytkirtelkræftceller var lavere end i oversiden-afledte PSC’er der ikke bevæger sig mod cancerceller (p 0,01). I kontroller, var der ingen forskel i CD271 mRNA ekspression niveauer mellem øverste og nederste side-afledte kvikskranker, og disse niveauer var lav sammenlignet med niveauerne af CD271 mRNA ekspression i kulturer med bugspytkirtelkræftceller (Figur 4C).

CD271

+ kvikskranker er til stede i tumor margener /periferien og er fraværende i tumoren kerne

for at vurdere lokalisering af CD271

+ kvikskranker

in vivo

, vi transplanterede SUIT -2 bugspytkirtelkræftceller ind i bugspytkirtlen halen af ​​SCID-mus, eller cotransplanted dem med to primære kulturer af humane kvikskranker. Vi aflivet musene på dag 8, 15 eller 22, og evaluerede lokalisering af CD271

+ PSC’er i xenotransplantattumorer. Stromal CD271 ekspressionen blev detekteret på alle dage efter transplantation, uanset transplantation eller cotransplantation. Stromal CD271 high farvende satser var 50% (3/6), 60% (3/5), og 67% (4/6) på dag 8, 15 og 22, henholdsvis. I alle tilfælde opdaget vi CD271 udtryk på nerve bundter som en positiv kontrol, og fandt, at bugspytkirtelkræftceller aldrig udtrykt CD271. Vi bekræftede tilstedeværelsen af ​​aktiverede PSC’er af en spindel-formet morfologi og ved α-SMA-farvning. Aktiverede PSC’er eksisterede i xenograft-tumorer og normale pancreas områder omkring tumorerne (figur 5A). Men CD271

+ kvikskranker eksisterede kun i de normale pancreas områderne omkring xenotransplantattumorer, og var fraværende i tumoren kerne (figur 5B).

(A) α-SMA

+ stromale celler , som aktiverede kvikskranker, findes i xenograft tumor og normal bugspytkirtlen (NP) områder (venstre side) omkring tumor (højre side). (B) Et par CD271

+ stromaceller var til stede i området NP (venstre side) omkring xenograft tumor, og var fraværende i tumoren kerne (højre side). Original forstørrelse:. 200 ×

Diskussion

Tidligere Trim et al [18], rapporterede, at CD271 blev udtrykt i kvikskranker.. Haas et al., [19] rapporterede også, at CD271 lidt blev udtrykt i PSC og at niveauet af CD271 mRNA-ekspression hurtigt faldt i primære rotte PSC’er under dyrkning. Vi fandt, at der forelå CD271

+ kvikskranker i kirurgiske pancreas væv ved hjælp immunhistokemi. Imidlertid QRT-PCR og flowcytometri afslørede, at CD271 ekspression i PSC’er isoleret fra pancreas væv var meget svag. Disse resultater tyder på, at CD271 ekspressionen i primære humane kvikskranker også hurtigt faldt i kultur.

Vi fandt, at CD271 mRNA ekspression forbigående blev øget i PSC dyrket sammen med bugspytkirtelkræftceller, tyder på, at bugspytkirtelkræftceller forbedre CD271 ekspressionen i kvikskranker. afslørede imidlertid de nuværende immunhistokemiske analyser, at CD271

+ kvikskranker også eksisterede omkring Panin og IPMN, forstadier til kræft. Desuden Trim et al., [18] rapporterede, at CD271

+ kvikskranker blev fundet i væv fra kronisk pancreatitis patienter. Disse observationer tyder udseendet af CD271

+ kvikskranker er ikke specifik for maligne sygdomme, og er relateret til desmoplasia.