PLoS ONE: Den rolle Alpha 6 Integrin i prostatakræft Migration og knoglesmerter i en roman xenograftmodel

Abstrakt

Af de anslåede 565,650 mennesker i USA, der vil dø af kræft i 2008, næsten alle vil have metastaser. Bryst, prostata, nyre, thyroid og lungekræft metastaserer til knoglen. Tumor celler opholde sig knoglen ved hjælp integrin typen celleadhæsionsreceptorer og fremkalde invaliderende knoglesmerter og knoglebrud. Navnlig metastatiske humane prostatatumorer udtrykke og spalte integrin A6, en receptor for ekstracellulære matrixbestanddele af knoglen, det vil sige, laminin 332 og laminin 511. Over 50% af alle patienter med prostatacancer udvikler alvorlige smerter knogle under deres resterende levetid. Et vigtigt mål er at forhindre eller forsinke kræft fremkaldt knoglesmerter. Vi anvendte en hidtil ukendt xenotransplantat musemodel til direkte at bestemme, om knoglesmerter kunne forhindres ved at blokere den kendte spaltning af A6 integrin vedhæftning receptor. Humane tumorceller, der udtrykker enten vildtypen eller muteret A6 integrin blev anbragt i den levende knoglematrix og 21 dage senere blev integrin ekspression bekræftet ved RT-PCR blev røntgenbilleder opsamlet og adfærdsmæssige målinger af spontane og fremkaldte smerte udført. Alle dyr er uafhængige af integrin status havde ikke skelnes tumorbyrde og udviklet knogletab 21 dage efter operationen. En sammenligning af dyr, der indeholder vildtype eller muteret integrin afslørede, at tumorceller, der udtrykker det muterede integrin resulterede i en dramatisk nedgang i knogletab, unicortical eller bicortical frakturer og et fald i evnen af ​​tumorceller for at nå epifyseskivernes af knoglen. Endvidere tumorceller i knoglen udtrykker integrin mutation forhindret kræft induceret spontan blinke, taktil allodyni, og bevægelse fremkaldt smerte. Forebyggelse A6 integrin spaltning på prostata tumorcelleoverfladen faldt migrationen af ​​tumorceller i knoglen og indtræden og graden af ​​knoglesmerter og knoglebrud. Disse resultater antyder, at strategier til at blokere spaltningen af ​​adhæsionsreceptorer på tumorcelleoverfladen kan forebygge kræft fremkaldt knoglesmerter og langsom sygdomsprogression i knoglen betydeligt. Da integrin spaltning formidles af urokinase-plasminogenaktivator (uPA), er yderligere arbejde berettiget til at teste effektiviteten af ​​uPA-inhibitorer til forebyggelse eller forsinkelse af kræft fremkaldt knoglesmerter

Henvisning:. Kong TE, Pawar SC, Majuta L, Sroka IC, Wynn D, Demetriou MC, et al. (2008) Den rolle Alpha 6 Integrin i prostatakræft Migration og knoglesmerter i en roman xenograftmodel. PLoS ONE 3 (10): e3535. doi: 10,1371 /journal.pone.0003535

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: 27. juni, 2008; Accepteret: September 26, 2008; Udgivet: 28 Oktober 2008

Copyright: © 2008 King et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev delvist understøttet af NIH tilskud CA56666, CA23074, og GM008718. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

af de anslåede 565,650 mennesker i USA, der vil dø af kræft i 2008, næsten alle vil have metastaser [1]. Bryst, prostata, nyre, thyroid og lungekræft metastaserer til knoglen. Tumorcellerne i knoglen fremkalde osteolytiske og osteoblastiske reaktioner og invaliderende knoglesmerter og knoglebrud [2], [3]. Et vigtigt mål er at forhindre eller forsinke kræft fremkaldt knoglesmerter. Invasive og metastatiske humane prostatatumorer express integrin A6B1, en receptor for ekstracellulære matrixbestanddele af knoglen, dvs, laminin 332 og laminin 511 [4] – [10]

