PLoS ONE: humorale immunreaktioner til EGFR peptider Forudsige Progression-Free og samlet overlevelse af ikke-småcellet lungekræft Patienter Modtagelse Gefitinib

Abstrakt

Somatiske mutationer i epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) gen er forbundet med klinisk respons på EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er), såsom gefitinib, hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Men humorale immunrespons til EGFR i NSCLC patienter er ikke blevet godt undersøgt. I denne undersøgelse undersøgte vi den kliniske betydning af immunglobulin G (IgG) reaktioner på EGFR-afledte peptider i NSCLC patienter, der fik gefitinib. Plasma IgG titer for hver af 60 forskellige EGFR-afledt 20-mer peptider blev målt ved Luminex systemet i 42 NSCLC patienter, der fik enten gefitinib. Forholdet mellem peptid-specifikke IgG-titre og tilstedeværelse af EGFR mutationer eller patientoverlevelse blev evalueret statistisk.

IgG-titre mod de egfr_481-500, egfr_721-740 og egfr_741-760 peptider var signifikant højere hos patienter med exon 21 mutation end hos dem uden. På den anden side, IgG-titre mod egfr_841-860 og egfr_1001-1020 peptider var signifikant lavere og højere, hos patienter med deletion i exon 19. Multivariate Cox regressionsanalyse viste, at IgG-responser til egfr_41_ 60, egfr_61_80 og egfr_481_500 var signifikant prognostisk for progressionsfri overlevelse uafhængigt af andre klinisk-patologiske egenskaber, mens dem til egfr_41_60 og egfr_481_500 peptider var signifikant prognostisk for samlet overlevelse. Påvisning af IgG-responser på EGFR-afledte peptider kan være et lovende fremgangsmåde til prognosticering af NSCLC-patienter, der fik gefitinib. Vores resultater kan give ny indsigt for en bedre forståelse af humorale reaktioner på EGFR i NSCLC patienter

Henvisning:. Azuma K, Komatsu N, Hattori S, Matsueda S, Kawahara A, Sasada T, et al. (2014) humorale immunreaktioner til EGFR peptider Forudsige Progression-Free og samlet overlevelse af ikke-småcellet lungekræft Patienter Modtagelse Gefitinib. PLoS ONE 9 (1): e86667. doi: 10,1371 /journal.pone.0086667

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: August 29, 2013; Accepteret: 12. december, 2013; Udgivet: 31 Jan 2014

Copyright: © 2014 Azuma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan: Grant-in-Aid for Unge Forskere (B), JSP’er KAKENHI Grant nummer 19790571. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, at afgørelsen offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag. af kræft død på verdensplan [1]. Den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR), en af ​​de mest undersøgte tyrosinkinasereceptorer, er et prototypisk celleoverfladereceptor, der kan målrettes af lægemidler mod lungekræft. EGFR familien er kendt for at spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​celleproliferation, differentiering og migration [2]. Somatiske mutationer i EGFR-genet er blevet identificeret som en væsentlig faktor for den kliniske respons på behandling med EGFR-tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er), såsom gefitinib og erlotinib, hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). De fleste af de EGFR mutationer forekommer i exon 19 til 21, som koder tyrosinkinasedomænet af receptoren. Deletioner i exon 19 (såsom delE746-A750) og L858R punkt mutation i exon 21 er de mest almindelige mutationer findes i NSCLC, der tegner sig for omkring 90% af alle EGFR mutationer. Disse mutationer findes hyppigere hos kvindelige patienter, hos personer, der aldrig har røget, og hos patienter af østasiatisk etnicitet [3] – [5]. Potentielle kliniske forsøg med EGFR-TKI behandling i NSCLC patienter med

EGFR

mutationer har vist bemærkelsesværdige responsrater i størrelsesordenen 80% [6] – [8].

