PLoS ONE: kræft i bugspytkirtlen modtagelighed Loci og deres rolle i overlevelse

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen har en af ​​de værste dødelighed af alle kræftformer. Der vides kun lidt om dens ætiologi, især med hensyn arvet risiko. Den PanScan projekt, et genom-dækkende forening undersøgelse identificeret flere fælles polymorfier påvirker kræft i bugspytkirtlen modtagelighed. Single nukleotid polymorfier (SNPs) i

ABO

, Sonic pindsvin (

SHH

), telomerase revers transkriptase (

TERT

), nuklear receptor underfamilie 5, gruppe A, medlem 2 (

NR5A2

) viste sig at være forbundet med bugspytkirtlen kræftrisiko. Endvidere scanningen identificerede loci på kromosomerne 13q22.1 og 15q14, hvortil ingen kendte gener eller andre funktionelle elementer er kortlagt. Vi søgte at kopiere disse observationer i to yderligere, uafhængige populationer (fra Tyskland og England), og også evaluere de mulige virkninger af disse SNPs på patientens overlevelse. Vi genotype 15 SNPs i 690 tilfælde af pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) og i 1277 raske kontrolpersoner. Vi gentaget flere associationer mellem SNPs og PDAC risiko. Desuden fandt vi, at SNP rs8028529 svagt var forbundet med en bedre samlet overlevelse (OS) i begge populationer. Vi har også fundet, at

NR5A2

rs12029406_T allel var forbundet med en kortere overlevelse i den tyske befolkning. Afslutningsvis fandt vi, at rs8028529 kunne være, hvis disse resultater replikeres, en lovende markør for både risiko og prognose for denne dødelige sygdom

Henvisning:. Rizzato C, Campa D, Giese N, Werner J, Rachakonda PS, Kumar R, et al. (2011) kræft i bugspytkirtlen modtagelighed Loci og deres rolle i Survival. PLoS ONE 6 (11): e27921. doi: 10,1371 /journal.pone.0027921

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: 27. juni, 2011; Accepteret: 27 oktober 2011; Udgivet: November 18, 2011

Copyright: © 2011 Rizzato et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den Europæiske Union som led i MolDiagPaCa projektet samt det tyske ministerium for uddannelse, forskning (BMBF) som en del af PaCaNet projektet i NGFNplus programmet, og National Institute for Health Research Liverpool, bugspytkirtlen Biomedical Research Unit og Liverpool Eksperimentel Cancer Medicine Centre. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den femte hyppigste årsag til kræftdødsfald i Europa og den ottende i verden, med en fem års relativ overlevelse på mindre end 5% [1]. Ingen effektiv screeningstest for denne malignitet eksisterer, og metastatisk sygdom er almindeligt til stede ved første diagnosticering. Etablerede risikofaktorer omfatter rygning, fedme eller overvægt, en sygehistorie af diabetes type II, og familie historie af kræft i bugspytkirtlen [2].

PanScan projekt, et genom-dækkende forening undersøgelse (GWAS), for nylig identificeret forskellige pancreascancer modtagelighed loci. Adskillige enkelt nukleotid polymorfier (SNP) i genet regioner

ABO

, sonisk pindsvin (

SHH

), telomerase revers transkriptase (

TERT

), nuklear receptor underfamilie 5, gruppe A, del 2 (

NR5A2

) sig at være forbundet med pancreas kræftrisiko [3]. Statistisk signifikante associationer blev også fundet med SNPs kortlægning til en region på kromosom 13q22.1 og en region på kromosom 15q14, hvor ingen kendte gener kortlagt [3].

Generne, som flere af GWAS loci var kortlagt er biologisk plausible kandidater til involvering i kræft i bugspytkirtlen. Flere tidlige undersøgelser rapporteret en sammenhæng mellem ABO blodtype og gastrointestinale kræftformer, stærkeste for mavekræft, men også kendt for bugspytkirtelkræft [4], [5]. SHH spiller en central rolle som en morfogen faktor og er relateret til dannelsen af ​​forskellige maligniteter, herunder pancreascancer [6].

NR5A2

koder en nuklear receptor af fushi tarazu (Ftz-F1) underfamilie, der interagerer med β-catenin og overvejende udtrykt i eksokrine pancreas, lever, tarm og æggestokke hos voksne.

TERT

genet koder den katalytiske subunit af telomerase, afgørende betydning for opretholdelse telomer ender. Mens telomeraseaktivitet ikke kan påvises i de fleste normale væv, er det set hos ca. 90% af humane cancere [7]. Regionen af ​​kromosom 5p15.33 hvor

TERT

kort er blevet identificeret i genom-dækkende forening undersøgelser af en række forskellige cancere, herunder hjernetumorer, lungecancer, basalcellekarcinom og melanom. Selv om regionen på 13q22.1 ikke indeholder kendte gen, er det ofte deleteret i et spektrum af cancere, herunder pancreascancer [8], [9], [10].