human prostatacancer er en indolent sygdom kendetegnet ved. progressive vedhæftning ændringer i løbet af overgangen fra normale kirtler til prostata intraepitelialneoplasi (PIN) til invasiv cancer [5], [16] – [19]. Nyligt arbejde har vist ændring i de normale menneskelige prostata væv organisation og adhæsionsmolekyler under prostata tumor progression [5], [15]. Flygte fra prostatakirtlen og invasion gennem kapslen er forbundet med dårlig prognose henviser begrænset sygdom kan behandles. Ændringer i adhæsionsmolekyler og de nedstrøms signalering konsekvenser kan forklare den stimulerede invasion af tumorceller fra deres oprindelsessted. Integriner er transmembran heterodimer celleadhæsionsreceptorer [15]. Integrin udtryk inden for den normale prostata afspejler mangfoldigheden i de ekstracellulære matrixkomponenter. Normale mønstre af integrin udtryk holdes i læsioner, hvor normale basale celler tilbageholdt og invasion har ikke fundet sted (dvs. PIN-læsioner) [5], [16] – [19]. Men inden for invasive carcinomer, at størstedelen af ​​integrinreceptorerne enheder er ikke observeret på tumorcellen overflader. En bemærkelsesværdig undtagelse til den omsiggribende tab af integrin udtryk er vedholdende udtryk for de laminin receptorer, A3 (10% af tilfældene) og A6 (69% af tilfældene) integriner, observeret i invasive menneskelige prostata carcinoma opnået efter radikal prostatektomi [5], [17]. Undersøgelser indikerer, at laminin receptorer A6B1 og A3B1 opretholdes i størstedelen af ​​prostatacarcinomer. Under den menneskelige PIN-kode til prostatacarcinom overgang, er A6B4 integrin udtryk tabt og A6B1 integrin dominerer i invasiv menneskelig prostatakræft og i metastatiske læsioner [4], [6]. Talrige undersøgelser har impliceret A6 integriner i kræft progression [20]. De ekstracellulære ligander for A6B1 er laminin 332 og 511, fremtrædende bestanddele af mennesker og mus knoglemarv [7], [21].

En inspektion af A6B1 integrin udtryk på prostata tumorceller afslører en ny strukturel variant på celleoverfladen kaldet A6pB1 [11], [14], [22]. A6 integrin underenheden spaltes i halve ved tumor celleoverfladen ved specifikke aminosyrerester resulterer i tab af beta tønde domæne og forlader resten af ​​receptoren intakt [12]. Prostata tumorceller, der udtrykker et muteret receptor, der ikke kan spaltes, resulterede i en inhibering af tumorcellemigration på laminin 332 under vævskulturbetingelser [13].

I denne undersøgelse bestemte vi hvis integrin spaltning ville påvirke tumorcelle migration inden for en klinisk relevant metastase site, såsom knogle. Vi anvendte en hidtil ukendt xenotransplantat musemodel af knoglesmerter til direkte at bestemme virkningerne af humane tumorceller anbragt inden i levende knoglematrix på kræft induceret knoglesmerte. Knoglemarven er rig på laminin 332 (laminin 5) og laminin 511 (Laminin 10) [8], [9], liganderne for A6B1 integrin [7]. Vi yderligere testet påvirkningen af ​​kræft fremkaldt knoglesmerter da tidligere arbejde stærkt impliceret integriner i vedligeholdelse af neuropatisk smerte [23].

Resultater

Derfor brugte vi PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR prostatacancerceller, der udtrykker tilsvarende niveauer af vildtype-A6 underenhed (spaltelig til A6p via uPA behandling) og den ikke-spaltelige underenhed, (fig. 1a). De overfladekoncentration af receptorerne var tilsvarende som bestemt ved flowcytometri (FACS) analyse (fig. 1b). Evnen til at spalte receptoren ved Urokinase-plasminogenaktivator (uPA) og frembringelsen af ​​A6p strukturelle variant er vist skematisk (fig. 1c). Vi næste testet funktionelle egenskaber A6 integrin ved anvendelse af en laminin 111 matrix, matrigel, modificeret til at indeholde laminin 332. Matrigel er en laminin rig ekstracellulær matrix, som modeller fysiologisk relevante betingelser [24]. De PC3N-A6-WT-celler migreret inden matrigel på en måde, der var integrin afhængig (fig. 1d). De celler, der indeholder uncleavable receptor, PC3N-A6- RR, var ude af stand til at migrere i matrigel, i overensstemmelse med tidligere resultater ved anvendelse af rutinemæssige vævsdyrkningsbetingelser (fig. 1d) [13].