Tidligere vi har udviklet personlig peptidvaccination (PPV) som en ny modalitet til cancerterapi, hvori vaccineantigener er udvalgt på grundlag af allerede eksisterende immunresponser mod tumorassocierede antigener (TAA) [9] – [13]. Vi rapporterede, at immunglobulin G (IgG) reaktioner på TAA-afledte CTL epitop peptider blev godt korreleret med samlet overlevelse (OS) i patienter med fremskreden kræft gennemgår PPV [14], [15]. Disse resultater antydede, at humorale immunresponser mod TAA-afledte peptider signifikant kunne påvirke den kliniske forløb af kræftpatienter. Men der er lidt information om den kliniske betydning af humorale immunrespons på EGFR-afledte peptider i NSCLC patienter.

For nylig har nye high-throughput teknologier blevet udviklet til at opdage biomarkører, der klart afspejler kliniske resultater og /eller reaktioner på behandling af patienter med cancer [16] – [21]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi den højt gennemløb Luminex suspension matrix system til at måle IgG-responser til EGFR-afledte peptider hos patienter med NSCLC. Her rapporterer vi for første gang, at IgG svar på nogle EGFR-afledte peptider kan påvises i NSCLC patienter, og at de kunne være potentielt nyttige prædiktorer for progressionsfri (PFS) og OS i NSCLC patienter, som får gefitinib.

Materialer og metoder

patienter, behandlinger, og prøvetagning

Vi indskrevet 42 NSCLC patienter behandlet med gefitinib mellem 2006 januar og 2008 december kl en enkelt institution (Kurume Universitetshospital, Kurume, Japan) . Nærmere oplysninger om patienternes kliniske karakteristika, herunder alder, køn, histologi, rygning status, performance status (PS), scene, behandlingsrespons, og typen af ​​

EGFR

mutationer blev opnået fra chart anmeldelser af en uafhængig korrekturlæser, der var uvidende om de kliniske kurser (tabel 1). Alle patienterne havde fremskreden NSCLC og modtaget gefitinib (250 mg) oralt én gang dagligt. Tumor respons blev undersøgt ved computertomografi (CT) og blev vurderet i henhold til respons evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST). Reaktion blev bekræftet mindst 4 uger (for en komplet eller delvis respons) eller 6 uger (for stabil sygdom), efter at det først blev dokumenteret. Plasmaprøver blev opsamlet fra patienterne før gefitinib behandling og nedfrosset ved -80 ° C indtil anvendelse. Plasma blev også indsamlet fra raske donorer (HD) (n = 20, 59 +/- 11 år, Male = 8, Kvinde n = 12). Den foreliggende undersøgelse overholdt bestemmelserne i Helsinki-deklarationen, og blev godkendt af Institutional Review Board of Kurume Universitet. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag.

EGFR mutation analyse

Mutationer af EGFR-genet blev undersøgt i exon 19 (E746-A750del) og 21 (L858R) ved peptidnukleinsyre syre-låst nukleinsyre (PNA-LNA) PCR klemme, som tidligere [22] beskrevne. Kort fortalt blev genomisk DNA oprenset fra paraffinindlejrede væv under anvendelse af en QIAamp DNA Micro kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA). PCR primere blev syntetiseret af Invitrogen (Carlsbad, CA). PNA clamp primere og LNA mutante prober blev indkøbt fra FASMEC (Kanagawa, Japan) og IDT (Coralville, IA), hhv. PNA-LNA PCR klemme blev udført under anvendelse af en SDS-7500 System (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Peptider og måling af IgG-titre mod peptider afledt af EGFR

Sixty forskellige ikke- overlappende 20-mer peptider blev designet fra sekvensen af ​​EGFR-proteinet og syntetiseret af Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), som vist i figur 1E. Peptiderne blev opløst i DMSO som tidligere [23] rapporterede. IgG-titre er specifikke for hver af peptiderne blev målt ved anvendelse af en multiplex bead suspension array på Luminex systemet, som tidligere [24] rapporterede. Kort fortalt blev 100 pi fortyndet plasma inkuberet med xMAP perler (Luminex Corp., Austin, TX), som blev overtrukket med EGFR-afledte peptider, i en 96-brønds filterplade (MABVN1250; Millipore Corp., Bedford, MA ) i 2 timer ved stuetemperatur på en pladeryster. Pladen blev derefter vasket og inkuberet med 100 pi biotin-konjugeret gede-anti-humant IgG (BA-3080; Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 1 time ved stuetemperatur på en pladeryster. Efter vask blev 100 pi streptavidin-PE tilsat til brøndene, og pladen blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur på en pladeryster. Perlerne blev vasket tre gange efterfulgt af tilsætning af 100 pi PBS til hver brønd. Fluorescensintensiteten i 50 pi af hver prøve blev undersøgt under anvendelse Luminex systemet. Peptid-specifikke IgG-titere blev anslået i form af fluorescensintensitet og udtrykkes som fluorescensintensitet (FIU), som tidligere [24] rapporterede. Cut-off-niveau blev fastsat til 10 FIU fordi FIU kurver opnået fra prøvefortyndingen analyser var lineær fra 10 til 10.000 FIU (data ikke vist).