GWAS har på overbevisende vist associering mellem flere af disse loci og pancreascancer risiko. For andre (SNPs i

SHH

regionen og i et gen ørken på kromosom 15q14), det viste også lovende foreninger, selvom understøttet af mindre stærk statistisk dokumentation [3]. Derfor søgte vi at kopiere disse observationer i en ekstra, uafhængig befolkning på 690 tilfælde af pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC), og vi vurderet de mulige virkninger af disse SNPs på patientens overlevelse.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle deltagere underskrev en informeret skriftligt samtykke. Undersøgelsen blev godkendt af de etiske anmeldelse bestyrelser de institutioner med ansvar for emne rekruttering i hver af rekruttering centre. De etiske komiteer var følgende: South West Research Ethics Committee (Liverpool Emner), Ethikkommission der Medizinischen Fakultät, Heidelberg (tysk fag), Etik komitéen fra University of Oxford (Oxford fag), Etik komitéen fra University of Cambridge (Cambridge fag ).

studiepopulation

prøver blev indsamlet fra bugspytkirtlen kræftpatienter under operation mellem december 1996 og september 2009 lynfrosset i flydende nitrogen direkte efter resektion og efterfølgende opbevaret ved -80 ° C.

Detaljerede oplysninger om kontrol befolkning er givet andetsteds. Kort fortalt blev der i alt 1141 raske bloddonorer af tysk oprindelse rekrutteret i 2004 på Institut for Transfusion Medicine, Mannheim, Tyskland [11].

136 britiske kontroller blev udvalgt fra folk rekrutteret i to kohorter i EPIC, et igangværende prospektivt kohorte gennemføres i ti europæiske lande. Den EPIC-Norfolk kohorte (https://www.srl.cam.ac.uk/epic/) omfatter over 30.000 personer i alderen 45 til 75 ved rekruttering, bosiddende i Norfolk, East Anglia, og rekrutteret fra almen praksis registre mellem 1993 og 1997 [12]. Den EPIC-Oxford kohorte omfatter 65,429 personer i alderen 20 år og derover og bor i Storbritannien rekrutteret mellem 1993 og 1999 [13]. Karakteristik af patienter og kontroller er beskrevet i tabel 1.

Udvælgelse af gener og polymorfier

Vi valgte 15 polymorfier, der viste sig at være forbundet med risikoen for at udvikle kræft i bugspytkirtlen ved en nylige GWAS [3]. I hver af de seks regioner identificeret af GWAS, valgte vi de SNPs, der viser de stærkeste foreninger: Vi valgte rs12029406, rs10919791, rs3790844 i

NR5A2

gen; rs4635969 og rs401681 for

TERT

/

CLPTM1L

region; rs172310, rs167020 for

SHH

; rs657152, rs505922, rs630014, rs495828 for

ABO

; rs9543325, rs9543325 på 13q22.1; rs8028529 på 15q14. Mere detaljerede oplysninger om den valgte SNP’er er givet i tabel 2.

DNA-ekstraktion og genotype

DNA blev ekstraheret fra frosne eller paraffinindlejrede pancreas væv af 690 patienter med operativt fjernede tumorer ( 576 fra Heidelberg, 114 fra Liverpool) under anvendelse af AllPrep Isolation Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens protokol. Genotypebestemmelse blev udført ved hjælp af en allel-specifik PCR-baserede Kaspar SNP genotypning-system (KBiosciences, Hoddesdon, UK) som anbefalet af producenten. Rækkefølgen af ​​DNA’er fra og kontrolpersoner blev randomiseret på PCR-plader for at sikre, at et lige antal tilfælde kunne analyseres samtidigt. Termocyklingen blev udført ifølge producentens anvisninger. Påvisning blev udført under anvendelse af en ABI PRISM 7900 HT Detektionssekvensen systemet med SDS 2.2 software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Genotypning for britiske kontroller blev udført i forbindelse med en genom-dækkende forbindelsesundersøgelse ved hjælp af menneskelige 660W-Quad BeadChip vifte henhold til producentens instruktioner (Illumina, San Diego, CA, USA) på Imperial College.

