PLoS ONE: Vækst og Differentiering Factor 3 inducerer ekspression af gener relateret til Differentiering i en model af cancer stamceller og beskytter dem mod retinsyre-induceret Apoptosis

Abstrakt

Misexpression af vækstfaktorer, især dem, der vedrører stamcelle-lignende fænotype, observeres ofte i flere kræfttyper. Det har vist sig at påvirke parametre sygdomsprogression som celleproliferation, differentiering, opretholdelse af udifferentieret fænotype og modulation af immunsystemet. GDF3 er et TGFB familiemedlem forbundet med pluripotens og differentiering under fosterudviklingen, der tidligere er blevet rapporteret at blive re-udtrykt i en række cancertyper. Imidlertid har dets rolle i tumorudvikling og progression endnu ikke klarlagt. I denne undersøgelse dechifrere vi rollen som GDF3 i en

in vitro

model af kræft stamceller, NCCIT celler. Ved klassiske fremgangsmåde til at studere proteinfunktion kombineret med højt gennemløb teknik til transkriptom analyse og differentieringsfaktorer assays evaluerede vi GDF3 som et potentielt terapeutisk mål. Vi observerede, GDF3 robust inducerer et panel af gener relateret til differentiering, herunder flere potente tumorsuppressorer, uden at påvirke den proliferative kapacitet. Desuden rapporterer vi for første gang den beskyttende effekt af GDF3 mod retinsyre-induceret apoptose i celler med stamcellelignende egenskaber. Vores undersøgelse indebærer, at blokering af GDF3 kombineret med retinsyre-behandling af faste cancerformer er en tvingende retning henblik på yderligere undersøgelser, som kan føre til re-design af kræft differentieringsfaktorer terapier

Henvisning:. Tykwinska K, Lauster R, Knaus P, Rosowski M (2013) vækst og differentiering Factor 3 inducerer ekspression af gener relateret til Differentiering i en model af cancer stamceller og beskytter dem mod retinsyre-induceret apoptose. PLoS ONE 8 (8): e70612. doi: 10,1371 /journal.pone.0070612

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Februar 28, 2013; Accepteret: 20 juni 2013; Udgivet: 12. august 2013 |

Copyright: © 2013 Tykwinska et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne vil gerne sige, at dette arbejde blev finansieret af Technische Universität Berlin og ved DFG gennem Berlin-Brandenburg School for regenerativ Therapies GSC 203. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskript

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft stamceller-lignende celler (CSC) udgør en lille population af tumor-initierende. celler, med omfattende selvfornyelse evne, evne til at skabe ikke-tumorigen ende celler og multidifferentiation potentiale. CSCS menes at være hovedårsagen til kemoterapi modstand og sygdom tilbagefald. Ifølge CSC hypotesen, kontrol over denne yderst proliferative celle rum definerer den ultimative kur mod kræft [1] – [3]

Der har været løbende undersøgelser for at definere CSC markører

in vivo

. , men ingen pålidelige, universel kombination er fundet indtil nu. Men Ben-Porath [4] og andre [5], viste, [6], at et fælles træk ved histologisk dårligt differentierede tumorer – som generelt udviser de værste prognoser – er den ES-lignende signatur, herunder udtryk for NANOG, OCT4, SOX2 og deres mål [7], [8]. Afvigende ekspression af stamceller faktorer inden for tumorer opretholder aggressiv fænotype og øger sandsynligheden for progression og metastase [9].

Blandt den store mængde af kræft cellelinjer til rådighed til at studere kræft biologi

in vitro

, embryonal carcinoma cellelinier viser ES-lignende signatur, herunder ekspressionen af ​​de vigtigste pluripotency-netværk forbundet transkriptionsfaktorer, og ikke alene i stand til at differentiere

in vitro

, men er også yderst tumorigene

in vivo

. Derfor embryonal carcinoma (EF) cellelinjer, forventes at være en passende model for CSC [10], [11].

vækst- og differentiering faktor 3 (GDF3) er bredt accepteret som pluripotens markør, som det er en direkte transkriptionel mål for NANOG [12]. Det blev rapporteret til at regulere både vigtigste karakteristika embryonale stamceller, vedligeholdelse af udifferentierede fænotype og differentiering potentiale [13].