(A) Ekspressionen af fuldlængde 6 integrin (6) og uPA afhængige produktion af 6p variant (6p) blev bestemt ved western blot-analyse. Integrin status inden totale cellelysater fra doxycyclin (Dox) eller urokinase (uPA) ubehandlet (-) og behandlet (+) PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR-cellelinier blev bestemt. (B) overfladeekspression af vildtype og muteret integrin 6 i doxycyclin induceret PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR-celler blev bestemt ved flowcytometri. PC3N-A6-WT og PC3NA6- RR celler blev inkuberet med primære rotte-anti-integrin A6 antistof J1B5 efterfulgt af Alexa 488 anti-rotte-antistof og fremkaldes med BD FACScan. Det grå top angiver fluorescenssignal fra kun sekundært antistof. (C) Skematisk at illustrere spaltning af den fulde længde formen af ​​6 integrin til opnåelse af 6p variant. vises Definitionen af ​​PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR celler med hensyn til integrin status. (D) Integrin medieret migration af PC3N-A6-WT celler (top paneler) og PC3NA6- RR celler (nederste paneler) på matrigel. Cellerne blev anbragt på matrigel i nærvær af et dækglas for at skabe en cellefri zone på matrigel overflade. Efter celleadhæsion var fuldstændig, blev dækglassene fjernet fra matrigel overflade for at tillade migration i cellefri zone indikeret ved hvid eller sort buet linie. Celler migration opstod under optimale vækstbetingelser ved 37 ° C ca. 18 timer. Cellerne blev enten lov til at migrere i fravær (venstre paneler) eller tilstedeværelse (højre paneler) af integrin blokerende antistof AIIB2. Billeder blev opsamlet under anvendelse af et Zeiss Axiovert-mikroskop udstyret med en 2,5X mål.

For at bestemme virkningen af ​​humane prostatacancerceller i knoglen, vi tilpasset Clohisy-Mantyh murin model, hvor kræft celler injiceres direkte og forseglet i lårbenet på en mus [25]. Mandlige SCID-mus blev bedøvet med ketamin /xylazin og en arthrotomi udførtes udsætter kondylerne af den distale femur som tidligere beskrevet [26]. Et hul blev boret i femur til kanylen for at sikre nøjagtig placering af tumorceller i knoglen. Den nøjagtige placering af nålen i det intramedullære rum af femur blev bekræftet ved billeddannelse (fig. 2a, venstre panel). Humane prostata tumorceller blev injiceret i det højre ben af ​​musen og injektionsstedet forseglet med dental amalgam (fig. 2a, højre panel).

(A) røntgenbilleder blev taget for at verificere nålens placering inde det intramedullære rum af lårbenet op til den distale tredjedel af knoglen (venstre panel). Tumorcellerne blev forseglet ind i knoglen (højre panel). (B) røntgenbilleder taget 21 dage efter injektion indikerer knogletab enten fra ubehandlede mus (kontrol) eller mus injiceret med tumorceller, der udtrykker vildtype-integrin (PC3N-A6-WT) eller den muterede integrin (PC3N-A6-RR). (C) Kvantificering af knogletab hos dyr enten sham injiceret (kontrol) eller injiceret med tumorceller, der udtrykker vildtype-integrin (PC3N-A6-WT) eller den muterede integrin (PC3N-A6-RR). Knogletab blev vurderet ifølge den følgende 5 punkts skala: 0 = normal, 1 = knogletab observeret i mindre end halvdelen af ​​den distale tredjedel af knoglen, 2 = knogletab observeret i mere end halvdelen af ​​den distale tredjedel af knoglen, ingen brud, 3 = fuld tykkelse unicortical knogletab indikerer unicortical knoglebrud, 4 = fuld tykkelse bicortical knogletab indikerer bicortical knoglebrud. (D) Den procent af mus med fraktur 21 dage efter operationen. Antallet af mus i hver gruppe var tolv.

