PLoS ONE: Spredning af Alu Methylering til arrangøren af ​​MLH1 Gene i Gastrointestinal Cancer

Abstrakt

De meget gentagne Alu retroelements betragtes som methylering centre i genomet. Methylering i genpromotorer kan sprede sig fra dem. Promotor methylering af

MLH1

ofte påvist i kræft, men den underliggende mekanisme er uklar. Formålet med denne undersøgelse er at forstå, hvorvidt methylering i Alu elementer er forbundet med promotor-methylering i MLH1-genet. Bisulfit genomisk sekventering blev anvendt til at analysere CpG steder i 5′-enden (promotor, exon 1 og Alu-holdige intron 1) af

MLH1

gen i kolorektal cancer celler og væv og mavekræft væv. Hypometylering i Alu elementer og hypermethylering i initiativtagerne og regionerne mellem initiativtagerne og Alu elementer blev påvist i to cancer cellelinjer og syv kræft væv. Imidlertid demethylering eller hypometylering af MLH1-promotoren og regioner mellem promotoren og Alu elementer, og hypermethylering i Alu elementer, blev identificeret i de normale væv.

MLH1

promotor methylering kan spredes fra Alu elementer, der er placeret i intron 1 i

MLH1

gen.

trans-virkende

elementer binder til mutationen sites kunne spille en rolle i methylering breder

Henvisning:. Wang X, Fan J, Liu D, Fu S, Ingvarsson S, Chen H (2011) Spredning af Alu Methylering til arrangøren af ​​

MLH1

Gene i Gastrointestinal Cancer. PLoS ONE 6 (10): e25913. doi: 10,1371 /journal.pone.0025913

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Juli 14, 2011; Accepteret: September 13, 2011; Udgivet: 12 oktober 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi (2010MS034). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MLH1

er et stort mismatch repair gen, som spiller en rolle i at bevare stabiliteten af ​​genomet.

MLH1

dysfunktion kan forårsage en høj genmutationer i genomet. Promotor methylering af

MLH1

, især C-området (-310 til -240, i forhold til initieringskodonen), der indeholder 8 CpG sites, er en hyppig begivenhed i kræft, hvilket kan resultere i tab af

MLH1

ekspression [1] – [3]. Til dato, mekanismen for

MLH1

methylering er uklar. Vores tidligere undersøgelser har vist, at

MLH1

methylering kan være forbundet med

MLH1

-93SNP [4], [5]. Men den molekylære basis bag dette er ukendt.

Alu er et af de repetitive elementer i genomet, som er hypermethyleret i normale celler [6]. Alu elementer menes at være methylering centre i genomet [7]. Ved cancer, kan genpromotor methylering spredes fra tilstødende repetitive elementer [7]. Graff et al. [8] kortlagt methylering mønstre af

E-cadherin

von Hippel-Lindau

tumorsuppressorgener i både normale og neoplastiske celler og fandt, at der findes grænser mellem de methylerede initiativtagere og den nærliggende hypermethyleret Alu elementer, for at opretholde den ikke-methylerede status af de promotorer i normale celler, og at grænserne kan gradvis tilsidesættes af methylering af Alu elementer, hvilket resulterer i promotor-methylering i neoplasi.

der er identificeret tre Alu elementer i intron 1 af

MLH1

ved at søge en database af humane Alu gentagne elementer (fig. 1). Ingen Alu elementer findes i

MLH1

promoter region. status methylering af hvert CpG websted inden Alu elementer af

MLH1

er ikke blevet udpeget. Det er muligt, at

MLH1

promotor methylering sker fra nærliggende Alu elementer. For at teste dette analyserede vi status for methylering af alle CpG-stederne i

MLH1

5′-enden (C-regionen indeholdende promotoren, exon 1 og størstedelen af ​​intron 1) (fig. 1) i colorektale cancerceller og væv , gastrisk kræft væv og normale væv ved hjælp af bisulfit genomisk sekventering, og fandt, at Alu elementer i intron 1 af

MLH1

er hypomethylated, og initiativtagere og regionerne mellem

MLH1

initiativtagere og Alu elementer er hypermethyleret i kræft. Men i de normale væv Alu elementer hypermethyleret, og initiativtagerne og regionerne mellem initiativtagerne og Alu elementer er ikke methyleret eller hypomethylated.

Der er tre Alu elementer i intron 1, hvis størrelser og placering er vist ved nukleotidnumrene. De relative størrelser og placeringer af de 27 PCR amplikoner afbildet ved dristige linjer, som dækker et område fra -339 til 116 + 2876.

Materialer og metoder

Etik redegørelse

Denne forskning er godkendt af revisionen bestyrelse Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi. Vi opnåede vævsprøver med skriftlig informeret samtykke fra de involverede i undersøgelsen deltagere. Den etiske komité godkendt specifikt procedurerne.