Statistisk analyse

Hardy-Weinberg ligevægt blev testet i kontrollerne ved chi square test. Risiko analyse blev udført i alt 690 PDAC tilfælde og 1277 raske kontroller. Vi brugte logistisk regression for multivariate analyser for at vurdere de vigtigste virkninger af den genetiske polymorfi på bugspytkirtlen kræftrisiko ved hjælp af en co-dominant nedarvning model. Den mest almindelige allel i kontrollerne blev tildelt som reference kategori. Alle analyser blev justeret for alder og køn.

For at overleve analyse blev median follow-up tid beregnet med censurerede observationer kun (20%), mens den mediane overlevelse blev beregnet ved hjælp af data fra alle patienter. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som tidsintervallet mellem diagnose og død (ucensureret observation) eller den sidste dato, hvor patienten stadig var i live (censureret observation, medium opfølgningstid 1249 dage). OS blev evalueret under anvendelse af metoder til censureret overlevelsestid. Især blev risikoen for at dø estimeret ved hazard ratio (HR) og intervaller 95% sikkerhedsgrænser (CI) i Cox proportional hazard-modeller. Alle analyser blev udført med STATA software (StataCorp, College Station, TX, USA). For overlevelse analyse, for at tage højde for antallet af udførte prøver i dette projekt, vi beregnet for hvert gen /region antallet af effektive uafhængige variable, M

eff, ved anvendelse af SNP Spectral Nedbrydning tilgang [14 ]. Vi opnåede et gen-wide M

eff værdi for hvert gen og også en undersøgelse for hele M

eff værdi, ved at tilføje op genet M

EFF s. For replikation analyse, da de tilknytninger allerede var blevet overbevisende vist i en GWAS, en korrektion for multiple test er ikke nødvendig, derfor har vi brugt en tærskel på 0,05 for at bekræfte vores resultater.

Resultater

i denne undersøgelse søgte vi at undersøge to forskellige endepunkter: replikation af associationer mellem 15 GWAS SNP’er og risikoen for at udvikle kræft i bugspytkirtlen, og en vurdering af de mulige associationer mellem de samme SNPs og patientoverlevelse

vi. genotypet 15 SNP’er i 690 tilfælde af PDAC og 1277 raske kontroller. Den gennemsnitlige takst var 97,20% (interval 94,69% -98,79%). For 27 tilfælde, både normale og tumorvæv var tilgængelige og anvendes til genotypning. Der blev ikke observeret (398 informative genotype sammenligninger). Ca. 10% af prøverne blev analyseret dobbelt, og konkordansen hastigheden af ​​genotyperne var højere end 99%. Genotypen distributioner på alle loci var i Hardy-Weinberg ligevægt i kontrol, med ikke-signifikante chi square værdier (ved hjælp af en tærskel på p 0,05, data ikke vist).

De frekvenser og fordelingen af ​​genotyper og odds ratio for foreningen af ​​hver polymorfi med PDAC er beskrevet i tabel S1. Vi var i stand til at replikere flere signifikante sammenhænge mellem SNP’er og PDAC risiko. Tabel 3 viser SNPs associeret med bugspytkirtelkræft risiko i denne undersøgelse. Den stærkeste association med en øget risiko for PDAC vi observerede var med C allel af 9q34 rs9543325 SNP (OR

het 1,23, 95% CI 0,98-1,55, OR

hom 1,60, 95% CI 1,14-2,25, P

trend = 0,0023). For to SNPs i

NR5A2

(rs12029406, rs10919791), en i

SHH

(rs167020) og 15q14 regionen SNP (rs rs8028529) ingen statistisk signifikant sammenhæng blev fundet. Figur S1 viser en oversigt over de gentagelser i undersøgelsen. Tabel S1 viser fordelingen af ​​hver SNP genotypebestemmes i undersøgelsen, og de relative yderste periferi i de to populationer separat og sammen.

Vi undersøgte en mulig sammenhæng mellem de valgte SNPs og patient overlevelse. Median overlevelse af tilfældene var anderledes hos patienter fra Liverpool (305 dage) og Heidelberg (387 dage Cox regression test, p = 10

-5), derfor har vi foretaget denne analyse separat for de to populationer. Resultaterne af denne analyse er angivet i tabel 4 og tabel S2.