Vi næste bestemmes de skadelige virkninger af tumorceller, der er bosiddende i knoglen ved hjælp standard radiografisk billeddannelse i levende dyr 21 dage efter operationen. Alle dyr injiceret med PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR celler udviklet knogletab 21 dage efter operationen (fig. 2b). Billeder viste konsekvent osteolytiske aktivitet, navnlig af metafysale knoglen ved den distale (knæ) ende af lårbenet. Mus injiceret med PC3N-A6-WT-celler viser dramatisk mere knogletab sammenlignet med dem injiceret med PC3N-A6-RR-celler. Nr knogletab blev observeret hos dyr injiceret med medier alene (figur 2b). Dyr injiceret med PC3N-A6-WT-celler viste øget knogletab sammenlignet med dem injiceret med PC3N-A6-RR-celler (fig. 2B). Røntgenbillederne blev vurderet ifølge en 4 punkts skala, hvor 0 angiver normal knogle og 3 angiver fuld tykkelse bicortical knogletab (fig. 2c). Dyr injiceret med PC3N-A6-WT celler viste en dramatisk stigning i frakturer (unicortical eller bicortical) 21 dage efter operationen sammenlignet med de PC3N-A6-RR-behandlede mus (fig. 2D). Disse data viser, at placering af tumorceller i knoglen indeholder en ikke-spaltelige A6 integrin resulterer i en betydelig forsinkelse i udviklingen af ​​knogletab.

Selvom de billeddannende resultater givet oplysninger om alvorlige knogle ødelæggelse, det gjorde ikke giver direkte information om fordelingen af ​​tumorcellerne. Knogletab er en konsekvens i en del af tumorceller hjemmehørende i knoglen; en begivenhed, der dramatisk påvirker den kritiske balance mellem osteolytiske og osteoblastisk aktivitet [3]. Vi direkte undersøgt fordelingen af ​​tumorcellerne i knoglen ved hjælp af histologisk analyse af hæmotoxylin- og eosin-farvning af afkalkede prøver. Musen knogler blev omhyggeligt orienteret med henblik på langsgående sektionering at omfatte observere epifyseskivernes samt det distale område af knoglen i det samme afsnit (fig. 3A, top panel). Analysen af ​​knoglerne fra tumoren injicerede dyr demonstrerede tilstedeværelsen af ​​tumor i hele intramedullære rum af knoglen i dem injiceret med PC3N-A6-WT-celler sammen med invasion i den korticale knogle (fig. 3A, centerpanelet). Tumorcellerne indeholdende den spaltelige integrin havde nået epifyseskivernes; knoglemarven blev helt erstattet. Dette resultat er i overensstemmelse med den viden, at når prostatakræft har etableret sig i knoglemarv vil det til sidst erstatte marven, afbryde knoglehomøostase [3]. I modsætning hertil PC3N-A6-RR injicerede dyr indeholdt tumorceller i midten af ​​akslen område af knoglen, og tumoren ikke nå epifyseskivernes. Normal knoglemarv var til stede i de områder, som ikke indeholdt tumorceller (fig. 3A, bottom panel). Tumorcellerne i de mellemste aksel region eller dem, der havde nået epifyseskivernes var levedygtige og skelnes morfologisk. (Fig. 3A, center og bundpanelet, sten indlæg). Tumoren fordeling mønster viste sig at være konsekvent i den histologiske analyse af alle forsøgsdyrene analyserede.

(A) Hematoxylin-eosin farvning af normale knogler (kontrol) eller knogle injiceres med PC3N-A6-WT celler (WT, midterste panel og indsat) og PC3N-A6-RR-celler (RR, nederste panel og indsat). Væksten plade af knoglen (epifyseskivernes) er orienteret ved øverst til venstre i hvert panel med henblik på sammenligning. (B) RT-PCR-analyse for at påvise ekspression af det muterede 6 integrin i knoglemarven. Enogtyve dage efter injektion blev knoglemarv høstet, RNA blev ekstraheret og analyseret. RNA fra PC3N-A6-WT-celler og PC3N-A6-RR celler, der vokser i vævskultur blev sammenlignet med knoglemarv isoleret fra mus injiceret med PC3N-A6-WT-celler (knoglemarv-WT-celler) eller PC3NA6- RR celler (knogler marv-RR-celler). GAPDH amplifikation blev udført som kontrol og de kB markører er som vist.