Sammen med andre embryonale stamcellelinjer markører blev GDF3 vist at blive udtrykt i flere kræft typer såsom mammacancer [14], [15], melanom [16], seminom [15] og testikelkræft kimcelletumorer [17]. Mens NANOG, OCT4 og SOX2 blev identificeret som stemness-fremmende transkriptionsfaktorer, forbliver den rolle, GDF3 dårligt forstået. Resultater offentliggjort af andre til dato, om den formodede rolle dette molekyle i kræft biologi er selvmodsigende. Det blev demonstreret, at GDF3 inhiberer proliferation af brystcarcinom cellelinie MCF7 [14], men forøger proliferation af B16 myelom og kan fremme neuronal differentiering af PC12-celler [18].

GDF3 tilhører den potente vækstfaktor familie af transformerende vækstfaktor β (TGFB). Medlemmer af TGFB familie, herunder Knoglemorfogenetiske proteiner (BMP’er), vækst- og differentieringsfaktorer (GDF’er) og TGFB, vise forskellige, undertiden modsatrettede virkninger på målceller, afhængigt af den cellulære kontekst, andre ligander til stede, dosering og identitet af cytokinet [ ,,,0],19]

GDF3 blev rapporteret at være involveret i både kanoniske veje udløst af TGFB familiemedlemmer:. (1) ekstracellulær hæmning af BMP’er [13], og (2) induktion af SMAD2 /3 fosforylering grundet binding til Activin A receptorer type IB eller IC (ACVRIB, ACVRIC) og activin receptorer skrive IIA eller IIB (ACVRIIA, ACVRIIB) i samarbejde med obligatorisk co-receptor teratocarcinoma vækstfaktor 1 (TDGF1) [20], [21].

Den nye rolle SMAD2 /3 signalering kaskade har allerede demonstreret i bugspytkirtlen, bryst, mave, ovarie, hud og mange andre kræftformer. både, aktivering og blokering af SMAD2 /3-vejen, kan dog have en positiv indvirkning på sygdommens debut [22] – [24]. Derfor virkningen af ​​hver ligand udløser denne vej skal være nøje undersøgt og vurderet.

Opmuntret af disse kendsgerninger, vi omfavnede udfordring at omfattende undersøge virkningerne af GDF3 signalering i en model af CSC linje ved transkriptom profilering og differentiering analyser og til at vurdere dens potentiale som et terapeutisk mål. Vi fandt, at GDF3 regulerer ekspressionen af ​​gener involveret i differentieringen, men påvirker ikke proliferative kapacitet udifferentieret CSC. Endvidere viser vi, at GDF3 beskytter CSC fra apoptose induceret af retinsyre, den eneste klinisk godkendt cyto-differentierende, anticancermiddel.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur og differentiering

NCCIT og HEK293T celler (American Type Cell Collection) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium med 4,5 g /l glucose (PAA Laboratories, Østrig) indeholdende 10% FBS (PAA Laboratories, Østrig) og penicillin-streptomycin (PAA Laboratories , Østrig).

for at generere GDF3 knockdown cellelinjer, shRNA oligonukleotider til at målrette GDF3 blev syntetiseret af TibMolBiol (TibMolBiol, Tyskland) og klonet ind lentiviral vektor pLL3.7 (addgene, USA). Alle konstruktioner blev sekventeret (GATC, Tyskland) inden påføring. I kombination med 2 emballering plasmider Pax2 og VSVG virusset blev fremstillet ved calciumphosphat-transfektion af 293T-celler. Mediet indeholdende virus blev opsamlet, 20 × koncentreret i SPIN® FX® UF Concentrator (Corning, Tyskland) og blandet med NCCIT celler med tilsætning af 10 ug /ml polybren (Sigma, Tyskland). Mediet blev skiftet til regelmæssig medium den næste dag.

For at inducere differentiering, NCCIT celler blev behandlet med 10 pM all-trans-retinsyre (Sigma, Tyskland) i 14 dage.

microarray analyse

for transkriptomet analyse humane genom CGH Microarray 44K (Agilent Technologies, USA) blev udnyttet i henhold til fremstiller protokol. Kort fortalt blev det isolerede RNA mærket ved lav RNA Input Fluorescent Linear Amplification kit (Agilent Technologies, USA), fragmenteret, blandet med kontrolmål og hybridiseret natten over. Objektglassene blev derefter vasket og scannet med 5 um opløsning ved brug mikromatrice scanner (Agilent Technologies, USA). Features blev ekstraheret med billedet analyseværktøj A 6.1.1. (Agilent Technologies, USA) ved hjælp af standardindstillinger. Dataanalyse blev udført med Rosetta Informatik Platform Resolver Bygget 4.0.

overrepræsentation analyse blev foretaget ved at uploade de gen-apparater med p-value≤0.05 og fold change≥1.5 til Database til Annotation, Visualisering og integreret Discovery (DAVID ) v6.7 [25] og udføre Gene Onthology analyse ved hjælp af post Panther_BP_ALL.