Normal og kræft prøver

To kolorektale cancer cellelinjer, RKO og SW48, med

MLH1

promotor methylering [2] blev bestilt fra Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). I alt 188 kolorektal og 27 mavekræft væv med matchede normal slimhinde blev opnået fra Tongji hospital (Wuhan, Kina). Det perifere blod fra en rask person blev også opnået fra Tongji hospital (Wuhan, Kina).

Cellekultur og DNA-isolering

Celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO

2 atmosfære. DNA blev ekstraheret fra celler, kræft væv, normal slimhinde og blodprøver ved hjælp af DNA isolation kit (Sangon, Shanghai, Kina) og TIANamp genomisk DNA-kit (Tiangen, Beijing, Kina).

Karakterisering af tumorer

Alle tumorer blev vurderet for mikrosatellit instabilitet (MSI) ved anvendelse af fem mikrosatellit gentagelser (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, og D17S250), som tidligere beskrevet [1]. For MSI positive tumorer, blev den ekstraherede DNA omregnet ved hjælp af EZ DNA-methylering Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA, USA).

MLH1

methylering ved cytosiner på -250 og -252 i forhold til initieringskodonen blev vurderet ved hjælp af kombineret bisulfit restriktionsanalyse (COBRA) med BstUI [1].

immunhistokemisk (IHC) farvning

IHC farvning for MLH1 proteiner blev udført på 5-um snit fra paraffinindlejret tumor og tilstødende normale væv blokke med antistof MLH1 (ab92312, Abcam, UK). Snittene blev deparaffinised, rehydratiseret og skyllet i ledningsvand før antigen-genvinding ved kogning i en 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) to gange i 5 min. Snit blev inkuberet med antistoffer natten over ved 4 ° C. IHC-farvning blev visualiseret under anvendelse af Strep ABC Complex /peberrod peroxidise (HPR). Tumorer blev gradueret af intensiteten af ​​farvning som negative, svagt positiv, moderat positiv og stærkt positiv.

bisulfit genomisk sekventering

For COBRA-positive prøver, status methylering af

MLH1

5′-ende blev bestemt ved anvendelse bisulfit genomisk sekventering. I alt var der 27 PCR amplikoner til dækning regionen fra -339 til 116 + 2876, i forhold til translationsstartstedet (fig. 1). De anvendte primere er vist i tabel S1. PCR blev udført ved 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 30 sek, 55-61 ° C i 45 sek og 72 ° C i 1 min med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min. En varm start blev anvendt ved tilsætning af enzymet under den første cyklus ved ca. 72 ° C, efter en præinkubation på 5 min ved 95 ° C. PCR-produkterne blev testet i 2% agarosegel og derefter klonet ind i peasy-T1-vektoren (transgen Biotech, Beijing, Kina). Den koloni-PCR blev foretaget for at screene de positive kolonier. Klonerne med de rigtige størrelser af PCR-produkter blev sekventeret på en ABI sequencer med farvestof terminatorer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Med sekventering resultater af fem kloner, blev frekvensen methylering bestemt for hver CpG websted.

Mutation screening

MLH1

5′-enden for methylering analyse blev sekventeret ved hjælp af den uomvendte DNA fra cancerceller og væv. De 10 par anvendte primere er vist i tabel 1. PCR blev udført ved 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 35 cykler ved 95 ° C i 30 sek, 58-66 ° C i 30 sek og 72 ° C i 1 min med en endelig ekstension ved 72 ° C i 7 min. Så PCR-produkterne blev direkte sekventeret ved hjælp af ABI sequencer.

Resultater

Screening af kolorektal og mavekræft vævsprøver med MLH1 promotor methylering

Af de 188 kolorektal og 27 mavekræft væv, 48 kolorektal og 9 mavekræft prøver viste sig at have MSI positiv fænotype. MSI positive prøver blev derefter undersøgt for MLH1 promotor methylering og 4 kolorektal og 3 mavekræft prøver udstillet MLH1 promotor methylering (fig. 2).

De fire tarmkræft (C8T, C15T, C35T og C156T) og 3 gastrisk kræft (G9T, G19T og G24T) blev analyseret. Symbol “-“. Betyder, at PCR-produkter blev fordøjet uden

BstUI

, og “+” betyder fordøjelse med

BstUI

Foreningen af ​​MLH1 methylering og negativ eller svag udtryk for MLH1

De syv MLH1 methylering prøver, sammen med deres tilstødende normale væv, blev analyseret for MLH1 udtryk ved hjælp IHC farvning. Alle syv cancervæv viste negative eller svagt positive ekspression af MLH1, og deres tilgrænsende normale væv havde stærk ekspression (fig. 3).