For at bekræfte, at de injicerede tumorceller udtrykte det muterede integrin, 21 dage efter injektion af PC3N-A6-WT eller PC3N-A6-RR celler blev marven udtrykt fra intramedullære rum musen lårben. Analyse af knoglemarv prøver resulterede i mRNA specifik for PC3N-A6-RR celler i marv fra mus injiceret med PC3N-A6-RR, men ikke PC3N-A6-WT mus. Disse data indikerede, at PC3N celler transficeret med uncleavable A6 integrin opretholdes ekspression af den mutante integrin inden det intramedullære rum af lårben og var til stede 21 dage efter injektion af cellerne ind i lårbenet (Fig. 3B).

adfærdsmæssige analyser af spontane og fremkaldte smerte blev bestemt 21 dage efter injektion af PC3N-A6-WT eller PC3N-A6-RR-celler til lårbenet at vurdere betydningen af ​​spaltning af A6 integrin på udviklingen af ​​spontan og fremkaldte cancersmerter adfærd. Spontan smerte blev målt ved at vurdere blinke af canceren behandlet bagbenet som tidligere beskrevet [26]. Mus injiceret med PC3N-A6-WT-celler viste øget spontan blinke adfærd sammenlignet med PC3N-A6-RR-behandlede mus, som viste lave niveauer af blinke som var sammenlignelige med kontroldyr (fig. 4a). Fremkaldte smerte, som angivet ved taktil allodynia blev bestemt ved pote tilbagetrækning fra sondering af bagpoten ipsilateralt til cancer behandlet lårben med kalibrerede von Frey-filamenter som beskrevet tidligere [26]. Mus injiceret med PC3NA6-WT celler viste taktil allodyni som angivet ved sænkning af pote tilbagetrækning fra von Frey-filamenter (fig. 4b). I modsætning hertil PC3N-A6-RR injicerede mus viste ikke taktil allodyni, med pote-tilbagetrækning tærskler lignende til at styre dyr (fig. 4b). Bevægelse fremkaldte smerte blev bestemt efter bedømmelse anvendelse lemmer under normal ambulant bevægelse som tidligere beskrevet [26]. Mus injiceret med PC3N-A6-WT celler udviklede bevægelse fremkaldt smerte hvorimod mus injiceret med PC3N-A6-RR celler viste ingen bevægelse-fremkaldte smerter, med brug lemmer ratings den samme som kontroldyr (Fig. 4c).

(A) Spontan smerte som målt ved blinke af den ipsilaterale bagben blev bestemt i sham-injicerede dyr (kontrol) eller dem injiceret med tumorceller, der udtrykker vildtype-integrin (PC3N-A6-WT) eller dem injiceret med tumorceller, der udtrykker det muterede integrin (PC3N-A6-RR). Elevation i blinke adfærd er tegn på en øget smerte reaktion. (B) Taktil allodyni målt ved pote-tilbagetrækning fra von Frey-filamenter i sham-injicerede dyr (kontrol) eller dem injiceret med tumorceller, der udtrykker vildtype-integrin (PC3N-A6-WT) eller dem injiceret med tumorceller, der udtrykker det muterede integrin (PC3N-A6-RR). Et fald i tærsklen tilbagetrækning er tegn på en øget smerte reaktion. (C) bevægelse fremkaldte smerte blev observeret i sham-injicerede dyr (kontrol) eller dem injiceret med tumorceller, der udtrykker vildtype-integrin (PC3N-A6-WT) eller dem injiceret med tumorceller, der udtrykker det muterede integrin (PC3N-A6-RR) .

Disse data indikerer, at spaltning af integrin A6 påvirket udviklingen af ​​cancerinduced spontane og fremkaldte smerter forbundet med knogletab og knoglebrud. Forebyggelse spaltning af integrin A6 drastisk reduceret knogletab og udvikling af cancerinduced smerte. I modsætning hertil forøget ekspression af spaltelige A6 integrin cancerinduced knogletab og knoglebrud med en samtidig stigning i smerte adfærd.