Microarray data (tiltrædelse nummer GSE44670) er blevet indsendt til NCBI GEO-databasen. Datasættet består af 3 betingelser (A-C, der er beskrevet yderligere i GEO-databasen og i resultaterne del) med en biologisk replikat hver. Den ubehandlede kontrol i A og B er repræsenteret ved en anden prøve.

zonekort blev genereret af CIMminer, et freeware udviklet af Genomics og bioinformatik Group, Laboratorium for Molekylær Farmakologi, Center for Cancer Research, National Cancer Institute . Kun sonder med p ≤ 0,05 og fold forandring ≥1.5 enten microarray A eller B blev udvalgt. Hvis p 0,05, fold ændring blev standard sat til 1 (indstillet til sort farve på zonekort)

Isolering af nukleinsyrer, cDNA syntese og qPCR

Isolering af RNA blev udført ved hjælp af. NucleoSpin® RNA II kit (Macherey-Nagel, Tyskland), følge instruktionerne.

Reverse Transcription af mRNA blev udført ved hjælp af TaqMan® Reverse Transcription reagenser cDNA kit (Applied Biosystems, USA), som pr producentens instruktioner.

Real time PCR blev udført ved anvendelse af 1 pi cDNA med 1 pi primer mix og SensiFAST ™ Sybr nr-ROX kit (Bioline, Tyskland), i 96-brønds PCR-plader (Biozym Scientific, Tyskland), og blev læst med Stratagene MX 3005P ™ Multiplex Kvantitativ PCR System (Agilent Technologies, USA). Primere blev bestilt fra TIBMolBiol (Tyskland).

Primeren liste findes i tabel 1.

Luciferaseassayreagens

BMP-reagerende konstruktion BRE-luc [26] og SMAD bindende element konstruere SBE-luc var slags gaver fra Prof. P. Ten Dijke (Leiden University Medical center). CAGA-luc var en slags gave fra Prof. P. Knaus (Freie Universität Berlin). Cellerne blev udsået, transficeret med TurboFect (Thermo Scientific, Tyskland, procedure ifølge producentens protokol) og 24 timer senere sultet i 3 timer i serum-frit medium og efterfølgende stimuleret i mindst 20 timer med ligand af interesse (rhGDF3, rhNodal og rhBMP2 blev købt fra R B, henholdsvis). På microarray C undersøgte vi virkningerne af GDF3 knockdown i CSC model cellelinie.

Til vurdering af microarray data, kun pletter med en p-værdi ≤0.05, fold ændring ≥1.5 og med officielle gen anmærkning blev inkluderet (tabel 3). Dette indsnævret mængden af ​​differentielt udtrykte gener til 390 og 421 på grund af stimulering med lav og høj dosis af GDF3. Antallet af regulerede transkripter positivt korreleret med styrken af ​​SMAD2 /3 signaleringen induceret af den påtrykte ligand (er) (sammenlign figur 1E). De mest fremtrædende transkriptionelle ændringer med 2075 differentielt regulerede gener blev observeret som et resultat af GDF3 knockdown. Mens grundet GDF3 behandling flere gener blev opreguleret end nedreguleret (microarrays A B, tabel 3), er det modsatte mønster vises som et resultat af GDF3 knockdown (microarray C, tabel 3)

GDF3 retsakter i. en dosisafhængig måde

for at løse den biologiske rolle GDF3, blev generne reguleres grund GDF3 stimulering og knockdown (tabel 3) kategoriseres på grundlag af deres biologiske funktion. Til dette formål regulerede gener med officielle gen navne blev udvundet fra hver microarray og en overrepræsentation blev udført af Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID) v6.7 [25]. Denne procedure gør det muligt at vurdere, om en bestemt funktionelt defineret gruppe af gener er repræsenteret mere end forventet tilfældigt inden et gen liste [32]. Gener reguleres af GDF3 blev klassificeret til hovedkategorier såsom udviklingsprocesser, mesoderm og ektoderm udvikling, neurogenese og signaltransduktion (tabel S1 og tabel 4). Mellem 15,3% og 18,2% af gener reguleres på mikroarrays A og C, var forbundet med udviklingsprocesser. Regulering af gener med funktion i ektoderm udvikling og neurogenese blev bemærket på microarrays A (6,5% og 6,5%) og C (6,5% og 5,8%), men ikke B. Endvidere blandt gener reguleres af GDF3 knockdown 5,3% var forbundet med mesoderm udvikling. Ca.. 25% af gener på alle microarrays blev klassificeret til signaltransduktion. Overrepresetation analyse viste også, at en lille, men betydeligt antal (p ≤ 0,05) af gener relateret til angiogenese på microarray C (0,9%) (tabel S1) er reguleret af SMAD2 /3-signalering.