Log-rank-test viste, at gefitinib behandling signifikant forlænget PFS (A), men ikke OS (B), i NSCLC patienter med EGFR-mutationer. Betydelige forskelle i PFS (C), men ikke i OS (D), mellem patienter med og uden EGFR mutationer sås også for mutationer i både EGFR exon 19 (E746-A750del) og exon 21 (L858R). (E) tres forskellige 20-mer peptider blev designet fra aminosyresekvensen af ​​EGFR-protein. De viste i rødt sekvenser (egfr_481-500, egfr_721-740, egfr_741-760, egfr_841-860, og egfr_1001-1020) repræsenterer peptider udviser specifikke IgG svar, der blev korreleret med EGFR-mutationer. De viste i blå (egfr_41_ 60, egfr_61_80, og egfr_481_500) sekvenser repræsenterer peptider udviser specifikke IgG svar, der blev korreleret med PFS.

Statistisk analyse

For at undersøge, om IgG-titre mod hver af de 60 forskellige peptider blev forbundet med EGFR mutation status, deres medianværdier blev sammenlignet blandt patienter med EGFR mutationer (delE746-A750 og L858R) og EGFR vildtype ved hjælp af Wilcoxon rank-sum test. PFS blev beregnet ud fra datoen for indledningen af ​​gefitinib behandling indtil enten datoen for sygdomsprogression eller datoen for sidste kontakt. OS blev defineret som perioden fra datoen for indledningen af ​​gefitinib behandling frem til datoen for død på grund af en hvilken som helst årsag, eller for datoen for sidste kontakt. For at undersøge, om IgG-titre mod hver af de 60 forskellige peptider var forbundet med PFS eller OS, vi anvendte Cox proportional hazards model med anti-peptid IgG-titre, mutation status, rygning status, køn og PS som forklarende variabler. Vi undersøgte også, om de var forbundet med tumoren svar ved hjælp af logistisk regression, hvor CR og PR blev betragtet som svar. Siden 60 forskellige peptider blev undersøgt, fandtes en alvorlig multiplicitet problem i denne undersøgelse. Derfor vi identificeret peptider, som var signifikant associeret med PFS, OS, eller tumorrespons ved styring af falsk opdagelse sats (FDR) ved 5% -niveauet.

I denne undersøgelse blev det betydeligt udfordrende at identificere anti peptid IgG responser, der ville være nyttige for prognosticering end blot at bruge klinisk-patologiske egenskaber alene. Da antallet af peptider oversteg antallet af patienter, kunne standard multivariate Cox regression (multipel regression) ikke anvendes. For at undgå indflydelsesrige observationer, var anti-peptid-IgG log-transformerede (anti-peptid-IgG +1), og også standardiseret med nul-middelværdi og enhed standardafvigelse. Vi anvendte Cox regression med en straf lasso-typen [25], [26], som for nylig er blevet rapporteret at være nyttige til analyse af høj-dimensionelle data. Da en bemærkelsesværdige træk ved den lasso metode er dens sparsity, kunne regressionskoefficienter for anti-peptid IgG svarene ikke er forbundet med PFS (OS) estimeres som nul. Baseret på denne funktion, identificerede vi et par peptider, der kan være nyttige for prognosticering. For at undersøge, hvorvidt IgG hvordan de konstaterede peptider var faktisk nyttigt for prognosticering, vi anvendte Cox regressionsanalyse og tidsafhængig ROC-analyse [27]. Områder under ROC-kurven (AUC) blev anslået til risiko score ved Cox regression med klinisk-patologiske egenskaber alene og også med både anti-peptid IgG responser og klinisk-patologiske karakteristika. De blev sammenlignet ved at teste lige AUC ved at beregne en bootstrap p-værdi for 1000 gentagelser. Statistisk analyse blev udført med R-version 2.13 og SAS-version 9.3 software (SAS Institute, Cary, NC).