Vi fandt, at SNP rs8028529 (placeret på kromosom 15q14) svagt var forbundet med en bedre OS i begge populationer. I den tyske befolkning, fandt vi, at de heterozygote bærere havde en bedre overlevelse (HR = 0,73, 95% CI 0,59-0,91, p-værdi = 0,01, median overlevelse af heterozygoter = 440 dage, median overlevelse af homozygote for den fælles allel = 346 dage ), mens der blev observeret en bedre overlevelse i den britiske befolkning i homozygote bærere af variant allel (HR = 0,40, 95% CI 0,16-1,01, P = 0,05, median overlevelse af homozygote for variant allel = 421 dage, median overlevelse homozygote for den fælles allel = 287 dage). Analyse alle prøver sammen, justere efter alder, køn og rekruttering center, observerede vi, at den kombinerede genotype (C /T + C /C) havde en statistisk signifikant sammenhæng med bedre overlevelse PDAC: HR = 0,76 (95% CI 0,64-0,92 ) p = 0,004.

i den tyske befolkning bærere af mindst én T allel af rs12029406 SNP, som hører til

NR5A2

gen, viste en kortere overlevelsestid (HR = 1,23 , 95% CI 1,01-1,49, P = 0,04, median overlevelse allel luftfartsselskaber = 359 dage). Tabel 4 viser resultaterne for disse to SNPs mens tabel S2 viser resultaterne for hele SNPs.

Vi beregnede M

eff værdier for hver kandidat gen /region separat og for hele undersøgelsen (ved at tilføje individuel gen M

eff værdier;). Undersøgelsen hele M

eff var 9,8. Vi brugte derfor en undersøgelse for hele signifikans p-tærskel på 0,05 /9,8 = 0,0051. Under anvendelse af denne tærskel, sås ingen signifikante associationer mellem nogen af ​​de polymorfier genotypede og overlevelse patienter, med undtagelse af T allel af rs8028529, i den poolede population, med bedre patienter overlevelse.

Diskussion

kræft i bugspytkirtlen er blandt de mest dødelige af kræft, med dødeligheden nærmer incidensrater [1], [15]. Der findes ingen effektiv helbredende behandling endnu for kræft i bugspytkirtlen. Kirurgi er den eneste behandlingsmulighed, der forbedrer overlevelsen. Derfor finde genetiske varianter associeret med sygdomsrisiko, progression og overlevelse er af allerstørste betydning. I betragtning af, at der er få kendte risikofaktorer, forbedrede diagnostik og en bedre forståelse af den molekylære patogenese af denne sygdom er et presserende behov for.

Vi rapporterer revurderingen af ​​15 SNPs fundet at være forbundet med kræft i bugspytkirtlen risiko som rapporteret i PanScan [3] og deres mulige involvering i patientens overlevelse. I denne undersøgelse, var vi i stand til at replikere seks SNPs på en P

værdi på mindst 0,05 (0,0449 til 0,0023). Vi kunne ikke kopiere de andre rapporterede foreninger, selv om allele frekvenser i vores forsøgspersoner var sammenlignelige med dem, der opnås i PanScan, og tendenser risiko gik i samme retning som rapporteret af PanScan. En mulig forklaring på vores fiasko i replikere foreningerne kan skyldes utilstrækkelig statistisk styrke.

Den vigtigste og roman fund af dette manuskript er det faktum, at C-allelen af ​​SNP rs8028529, som ligger i et gen ørken på kromosom 15q14 er forbundet med bedre overlevelse. Denne forening nåede statistisk signifikans ved den konventionelle 0,05 tærskel, i begge populationer vi undersøgt, selv om den tyske sager signifikans blev kun observeret for den heterozygote (C /T) bærere, mens det for de britiske tilfælde blev observeret for de homozygote bærere af varianten allel (C /C) alene. En analyse af alle prøver tilsammen, justere efter alder, køn og rekruttering center, afslørede, at den kombinerede genotype (C /T + C /C) havde en statistisk signifikant sammenhæng med bedre overlevelse PDAC: HR = 0,76 (95% CI 0.64- 0,92) p = 0,004. I PanScan blev association mellem det C-allel og en øget risiko for kræft i bugspytkirtlen. Det er meget vanskeligt at forstå den biologiske mekanisme, der kunne forklare disse associationer siden SNP ligger i et gen ørken. Den nærmeste genet (placeret i en afstand på ca. 500 kb) er myeloid ecotropiske insertionssted homeobox 2 (

MEIS2 Salg), som vides at blive udtrykt i høje niveauer i bugspytkirtlen og i bugspytkirtelkræft (data fra in silico Transcriptomics database) [16]. Dette gen koder for et homeobox protein tilhører fortællingen ( ‘tre aminosyrer loop extension “) familie af homeodomæne-holdige proteiner. Tale homeobox proteiner er meget bevares transskription regulatorer, og flere medlemmer har vist sig at være væsentlige bidragydere til udviklingsmæssige programmer. Nylige undersøgelser har vist, at Meis proteiner også kan være involveret i tumorigenese, selvom den underliggende mekanisme er endnu ikke klart [17], [18]. Vi spekulere, at SNP kunne være beliggende i en regulatorisk region af

MEIS2

gen, der kan ændre sit udtryk og på den måde ændre kræftrisiko og prognose. En lignende mekanisme synes at være på plads ved locus på kromosom 8q24, hvor SNP’er associeret med risiko for flere cancertyper er placeret i et gen ørken. De seneste data tyder på, at en af ​​disse SNPs kan påvirke bindingen af ​​en transskription faktor, der regulerer WNT sti og eventuelt

MYC

onkogen, der kortlægger ca. 1 Mb nedstrøms [19].