A og B repræsenterer en colorektal tumor (T) og det tilstødende normale væv (N ) henholdsvis; C og D viser en gastrisk tumor (T) og det tilstødende normale væv (N). A: negativ farvning; C: svag farvning; B og D:. Stærk farvning

Sammenligning af MLH1 methylering mønstre mellem raske og kræft

I alt 93 CpG sites placeret på analyserede region blev målt for methylering status ved hjælp af bisulfit genomisk sekventering (fig. 4). De to kolorektale cancercellelinjer, fire MSI positve colorektale cancervæv og tre MSI positive mavekræft væv viste forskellige mønstre i forhold til MSI negative kolorektal cancer væv, den normale colorektal og gastrisk mucosa og perifert blod (fig. 5). MSI negative kolorektal cancer væv, den normale kolorektal og maveslimhinden og perifert blod viste ingen methylering i

MLH1

promotor, og demethylering eller hypometylering (mindre end 50%) i regionerne mellem initiativtagere og Alu elementer, hvorimod regionerne inden eller efter Alu elementer udstillet hypermethylering (mere end 50%). I modsætning til de kolorektal cancer celler og væv (MSI positiv) og mavekræft væv (MSI positiv),

MLH1

initiativtagere og regionerne mellem initiativtagerne og Alu elementer hypermethyleret, med undtagelse af en meget få hypomethylated CpG sites. Men regionerne inden for eller nedstrøms for Alu elementer viste en vis grad af hypometylering eller demethylering forhold til de normale væv. Desuden blev den hypometylering og demethylering oftere ses i kolorektal og gastrisk cancer væv (MSI positiv) sammenlignet med de kolorektale cancerceller (fig. 5).

De CpG steder er understreget. Kloner 1, 3 og 4 viste methylering, og kloner 2 og 5 ingen methylering. Methylering frekvensen af ​​CpG site er 60%. WT, vildtype; CT, konverterede type.

I alt 93 CpG sites analyseres. Imidlertid kan 92 CpG sites ses i normal colorektal slimhinde, på grund af en overgang af G til A ved en CpG-sted mellem Alus 1 og 2. •, ▴, ▪, □, △ og ○ repræsenterer methylering frekvens på 100%, 80%, 60%, 40%, 20% og 0, hhv. 80% angiver, at af de 5 kloner, 4 udviste methylering på et CpG site. RKO og SW48: kolorektal celler; C8T, C15T, C35T, C156T: MSI positive kolorektal cancer væv; C161T: MSI negativ kolorektal cancer; C161N: C161T matchede normalt væv; og G9T, G19T og G24T:. MSI positive gastrisk kræft

Mutation screening i kræftcellerne og væv

Mutationer i

MLH1 5′

ender for methylering analyse blev screenet i de 2 cancerceller og 7 cancervæv. En tyk- og en gastrisk cancer væv blev fundet at have mutationer i forhold til deres hosliggende normale væv (fig. 6). En kolorektal og en gastrisk cancer udviste en identisk heterozygote mutation, A → G, på det samme sted, IVS1 681 bp. Deres tilstødende normale væv viste ikke mutationen, hvilket indikerer, at det er somatiske og tumor-specifikke.

En kolorektal og en mavekræft, C15T og G19T, udviste en identisk heterozygote mutation, A → G, på samme site, IVS1 681 bp. Deres tilstødende normale væv, C15N og G19N, viste ikke mutationen. Pile viser de steder, hvor mutationerne.

Diskussion

De methylering mønstre af Alu elementer i

MLH1

ikke tidligere har været undersøgt i normale væv. I denne undersøgelse har vi analyseret status for methylering af CpG sites inden for de tre Alu elementer placeret i intron 1 af

MLH1

, og fandt, at alle tre Alu elementer er ved niveauer på hypermethylering i normal colorektal og gastrisk mucosa og perifert blod (fig. 5). Det er i tråd med tidligere fund, at Alu elementer er hypermethyleret i de normale gastriske mucosa, bryst epitel og nyre væv [6], [8]. MSI negative colorektal tumor vises meget lignende mønster methylering til de normale væv (fig. 5). Normalt skal methylering inden for Alu elementer ikke spredes til de tilstødende CpG-øer på grund af blokering med SP1 elementer [9], [10]. Her viste vi, at regionerne opstrøms for de Alu elementer er ikke-methyleret eller hypomethylated på normal colorektal og gastrisk mucosa og perifert blod. Klare grænser ses mellem hypermethyleret Alu elementer og hypomethylated regioner opstrøms for dem (fig. 5). Der er flere hypomethylated CpG sites opstrøms for de Alu elementer i normale væv, og disse bindingssteder for CpG er ude af C-området (fig. 5), hvilket antyder en begrænset spredning af Alu-methylering i normale celler. Nogle bindingssteder for CpG omkring eller inden for Alu elementer i normale væv vises under 100% methylering (fig. 5), hvilket antyder, at methylering af individuelle steder er ikke afledt ved kloning, selv om det overordnede mønster af methylering overføres fra celle til celle. I tråd med dette, er det blevet vist, at muse adenin-phosphoribosyltransferase-genet har mønstre for methylering, som er forskellige mellem leverceller [10]. Mekanismen bag dette kunne være, at methylering centre i identiske gener i forskellige celler har variabel styrke signal rejser opstrøms eller nedstrøms [11].