Resultater

Patient karakteristika og overlevelsesanalyse

De kliniske karakteristika de 42 patienter er vist i tabel 1. Femogtyve patienter (60%) var kvinder og 24 (57%) havde aldrig røget; medianalderen af ​​patienterne generelt var 63,5 år (interval, 38 til 82 år). Tredive-otte patienter (90%) havde adenocarcinom, 34 (81%) havde en god performance status (Eastern Cooperative Oncology Group 0), og 15 (36%) fik gefitinib som førstevalg kemoterapi. Med hensyn til typen af ​​

EGFR

mutation, 8 patienter (19%) havde deletioner i exon 19, 13 (31%) havde L858R missense mutation i exon 21, og 21 (50%) havde den vilde -type

EGFR

.

på tidspunktet for analysen, median opfølgningsperiode var 418 dage (interval, 16 til 1532 dage). Den mediane PFS var 201 dage (interval, 11 til 1379 dage), og den mediane OS var 418 dage (interval, 16 til 1532 dage). Kaplan-Meier-analyse af PFS og OS efter starten på gefitinib behandling er vist i figur 1. Den log-rank test viste, at gefitinib behandling resulterede i en signifikant længere PFS hos patienter med EGFR-mutationer end i dem uden dem (median på 347 versus 54 dage,

P

= 0,0029) (fig. 1A), mens der ikke var nogen signifikant forskel i OS mellem de to grupper af patienter (median på 575 versus 368 dage, henholdsvis

P

= 0,1095) (fig. 1B). Forskellene i PFS, men ikke OS, mellem patienter med mutationer og dem med vildtype-EGFR var tydeligt for begge typer EGFR mutation (Fig. 1C og 1D).

Sammenhæng mellem IgG-titre mod EGFR- afledte peptider og EGFR mutationer i NSCLC patienter behandlet med gefitinib

Vi undersøgte IgG-titre mod hver af 60 forskellige peptider i plasmaprøver fra NSCLC patienter, der anvender Luminex systemet. Vi analyserede, om peptidspecifikke IgG-titere blev korreleret med tilstedeværelsen af ​​EGFR-mutationer, og fandt, at IgG-titre specifikke for de egfr_481-500, egfr_721-740 og egfr_741-760 peptider var signifikant højere hos patienter med exon21 mutation end i dem, uden den (P = 0,017 for egfr_481-500; P = 0,036 for egfr_721-740; P = 0,007 for egfr_741-760) (tabel S1). For disse tre peptider, medianværdier af peptidspecifikke IgG titre i patienter med exon 21-mutationen var omkring det dobbelte hos patienter uden exon 21-mutation (tabel S1). På den anden side er titeren af ​​IgG specifik for egfr_841-860 peptid var signifikant lavere hos patienter med deletion i exon 19 end hos dem uden det (P = 0,047), mens titeren af ​​IgG specifik for egfr_1001-1020 peptid var signifikant højere hos patienter med deletion i exon 19 (tabel S1). IgG responser på andre peptider viste ingen signifikant sammenhæng med EGFR-mutationer.

Forholdet mellem titre af IgG mod EGFR-afledte peptider og overlevelse i NSCLC patienter behandlet med gefitinib

Vi yderligere undersøgt, om peptid- specifikke IgG-titere blev godt korreleret med PFS eller OS i NSCLC-patienter, der fik gefitinib behandling. I Cox regression, IgG responser mod 38 og 32 EGFR-afledte peptider viste p-værdier på mindre end 5% for PFS og OS henholdsvis. Da FDR blev styret på 5% niveau, blev IgG responser mod 35 og 20 peptider identificeret som væsentlige for PFS og OS (tabel S2). Vi undersøgte også, om de IgG-titre mod hvert peptid var forbundet med tumor respons (CR eller PR). Logistisk regressionsanalyse viste, at der ikke var nogen peptidspecifikke IgG-responser associeret med tumor respons (data ikke vist).