stimulering af NCCIT celler med forskellige koncentrationer af GDF3 og GDF3 knockdown differentielt påvirket SMAD2 /3 signalering styrke (figur 1E). For yderligere at sammenligne disse virkninger, analyserede vi den kvantitative overlapning af transskriptionelle forandringer i stimulerede celler samt delmængder af gener udelukkende reguleres af hver eksperimentel betingelse (figur 3). De ekstraherede gen lister blev efterfølgende udsat for overrepræsentation analyse. 48 gener var almindeligt reguleret i alle tre betingelser. Imidlertid kun 9 af dem var signifikant beriget efter deres biologiske funktion til den kategori af celleoverfladereceptor medieret signaltransduktion. Af de 2075 og 421 gener differentielt reguleret af GDF3 knockdown eller høj koncentration af GDF3 henholdsvis (A B). Gener med fold-change ≥1.5 og p-værdi ≤0.05 på mindst en af ​​de mikroarrays blev medtaget. Sorte bjælker angiver fold ændring 1,5 eller p-værdi 0,05. Den fold Ændringen er farvekodede fra grøn til rød (se skala bar).

De tre anvendte betingelser at dissekere virkningen af ​​GDF3 på NCCIT celler omfattende (A) høj dosis af GDF3 til maksimalt aktivere SMAD2 /3-vejen, (B) lav dosis af GDF3 til moderat SMAD2 /3 signaleringen og (C) afbrydelse af GDF3 signalering ved GDF3 knockdown genereret forskellige niveauer af GDF3 signalering styrke. Vores resultater indikerer, at modulation af SMAD2 /3 signaleringen af ​​GDF3 stimulering eller afbrydelse af GDF3 signalvejen berører flere biologiske processer, såsom udviklingsprocesser, ektoderm udvikling, neurogenese og signaltransduktion på det transkriptionelle niveau. Derudover stabil GDF3 knockdown førte til induktion af gener associeret med mesoderm udvikling og hæmatopoese in NCCIT celler. Endvidere GDF3 modulerede transkriptomet af NCCIT celler på en dosis-afhængig måde. Selv en lille dosis GDF3 (microarray B) signifikant ændret transkriptomet af målcellerne. Men i modsætning til en høj dosis af GDF3, en lav dosis ikke havde nogen indflydelse på regulering af gener forbundet med udvikling.

GDF3 inducerer ekspression af forskellige gener, der er forbundet med udvikling

signaltransduktion og

for at bekræfte microarray resultater, valgte vi flere gener relateret til signaltransduktion og udviklingsprocesser og valideret deres udtryk på GDF3 stimulering af qPCR. Udarbejdelsen af ​​microarray og qPCR resultater er præsenteret i tabel 5, der opsummerer validering af microarray eksperiment.

Valg kandidater til GDF3 målgener vi fokuserede primært på medlemmer af TGFB familie og transkriptionsfaktorer, som kan fungere som hovedafbrydere i celle skæbne beslutninger.

udtryk for

LEFTY2

, en kendt SMAD2 /3 mål i embryonale stamceller [33], var stærkt opreguleret ved lav og høj dosis af GDF3 (figur 5A) og tjente som en positiv kontrol for stimulering.

a-G. Virkning af stimulation med forskellige GDF3 koncentrationer på transkription af flere gener reguleres på mikroarrays A B. n = 5. H. Virkning af GDF3 knockdown på transkription af flere gener reguleres på mikroarrayet E. n = 3. ekspression blev målt ved qPCR, er resultaterne præsenteret som

GAPDH

ratio og normaliseret til ustimulerede celler (A-G) eller celler transduceret med røræg-vektor (H). P-værdier mindre end eller lig med 0,05 blev betragtet som signifikante. (*) Angiver p ≤ 0,05 og (**) p≤0.01.