Diskussion

I denne undersøgelse vi udnyttet en direkte indsprøjtning knogle model til specifikt at placere menneske prostatatumorceller direkte i fysiologisk og klinisk relevant knogle miljø, rig på laminin 332 og 511. Dette tillod os at bestemme, om blokering produktion af et laminin receptor (A6pB1) ville ændre evnen af ​​tumorcellerne til at migrere eller ændre miljøet i knoglen og om dette holdt funktionel betydning med hensyn til knoglesmerter.

resultaterne viste, at modificere produktionen af ​​A6pB1 laminin receptor på tumorcelleoverfladen bemærkelsesværdigt kan hindre migration i knoglen. Den direkte injektion model giver mulighed for den præcise placering af kendte antal kræft- celler i knoglen. Da tumorcellerne vokser lige godt uafhængigt af integrin status [13], [27] (både i vævskultur og som humane tumorer i mus), data tyder på, at fordelingen af ​​tumorceller i knoglen kan være et centralt element påvirker kræft fremkaldt knoglesmerter. Den manglende evne af tumorceller for at nå epifysale område af knoglen på grund af integrin status faldt sammen med en bemærkelsesværdig nedgang af tre forskellige adfærdsmæssige smerte målinger. Selv om det er ukendt i øjeblikket, om placering af tumorceller i knogle og knoglesmerter var funktionelt forbundet, har andre rapporter viste, at inden for knogle, mikromiljøer er tilstrækkeligt adskilt til at berettige denne mulighed [28].

Det er muligt, at den formindsket knoglesmerter skyldes manglende evne til integrin, der skal spaltes, uafhængigt af placeringen af ​​tumorcellerne i knoglen. Integriner og cadheriner spaltes eller stald på tumor celle overflader [29] – [32]. De befriede fragmenter af receptorer undergår ektodomæne spaltning er biologisk aktive og kan bidrage til kræft induceret knoglesmerte [33]. Yderligere eksperimenter vil skelne mellem disse muligheder.

Selvom knoglemetastaser er traditionelt menes at være enten osteolytiske eller osteoblastiske har morfologiske analyser vist, at i de fleste patienter, knoglemetastaser har både osteolytiske og osteoblastiske elementer [38]. I prostata cancer patienter, knoglemetastaser viser ofte mere osteoblastisk fænotype, selvom nogle patienter har osteolytiske læsioner svarende til dem, der ses hos patienter med metastatisk brystkræft [38]. Denne forskning fokuseret på en human prostatacancer-cellelinie, der producerede mest osteolytiske knogleremodellering i musen knoglen. Den manglende evne af integrin, der skal spaltes resulterede i reduceret knogletab og knoglebrud. Som observeres mest knogletab og knoglebrud ved den distale ende af knoglen, den manglende evne af tumorcellerne nå epifysale område af knoglen kan have reduceret knogletab og knoglebrud i dette område. Fremtidige undersøgelser om betydningen af ​​integriner på osteoblastiske knogle remodellering ville være nødvendige for at afgøre, om at ændre integrinfunktion vil også ændre osteoblastiske reaktioner i knoglen.

Endelig bemærker vi, at kræft fremkaldt knoglenedbrydning er forbundet med stærkt nedsat kvalitet liv stammer fra komplikationer såsom hypercalcæmi, knoglebrud og invaliderende smerte. Fremskridt i kræft detektion og terapi udvider den forventede levetid for kræftpatienter og er stigende fokus på at forbedre patienternes livskvalitet. Både anvendelsen af ​​det hidtil ukendte xenotransplantat musemodel til at studere forebyggelse af kræft fremkaldt knoglesmerter og målretning adhæsionsreceptorer på tumorcelleoverfladen for knoglen bør signifikant indvirkning livskvaliteten for patienter med metastatisk sygdom.