Identifikation af peptidspecifikke IgG-responser anvendelige til prognosticering

Som vist ovenfor IgG svar på mange af de EGFR-afledte peptider blev signifikant associeret med PFS og /eller OS. Da mange par af peptider moderat eller stærkt korreleret (data ikke vist), blev det foreslået, at måling af IgG-titere mod et forholdsvis lille antal peptider kan være tilstrækkelig prognostisk. Ved Cox regression med lasso straf, IgG-titre mod egfr_41_60, egfr_61_80 og egfr_481_500 peptider havde relativt store effekter på PFS (figur S1A). Vi beskæftigede IgG-titre mod disse tre peptider til at konstruere en forudsigelse regel for PFS. Som vist i tabel 2A, Cox regression justering for mulige forstyrrende faktorer, herunder PS, alder, køn og rygning status, viste, at alle de IgG responser mod egfr_41_60, egfr_61_80 og egfr_481_500 peptider var signifikant prognostisk og uafhængig af klinisk-patologiske egenskaber ( P = 0,001, P = 0,020, og P = 0,028, henholdsvis).

Ved Cox regression med lasso straf, IgG-titre mod egfr_41_60, egfr_481_500 og egfr_881_900 peptider viste sig at have relativt store virkninger på OS (figur S1B). Da IgG-titre mod egfr_41_60 og egfr_881_900 peptider var stærkt forbundet (Spearman rang korrelationskoefficient 0,71; P 0,001), vi ansat kun titre af IgG mod egfr_41_60 og egfr_481_500 til at konstruere en forudsigelse regel til OS. Som vist i tabel 2B viste Cox regression, at IgG responser på begge peptider var signifikant prognostisk, uafhængig af klinisk-patologiske karakteristika (P = 0,018 for egfr_41_60 og P = 0,027 for egfr_481_500).

Kaplan-Meier-kurver over PFS og OS efter stratificering med IgG titer for de udvalgte peptider er vist i figur 2A og figur 2B, for at gribe deres marginale virkninger uden at justere for klinisk-patologiske karakteristika. Brug tidsafhængig ROC-analyse, vi også undersøgt, hvorvidt tilføje peptid-specifikke IgG-titre på klinisk-patologiske karakteristika forbedret nøjagtigheden af ​​prognosticering. Figur 3A og 3B viser ROC kurver for 1 år og 2 år af risikoscore anslået af Cox regression angivet i tabel 2A (for PFS) og tabel 2B (til OS) med peptidspecifikke IgG-titre og klinisk-patologiske characteristcs og dem med sidstnævnte alene. ROC-kurver viste, at tilsætning af peptid-specifik IgG titer for de klinisk-patologiske karakteristika førte til væsentlig forbedring i evnen til at forudsige PFS efter 1 år og 2 år (P 0,001 ved sammenligning af AUC). AUC for den tidsafhængige ROC for den 1-årige og 2-årige OS blev også steget betydeligt ved at tilføje peptid-specifikke IgG-titre i sammenligning med klinisk-patologiske egenskaber alene (P 0,001) (Fig.3C og 3D). Disse resultater antydede, at tilføje peptid-specifikke IgG-titre til de klinisk-patologiske egenskaber kan føre til mere præcis prognosticering af både PFS og OS.

Kaplan-Meier-kurver over PFS (A) og OS (B) hos patienter, som viser højere og lavere IgG-titre mod de udvalgte peptider, egfr_41_ 60, egfr_61_80, og egfr_481_500, er vist. Lavere og højere IgG-titre blev defineres ved deres medianværdier.

ROC kurver for 1 års (A) og 2 år (B) PFS af risikoscore anslået af Cox regression indikerer en væsentligt forbedret korrelation med 1-års og 2-års PFS. ROC kurver for 1 års (C) og 2 år (D) OS er også vist.