Afbrydelse af SP1 elementer letter

de novo

methylering af tilstødende bindingssteder for CpG [9], [10], [12], og inducerer epigenetisk gen inaktivering [12]. Det foreslås, at Alu elementer er methylering centre i [8] genom. De methylering mønstre af Alu elementer i

MLH1

denatureret kolorektal kræftceller RKO og SW48 er ikke tidligere blevet undersøgt. RKO og SW48 har vist sig at have methylering i

MLH1

promotorregion, især i C-området (-310 til -240 i forhold til initieringskodonet), som forårsager reduceret

MLH1

ekspression [2]. I denne undersøgelse analyserede vi også methylering mønstre i

MLH1

initiativtagere, de tre Alu elementer og regionerne mellem initiativtagere og Alu elementer. Sammenlignet med den normale colorektal og gastrisk mucosa og perifert blod viste Alu elementer hypometylering især i Alus 2 og 3 i både RKO og SW48. Endvidere regionen nedstrøms for Alu 3 viste hypometylering i både RKO og SW48 (fig. 5). Imidlertid blev initiativtagerne og især regionerne mellem initiativtagere og Alu elementer hypermethyleret i RKO og SW48 (fig. 5). Dette tyder stærkt på, at

MLH1

promotor methylering spreder fra methylering centre inden for intron 1 af

MLH1

.

Fordi dyrkede cancer cellelinjer anses for at have en højere grad af methylering end primære tumorer [13], besluttede vi at analysere de primære tumorer for MLH1 methylering mønster i de samme regioner som cellelinierne. En noget lavere grad af methylering blev påvist i MLH1 promotorregionen i 4 MSI positive colorectal og 3 MSI positive gastriske cancere forhold til de to cellelinier (fig. 5). Men hypermethyleret initiativtagere, især i C-regioner, og regionerne mellem initiativtagerne og Alu elementer er set i alle syv kræftformer analyserede. Nogle regioner i og omkring Alu elementer var naturligvis hypomethylated i tumorvæv. Derfor foreslår kraftigt data fra cancervæv, at methylering er breder sig fra de Alu elementer til 5′-regionen af ​​MLH1 i MSI positiv kolorektal og gastrisk cancer væv, såvel som i de kolorektale cancercellelinjer. Alu hypomethylering er blevet identificeret i gastriske carcinomer og melanoma cellelinier [6], [14]. En anden repetitiv sekvens, LINE-1, viste også hypometylering i maligne gastrointestinale stromale tumorer [15]. Hypomethylering kan øge maligne potentiale af tumorer ved at inducere akkumulering af kromosomafvigelser eller methylering spredes til promotorerne for tumorsuppressorgener. Således methylering af de repetitive sekvenser kan være en nyttig markør for malignitet vurdering.

Et Sp1 element blev identificeret ved -119 af

MLH1

promoter region hjælp transkriptionsfaktor søgning software (TFSEARCH ver.1.3 ). For at konstatere, om der er mutationer i Sp1 element, vi sekventeret hele regionen analyseret ovenfor i kræft cellelinjer og væv. Der blev ikke påvist mutationer i Sp1 element, men en MSI positiv kolorektal og en MSI positiv mavekræft viste A → G-mutation, på det samme sted, IVS1 681 bp i MLH1 genet. Dette site er mellem promotoren og Alu elementer. Vores fund tyder på, at regionen er en mutational hotspot i patogenesen af ​​kolorektal og mavekræft. Vi spekulere i, at

trans-virkende

elementer binder til denne hjemmeside eller andre websteder, der er mellem promotoren og Alu elementer, kan være involveret i methylering breder sig fra de Alu elementer til promoter regionen. Derfor er de

trans-virkende

elementer kunne opføre sig som vogtere af de methylering centre, f.eks Alu elementer. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at søge efter dem,

trans-virkende

elementer, som kunne være de terapeutiske mål for kræft i fremtiden.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Oligonukleotidsekvenser af primerne til methyleringsanalyse.

doi:. 10,1371 /journal.pone.0025913.s001

(DOC)

Tak

Vi takker Anna Yates for kritisk gennemgang af manuskriptet