PLoS ONE: Systemisk siRNA Nanopartikel-baserede lægemidler Kombineret med Radiofrekvens ablation for Cancer Therapy

Abstrakt

Formål

radiofrekvenser termisk ablation (RFA) af hepatiske og renale tumorer kan være ledsaget af ikke-ønskede tumorigenese i residual, ubehandlet tumor. Her studerede vi brug af micel-indkapslet siRNA til at undertrykke IL-6-medieret lokale og systemiske bivirkninger af RFA.

Metoder

Vi sammenlignede standardiseret lever- eller renal RFA (laparotomi, 1 cm aktiv tip ved 70 ± 2 ° C i 5 min) og humbug procedurer uden og med administration af 150 nm micelle-lignende nanopartikler (MNP) anti-IL6 siRNA (DOPE-PEI konjugater, enkelt IP-dosis 15 min post-RFA, C57BI mus : 3,5 ug /100 ml, Fisher 344 rotte: 20 ug /200 ul), RFA /krypteret siRNA, og RFA /tom MNP’er. Resultatmål omfattede: lokal periablational cellulær infiltration (α-SMA + stjerneformige celler), regional hepatocytproliferation, serum /væv IL-6 og VEGF-niveauer ved 6-72hr, og fjern tumorvækst, spredning (Ki-67) og mikrovaskulær densitet ( MVD, CD34) i subkutane R3230 og MATBIII bryst adenocarcinom modeller på 7 dage.

Resultater

For lever RFA, adjuverende MNP anti-IL6 siRNA reducerede RFA-inducerede stigninger i væv IL-6 niveauer , α-SMA + stjerneformet celle infiltration, og regional hepatocytproliferation til baseline (p 0,04, alle sammenligninger). Desuden adjuverende MNP anti-IL6- siRNA undertrykt øget fjernt tumorvækst og Ki-67 observeret i R3230 og MATBIII tumorer poste hepatisk RFA (p 0,01). Anti-IL6 siRNA reducerede også RFA-induceret stigning i VEGF og tumor MVD (p 0,01). Ligeledes blev renale RFA-inducerede stigninger i serum IL-6 niveauer og fjern R3230 tumorvækst undertrykkes med anti-IL6 siRNA (p 0,01).

Konklusioner

Adjuverende nanopartikel-indkapslet siRNA mod IL-6 kan anvendes til at modulere de lokale og regionale virkninger af hepatisk RFA at blokere potentielle uønskede pro-onkogene virkninger af lever- eller nyre RFA om fjernt tumor

Henvisning:. Ahmed M, Kumar G, Navarro G, Wang Y, Gourevitch S, Moussa MH, et al. (2015) Systemisk siRNA Nanopartikel-baserede lægemidler Kombineret med Radiofrekvens ablation for Cancer Therapy. PLoS ONE 10 (7): e0128910. doi: 10,1371 /journal.pone.0128910

Redaktør: Yi-Hsiang Huang, National Yang-Ming University, TAIWAN

Modtaget: Marts 19, 2015; Accepteret: May 1, 2015; Udgivet: 8 jul 2015

Copyright: © 2015 Ahmed et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden manuskriptet

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute (CCNE 1U54CA151881-01 VPT, SNG, MA, TL), Radiologisk Society of North America Research og Education Foundation (RSD1215, MA), Harvard Medical Faculty Physicians Faculty Radiologi Foundation (MA), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SF8841, EG), den israelske center of Excellence i-CORE (EG), og Israel Science Foundation (EG, SNG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Der har været meget nylige interesse i at bruge RNA-interferens ( “post-transkriptionel gendæmpning«), og navnlig de små interfererende RNA (siRNA) i behandlinger mod kræft. Dette har i høj grad fokuseret på enten modulering cellulære protein responser til forbedring virkningsfuldhed af primær farmakologisk /onkologiske terapier [1,2], forstærke antitumor-immunitet ved selektiv knockdown af immunrespons undertrykke proteiner, eller kemo-sensibilisering ved nedregulering af vækstfaktor-receptor-gener [3-6]. For at overvinde begrænsninger i levering med gratis siRNA i

in vivo

systemer, siRNAs blevet almindeligvis gives hjælp nanopartikler bærere (såsom liposomer, miceller, eller bundet til partikler) for at maksimere væsentlige

passiv

væv levering (omend i højere koncentrationer) til primære organer og målrette tumorer [7-11]. Men selv hjulpet af Nanobærer levering, udfordringer til levering intratumoral og målrettet lægemiddel vedvarer [1,3]. Derudover har få studier anvendt hjælpestof siRNA sammen med ikke-farmakologiske paradigmer, såsom modulering væv eller fysiologiske reaktioner efter kirurgiske, interventionel eller strålebehandlinger.