Diskussion

Nylige fremskridt i molekylær onkologi har drastisk forbedret vores forståelse af vækst og overlevelse veje for NSCLC. For eksempel EGFR, et medlem af HER eller Erb-B-familien af ​​receptortyrosinkinaser, er impliceret i udviklingen og progressionen af ​​NSCLC. EGFR består af et ekstracellulært ligandbindende domæne, en transmembran region og en multifunktionel cytoplasmatiske hale med integreret kinaseaktivitet [2], [28] – [30]. EGF er et secerneret vækstfaktor hvis binding til EGFR inducerer strukturelle ændringer, der fører til receptor homodimerdannelse, efterfulgt af en stigning af EGFR-kinaseaktivitet og efterfølgende phosphorylering af intracellulære domæne [2], [28] – [30]. Den hyppigst observerede mutation i EGFR er substitution L858R i aktiverende loop (A-loop), eller sletning af otte rester i regionen spænder over resterne 746-759, der strækker sig fra beta3 streng til alphaC helix i N-lap af kinasedomænet [2] – [5], [28] – [30]. I denne undersøgelse fandt vi, at IgG-svar på peptiderne egfr_481-500, egfr_721-740, og egfr_741-760 var signifikant højere hos patienter med exon 21 mutation. På den anden side er de IgG-responser til egfr_841-860 og egfr_1001-1020 peptider var signifikant lavere og højere, hos patienter med deletion i exon 19. Interessant egfr_721-740, egfr_741-760, og egfr_841-860 er placeret i ATP-bindende domæne, som koder for tyrosinkinase-domæne af receptoren, og humorale immunresponser på disse sekvenser blev korreleret med tilstedeværelsen af ​​aktiverende EGFR mutationer, såsom L858R eller 746DEL. På den anden side er egfr_1001-1020 placeret i den regulatoriske domæne i den C-terminale hale, som kan øge autophosphorylering af EGFR [31]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at dette domæne interagerer indgående med både C-lap og N-lap af kinasedomænet [32] – [33]. Disse resultater tyder på, at sekvenserne relateret til tyrosinkinaseaktivitet i EGFR kan være immunogen hos patienter med EGFR-mutationer, selv om der er behov for yderligere undersøgelse for at klarlægge mekanismerne i de øgede IgG reaktioner på disse sekvenser.

Udviklingen af ​​hurtige og præcise diagnostiske teknikker til påvisning af EGFR-mutationer er især vigtigt for udformningen personlige terapi for NSCLC patienter med aktiverende EGFR-mutationer. Der er rapporteret flere meget følsomme metoder til påvisning af EGFR mutationer i vævsprøver [22], [37], men prøvetagning for disse metoder kræver invasive procedurer, såsom transbronkial biopsi eller pleural punktering. I modsætning hertil de foreliggende resultater antyder, at screening af IgG-responser til EGFR-afledte peptider i perifert blod ville være hensigtsmæssigt til påvisning EGFR mutationer. Påvisning af humorale reaktioner mod EGFR-afledte peptider under anvendelse Luminex suspension arrayet system er enkelt og ikke-invasiv. Især kan denne metode være nyttig for patienter med NSCLC, hvis tumor væv er vanskeligt at få til detaljeret patologisk og molekylær karakterisering.

Vi undersøgte endvidere, om IgG responser mod EGFR-afledte peptider kan være prædiktiv for PFS og OS i NSCLC patienter, der fik gefitinib. Vi fandt, at IgG responser mod peptiderne egfr_41_ 60, egfr_61_80 og egfr_481_500 havde store virkninger på PFS, og at de mod egfr_41_60 og egfr_481_500 havde store effekter på OS. Interessant, alle disse sekvenser er placeret i det ekstracellulære domæne. Binding af EGF sker inden den aminoterminale 622 aminosyrer, ekstracellulære domæne, der består af fire domæner, I-IV, af EGFR. For nylig har strukturelle data vist, hvor anti-EGFR-antistoffer inhiberer signaltransduktion fra EGFR. For eksempel egfr_481_500 sekvensen hører til ekstracellulære domæne III, hvor anti-EGFR-antistoffer, såsom cetuximab, nimotuzumab, og matuzumab, vides at binde og blokere bindingen af ​​EGF til EGFR [34] – [36]. Selv om årsagerne til, at IgG reaktioner på disse peptider kan indvirke på overlevelse er ikke fuldt forstået, er en mulig forklaring er, at IgG mod det ekstracellulære domæne kan påvirke signaltransduktion fra EGFR.