I denne rapport har vi fandt også, at

NR5A2

rs12029406_T allel er forbundet med en kortere overlevelse, dog kun i på den tyske befolkning. I en nylig gennemgang Li og Abruzzese [20] påpege, hvorfor denne receptor kan spille en rolle i bugspytkirtelkræft. Forfatterne rapporterer, at det er blevet spekuleret,

NR5A2

bidrager til sygdomme i tilknytning til pankreatisk dysfunktion, såsom diabetes. For eksempel NR5A2 spiller en vigtig rolle i transkriptionel aktivering af adiponectin genet [21], en adipocyt-secerneret hormon, der er blevet foreslået at være en biologisk sammenhæng mellem fedme og øget risiko for kræft i bugspytkirtlen [22]. Det er interessant at bemærke, at en

NR5A2

gen variant er blevet forbundet med overskydende BMI i et genom-dækkende sammenslutning undersøgelse [23]. SNPs i

NR5A2

, såsom rs12029406, kan modulere receptoren aktivitet som igen kan ændre sygdomsrisiko og overlevelse.

Anvendelse af korrektion for multiple test den eneste forening, der er lavere end den studere-wise grænse på 0,0051 blev vist ved den kombinerede analyse af de to populationer for T allel af rs8028529 og bedre overlevelse. Resultaterne i de to populationer ikke er identiske, men alle HRS går i samme retning i begge populationer, dvs. en beskyttende virkning af varianten allel, selvom de statistisk signifikans kun i heterozygoter i populationen fra Heidelberg og kun i homozygote i befolkningen fra Liverpool. Faktisk, ved at samle sammen de to populationer effekten af ​​allel forbliver ens med hensyn til HR, men den statistiske signifikans stiger, da det forventes ved at øge antallet af de emner i undersøgelsen. Det er ikke umiddelbart til at forklare denne forskel: det kan være, at resterende forstyrrende faktorer maske foreningerne for heterozygoter i den britiske og i de homozygote i tyskerne, eller forskellen i overlevelse mellem de to populationer kan bidrage til at skjule den sande forening . Endelig kan det være, at disse foreninger er skyldes tilfældigheder.

Disse resultater skal tages med forsigtighed, og yderligere gentagelser og funktionelle studier er berettiget. Den omstændighed, at polymorfi er beliggende i et langt uudforsket gen ørken region gør det vanskeligt at virkelig vurdere en umiddelbar klinisk effekt for konstateringen rapporteret i denne undersøgelse. Disse resultater, hvis bekræftet, kan bede forskning om molekylærbiologi af mekanismen, og dette kan i sidste ende fremme vores forståelse af sygdommen. Et godt eksempel er de 8q24 hits, hvor efter en original epidemiologisk observation, har mange undersøgelser bidraget til at afdække forholdet mellem SNPs i regionen og aktiveringen af ​​

MYC

gen [19]. Fra dette punkt af se vores undersøgelse kan betragtes som et første indledende skridt, der kan bidrage til en bedre forståelse af sygdommen og, på længere sigt, til etablering af diagnostiske og prognostiske værktøjer.

Det kan konkluderes, vi præsenterer her replikation af seks tidligere associerede SNPs med kræft i bugspytkirtlen risiko og den første tegn på en mulig inddragelse af rs8028529 i PDAC prognose.

Støtte Information

Figur S1.

Replication af associationer mellem PanScan SNP’er og risiko for PDAC.

doi: 10,1371 /journal.pone.0027921.s001

(TIF)

tabel S1. Salg Sammenslutninger af SNPs på kromosom 1q32.1, 5p15.33, 7q36, 9q34, 13q22.1, 15q14 med risiko for PDAC.

doi: 10,1371 /journal.pone.0027921.s002

(DOC)

tabel S2.

Cox regressionsanalyse for SNPs genotypede i PDAC tilfælde og overlevelse.

doi: 10,1371 /journal.pone.0027921.s003

(DOC)

Tak

Vi takker Prof. Bugert ved Institut for Transfusion Medicin og Immunologi, Tysk Røde Kors Blood service Baden-Württemberg – Hessen for at give kontrol DNA-prøver

.