Image-styret termisk væv ablation ved hjælp radiofrekvens, mikrobølgeovn, eller laserenergi til at skabe lokal høj temperatur (60-100 ° C) opvarmning omkring et perkutant placeret applikator er nu i udbredt klinisk anvendelse til behandling af fokale tumorer i lever, lunge, nyre og knogle ( 100.000 tilfælde /år på verdensplan) [ ,,,0],12]. Vellykket komplet tumor ablation kræver også inddragelse af en 5-10 mm rand af normal parenkym som en “ablativ margen” for at sikre fuldstændig udryddelse tumoren [13]. I et forsøg på at sikre fuldstændighed af behandling, har vi vist, at administration af selv en enkelt dosis af lægemiddel-loaded nanopartikel kemoterapi samtidig med RF-ablation kan føre til stigninger i lokal periablational lægemiddelafgivelse (op til 10 gange), med deraf følgende øget tumor ødelæggelse, øget dyr endpoint overlevelse, og større mængder af tumor ødelæggelse i patienter med levertumorer [14-16]. For nylig har vi yderligere succes gearede denne forbedrede omdrejningspunkt levering til at målrette specifikke RFA-inducerede vævsreaktioner (såsom øget DNA intercalation eller undertrykke HSP produktion) [16,17].

En række undersøgelser har vist, at sub- letal lavere opvarmning af væv (40-47 ° C) omkring ablationszonen ansporer flere sekundære vævsreaktioner [18], herunder øget inflammatorisk cytokin (såsom IL-6 og IL-10) [19] og vækstfaktor (såsom HGF, HIF-1α, og VEGF) [20-22] produktion; infiltration af scavenger og immunogene celler i periablational væv [23]; og hypertermi-inducerede stigninger i vaskulær permeabilitet og endotel utæthed [24]. Især har de seneste undersøgelser vist, at øget serum interleukin-6 produktion efter termisk ablation af normal lever (simulerer den kliniske endpoint ablation hele leveren tumor og dens “ablativ margin” af normale omgivende lever) er en vigtig drivkraft for periablational infiltration af inflammatoriske og immunogene celler såsom makrofager og a-glat muskulatur actin (SMA) positive hepatiske stjerneformige celler [23,25]. Disse igen kan frembringe yderligere aktivering af downstream vækstfremmende veje såsom cytokiner i HGF /c-Met-vejen, og øget hepatocytproliferation i ubehandlede lever-processer, som er markant reduceret i IL-6-knockout-mus [25]. I betragtning af, at en vellykket komplet tumor ablation kræver også inddragelse af en 5-10 mm rand af normal parenkym som en “ablativ margen” for at sikre fuldstændig udryddelse tumoren [13], studere disse sekundære systemiske virkninger af RF ablation i normalt organvæv er bydende nødvendigt . Behovet for yderligere undersøgelse understøttes af nyere eksperimenterende undersøgelser demonstrerer, “off-target” stimulering af fjernt tumorvækst efter termisk ablation af lever og nyre væv, og kliniske undersøgelser, der tyder en højere forekomst af ny HCC efter hepatisk RF ablation (nærmer 80 % på 5 år) i forhold til sammenlignelige un-behandlet cirrotiske patienter (22-50%) [26-29]. Her, vi bygger på vores tidligere erfaring med at bruge nanopartikel-medieret lægemiddeladministration fortrinsvis målrettet mod periablational rand at undersøge, om polymere micelle-lignende nanopartikler (MNP’er) lastet med anti-IL6 siRNA kan anvendes til at undertrykke termisk ablation-induceret IL-6-produktion IL-6-medieret periablational celleinfiltration, hepatocytproliferation i ubehandlet leveren, og IL-6-medieret nedstrøms RF ablation-induceret stimulering af fjernt tumorvækst.

Materialer og metoder Salg

Ethics erklæring

Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse af Beth Israel Deaconess Medical center Institutional Animal Care og brug Udvalg og Hadassah Hebrew University Medical School Institutional Animal Care etiske komité.

Dyremodeller

for alle eksperimenter og procedurer blev anæstesi induceret med IP injektion af en blanding af ketamin (50 mg /kg, Ketaject, Phoenix Pharmaceutical, St. Joseph, MO) og xylazin (5 mg /kg, Bayer, Shawnee Mission, KS). Dyr blev aflivet med en overdosis af carbondioxid ved hjælp SMARTBOX CO

2 Chamber System (EZ systemer, Palmer, PA) efterfulgt af hjertepunktur.

Eksperimenter blev udført i normale C57BI-mus (40 ± 10 g), eller to bryst adenocarcinom cellelinier (R3230 eller MATBIII) implanteres subkutant i kvindelige Fisher 344 rotter (150 ± 20 g; 14-16 uger gamle, Charles River, Wilmington, MA) [30]. Den R3230 bryst adenocarcinom tumor linje er en velkarakteriseret linje, vi har brugt i over 10 år [30]. Den MATBIII tumor linje blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Tumorimplantation, evaluering og forberedelse teknikker blev udført som tidligere beskrevet [30]. Kort beskrevet blev en tumor implanteret i hvert dyr ved langsomt at injicere 0,3-0,4 ml af tumor suspension i brystfedtpuden af ​​hvert dyr via en 18-gauge nål. Tumorer blev målt hver 1-2d indtil de nåede 6-7 mm på hvilket tidspunkt de blev medtaget i undersøgelser.