Materialer og metoder

human prostatacancer cellelinier

de PC3N celler blev transficeret med plasmider indeholdende enten vildtype eller muteret integrin A6 som tidligere beskrevet [13]. De stabile kloner (PC3N-A6-WT udtrykker vildtype integrin A6 og PC3N-A6-RR udtrykker den ikke-spaltelige integrin A6) blev isoleret og holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2. PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR-celler blev dyrket i Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) plus 10% føtalt bovint serum (FBS) i nærværelse af 6 g /ml Blasticidin ( Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) og 1 g /ml Zeocin (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)

antistoffer og kemikalier

antistofferne var som følger:. J1B5, rotte monoklonale anti- A6 integrin (Dr. Caroline Damsky, University of California, San Francisco, USA) [34]; AA6A kanin polyklonalt anti-A6 integrin antistof [13] og AIIB2, monoklonalt rotte anti B1 integrin antistof [35] (American Type Culture Collection). Human rekombinant EGF blev anskaffet fra Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA. Urokinase blev købt fra Chemicon (Temecula, CA, USA).

immunblotting

Celler blev dyrket til konfluens og derefter vasket tre gange med HEPES-puffer og lyseret i kold RIPA puffer plus proteaseinhibitorer (PMSF , 2 mM; leupeptin og aprotinin, 1 g /ml). Lysaterne blev kortvarigt sonikeret på is før de suspenderet i 2 × ikke-reducerende prøvebuffer. Prøver blev kogt i 5 minutter, og efter en hurtig chill på is, blev de fyldt på 7,5% SDS-PAGE. Proteiner løst i gelen blev elektrooverført til Millipore Immobilon-P polyvinylidenfluorid (PVDF) -membran (Millipore, Bedford, MA, USA), inkuberet med Western blotting antistoffer plus sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase og visualiseret ved kemiluminescens (ECL Western Blotting Detection System , Amersham, Arlington Heights, IL, USA).

Matrigel Migration Assay

Seks brønde blev belagt med 1 ml Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) og suppleret med laminin 332 indeholder betinget medium fra HaCaT-celler i 02:01 forholdet og fik lov at størkne. En steril cirkulært dækglas blev anbragt i midten. Celler blev derefter podet i pladerne og fik lov at adhærere i 2 timer ved 37 grader C. Eventuelle ikke-adhærente celler blev fjernet, og derefter dækglas blev fjernet efterladende en klar zone i midten af ​​pladen. Periferien af ​​denne zone blev markeret. Serumfrie medier eller serumfrit medie med blokerende antistof blev tilsat til cellerne og fik lov til at inkubere ved 37 ° C i 18 timer. 1 ng /ml EGF blev tilsat til medierne for at inducere migrationen. Cellerne blev observeret ved hjælp af en Zeiss Axiovert mikroskop (2,5 x forstørrelse) og billeder blev indsamlet ved hjælp af et CCD-kamera.

Kirurgi

Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af University of Arizona institutionel dyrepleje og brug udvalg, IACUC protokol # 06-081. Dyrene blev bedøvet med ketamin /xylacine og en arthrotomi udførtes udsætter kondylerne af den distale femur. Et hul blev boret i femur, og nålen blev indsat i hullet. Faxitron billeder blev taget på 2 fly for at verificere nålens placering inde det intramedullære rum af femur. PC3N-A6-WT eller PC3N-A6-RR-celler, 10

6 i 5 ul af filtreret minimalt essentielt medium (MEM) indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA), eller 5 ul af filtreret MEM indeholdende 1% BSA alene (kontrol) blev injiceret i det intramedullære rum af muse femur af højre ben, og injektionsstedet blev forseglet med dental amalgam. For de følgende forsøg modtog 12 dyr PC3N-A6-WT, 12 modtog PC3N-A6-RR-celler, og 12 dyr modtog cellefri serum (kontrol).

Behavioral Pain Foranstaltninger [26]

bevægelse fremkaldte smerte

. Musen blev anbragt i en tom mus gryde og observeret samtidig walking på tværs af panden i en kontinuerlig bevægelse. Halten og /eller bevogtning opførsel af retten (kræft injicerede) bagben blev bedømt på følgende skala: 0 = fuldstændig mangel på brug, 1 = delvis manglende brug, 2 = halten og bevogtning, 3 = halten, 4 = normal gang.