Vi undersøgte plasma fra 20 raske donorer (HD ) ved hjælp af Luminex systemet til at detektere antistoffer mod egfr_41_ 60, egfr_61_80 og egfr_481_500 peptider. Vi fandt, at titere af antistoffer mod egfr_41_60, egfr_61_80, og egfr_481_500 i plasma var ikke signifikant forskellig mellem NSCLC-patienter og HD (data ikke vist). Dette resultat er i overensstemmelse med vores tidligere fund, at antistoffer mod cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) epitop-peptider afledt fra mange af tumorassocierede antigener blev påvist som positiv i HD, og ​​at deres titere var ikke signifikant forskellig mellem kræftpatienter og HD [38] . Dette fund antydede, at humorale immunreaktioner på EGFR kunne være bredt detekterbar ikke kun hos kræftpatienter, men også i HD, da dette molekyle udtrykkes ubikvitært ikke kun cancervæv, men også i normale væv.

Som konklusion den foreliggende undersøgelsen har vist, at påvisning af humorale immunresponser på EGFR-afledte peptider i plasma ved hjælp af Luminex suspension arrayet kan være et lovende fremgangsmåde til ikke blot at påvise tilstedeværelsen af ​​EGFR-mutationer, men også prognosticering af NSCLC-patienter, der fik EGFR-TKI’er. Disse resultater kan give ny indsigt for en bedre forståelse af de humorale immunrespons til EGFR i NSCLC patienter. Da den største ulempe ved denne undersøgelse var den lille prøvestørrelse, en yderligere prospektiv undersøgelse er nu i gang for at bekræfte resultaterne i større kohorter. Desuden vil det være nødvendigt at afklare den kliniske anvendelighed af vores resultater til personaliseret NSCLC patienter.

Støtte Information

Figur S1.

Solution stien til Cox regresson med en lasso straf for PFS (A) og OS (B). (A) Ved Cox regression med lasso straf, IgG-titre mod egfr_41_60, egfr_61_80 og egfr_481_500 peptider havde relativt store effekter på PFS. (B) Ved Cox regression med lasso straf, blev IgG-titre mod de egfr_41_60, egfr_481_500 og egfr_881_900 peptider vist sig at have relativt store effekter på OS

doi:. 10,1371 /journal.pone.0086667.s001

( TIF)

tabel S1.

Sammenhæng mellem EGFR mutation og udtryk for peptid i NSCLC-patienter. Vi undersøgte IgG-titre mod hver af 60 forskellige peptider i plasmaprøver fra NSCLC patienter, der anvender Luminex systemet. Vi fandt, at IgG-titre specifikke for de egfr_481-500, egfr_721-740, og egfr_741-760 peptider var signifikant højere hos patienter med exon21 mutation end hos dem uden. På den anden side er titeren af ​​IgG specifik for egfr_841-860 peptid var signifikant lavere hos patienter med deletion i exon 19 end hos dem uden det (P = 0,047), mens titeren af ​​IgG specifik for egfr_1001-1020 peptid var signifikant højere hos patienter med sletning i exon 19.

doi: 10,1371 /journal.pone.0086667.s002

(XLSX)

tabel S2.

Cox regressionsanalyse af PFS og OS til NSCLC patienter. I Cox regression, IgG responser mod 38 og 32 EGFR-afledte peptider viste p-værdier på mindre end 5% for PFS og OS henholdsvis. Da FDR blev styret på 5% niveau, blev IgG responser mod 35 og 20 peptider identificeret som væsentlige for PFS og OS henholdsvis

doi:. 10,1371 /journal.pone.0086667.s003

(XLSX)