Spontan smerte

. At vurdere blinke og bevogtning adfærd, blev dyrene placeret i hævet plexiglas kamre med en wire gitter gulv til observation af blinke og bevogtning af retten bagben. Musene fik lov til at akklimatisere sig til kammeret i 20 minutter. Bevogtning og flinching adfærd af hver mus blev målt i 2 minutter. Antallet af flinches blev talt, og den tid bevogtede foden (foden løftes ud af gulvet) blev målt.

taktil overfølsomhed (allodyni)

. Potetilbagetrækning tærskler fra von Frey-filamenter blev bestemt som beskrevet af Chaplan et al måde. [36] Paw tilbagetrækning tærskel blev bestemt i afhængighed af probing med kalibrerede von Frey-filamenter. Musene blev holdt i ophængte bure med trådnet gulve og von Frey filament blev påført vinkelret på den plantare overflade af poten på musen indtil det spændte lidt, og blev holdt i 3-6 sek. Et positivt respons blev indikeret ved en skarp tilbagetrækning af poten. tærskel potetilbagetrækning 50% blev bestemt ved ikke-parametrisk metode til Dixon [37]. En indledende sonde svarende til 2 g blev anvendt, og hvis svaret var negativt, blev stimulus trinvist øget indtil et positivt svar blev opnået, faldt derefter indtil et negativt resultat blev opnået. Dette op-ned-metoden blev gentaget, indtil 3 adfærdsændringer blev bestemt, og mønstret af positive og negative reaktioner blev tabuleret. tærskel potetilbagetrækning på 50% blev bestemt som (10

[Xf + k *]) /10.000, hvor Xf = værdien af ​​det sidste von Frey filament anvendes, k = Dixon værdi for positiv /negativ mønster, og * = middelværdien (log) forskellen mellem stimuli. Alle smerte tests på hvert dyr i følgende rækkefølge, bevægelse fremkaldte smerte, spontan smerte (efter 20 min akklimatiseringsperiode), og taktil overfølsomhed.

Bestemmelse af knogledestruktion

Røntgenbilleder blev taget forud for injektion af kræftceller (baseline, BL) og 21 dage efter induktion af knoglekræft ved hjælp af en Faxitron MX-20 maskine på 7 uM nominel opløsning med en X-ray strøm på 300 uA og en spænding på 26 kV (Faxiton X-ray Corp., Wheeling, IL). Digitale røntgenbilleder blev taget efter adfærdsmæssige test på 12 dyr pr behandling tilstand. Billeder blev taget til fange af et digitalt kamera og overføres til computeren og gemmes i digitalt gråtoner format (TIFF). Knogletab blev bedømt efter følgende 4 point skala:. 0 = normal, 1 = knogletab ingen brud, 2 = fuld tykkelse unicortical knogletab indikerer unicortical knoglebrud, 3 = fuld tykkelse bicortical knogletab indikerer bicortical knoglebrud

statistiske analyser

Statistiske sammenligninger mellem behandlingsgrupper blev udført ved hjælp af ANOVA. Parvise sammenligninger mellem grupper blev foretaget med t-test blev multiple sammenligninger mellem grupper gøres ved hjælp af Newman-Keuls Multiple Sammenligning Test. For vurdering analyser, brug og knogler lemmer tab, blev statistiske sammenligninger foretaget ved hjælp af ikke-parametrisk analyse med Mann-Whitney test. For alle analyser, blev signifikans sat til p. 0,05

Histologisk analyse af tumor i knoglen

På dag 21 efter kirurgi blev mus dybt bedøvet med ketamin og perfunderet intracardialt med 25 ml 0,1 M PBS efterfulgt af 25 ml 10% neutral pufret formalin. Ipsilaterale lårben blev fjernet fra 6 dyr pr tilstand og postfikseret natten over i 10% neutral pufret formalin. Lårben blev skyllet i vand til fjernelse af formalin forud for at blive anbragt i Decal opløsning (RDO-Apex, Aurora, IL), i en time for at opnå afkalkning. Prøver blev dehydreret i gradueret ethanol opløsning før omhyggeligt indlejring i paraffin. De blev orienteret således, at hele længden af ​​lårbenet kunne længderetningen udskåret. §§ 3 um tyk blev farvet med hæmatoxylin og eosin at visualisere normale marvelementer og kræftceller under lysfeltmikroskopi. Prøverne blev observeret ved anvendelse af et Nikon mikroskop (10 ganges forstørrelse) og billeder blev indsamlet ved anvendelse af et CCD-kamera.

RT-PCR-analyse af PC3N-A6-RR-celler i det intramedullære rum på lårbenet

<