Anvendelse af RF ablation

Konventionel monopolære RFA blev påført ved hjælp af en 500-kHz RFA generator (model 3E, Radionics, Burlington, MA), som tidligere beskrevet [30]. Kort fortalt blev målorganet eksponeres via laparotomi ved hjælp af en subcostal (lever) eller lateral (nyre) snit under sterile forhold, mens dyret er bedøvet. Den 1-cm spidsen af ​​en 21-gauge elektrisk isoleret elektrode (SMK elektrode; Cosman Medical Inc, Burlington, MA) blev anbragt i lever eller nyre. For dyr behandlet med termisk ablation, blev RF-energi påført i 5 minutter med generator output titreret til at opretholde en udpeget spids temperatur (70 ± 2 ° C). Denne standardiserede metode til RF ansøgning er tidligere påvist at tilvejebringe reproducerbare koagulationsfaktorer volumener med brug af denne konventionelle RFA-system [30,31]. For at fuldende RF kredsløb blev dyret anbragt på en standardiseret metallisk grundstødning pude (Radionics). For dyr behandlet med enten fingeret eller en agent alene, blev elektroden placeres, men ingen energi blev administreret.

Nanopartikel siRNA formulering

Alle materialer blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), medmindre andet er angivet. Forgrenet polyethylenimin (PEI) med en molekylvægt på 1,8 kDa blev anskaffet fra Polysciences, Inc (Warrington, PA). 1,2-disrearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N- [methoxy (polyethylenglycol) -2000] (PEG-PE 2 kDa) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N- (glutaryl ) (glutaryl-PE) blev købt hos Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Nuklease-frit vand blev indkøbt fra Qiagen (Germantown, MD). Alle siRNA-duplexer er fra Dharmacon (Lafayette, CO). De syntetiserede sekvenser af siRNA rettet mod IL-6 var: 5′-AGUCGGAGGCUUAAUUACAdTdT-3 ‘(sense), 5′-CAGGAAAUUUGCCUAUUGAdTdT-3′ (sense) og 5’-UAAGGACCAAGACCAUCCAdTdT-3 ‘(sense) [32,33]. En scramble siRNA blev anvendt som negativ kontrol. Sekvensen af ​​ikke-targeting kontrol siRNA var 5’-AGUACUGCUUACGAUACGGdTdT-3 ‘(sense) [34].

micelle-lignende nanopartikler blev udvalgt som tilførselsvehiklen baseres på forudgående arbejde demonstrerer fordelagtige tidsmæssige levering kinetik (6 -12hr) og større interstitiel penetration i væv, der omgiver ablationszonen [35]. Vi konstruerede micelle-lignende nanopartikler (MNP’er) baseret på phospholipid modificeret-polyethylenimin konjugater (DOPE-PEI). DOPE-PEI-konjugat og DOPE-PEI /siRNA-komplekser blev fremstillet som tidligere beskrevet [34]. Vi har tidligere vist, at DOPE-PEI konjugater baseret på lavmolekylær PEI selv-samlet inden micellære strukturer, kondenseret siRNA, viste høj transfektionseffektivitet og havde en bedre toksicitetsprofil end PEI 25 kDa og Lipofectamin (almindeligt anvendt DNA /siRNA transfektionsreagenser) [11]. Vi indarbejdet PEG-PE i luftfartsselskaberne til at opnå en forbedret ydeevne

in vivo

. De hydrofobe interaktioner mellem lipiddele i DOPE-PEI og dem i PEG-PE resulterede i deres selv-samling til micelle-lignende partikler med en middelstørrelse på 150 nm og give nogle sterisk stabilisering af komplekser ved at danne en beskyttende barriere og fremme af øget stabilitet

in vivo

. De DOPE-PEI /siRNA komplekser blev fremstillet ved at blande lige volumener af DOPE-PEI med siRNA-IL-6 (ækvimolær pulje af 3 sekvenser) eller scramble siRNA til en endelig N /P-forhold på 16. siRNA opløsning blev overført til polymeropløsning, blandet ved kraftig pipettering og inkuberes i 15 min. Polymer /siRNA-forholdet blev udtrykt som kvælstof /phosphat (N /P) forhold, og beregnet under antagelse at 43 g /mol svarer til hver gentagelsesenhed af PEI indeholdende et amin og 316 g /mol svarer til hver gentagelsesenhed af siRNA indeholdende en phosphat. Derefter blev en tidligere frysetørret lipidfilm af PEG-PE hydreret med komplekserne og fik lov at henstå ved stuetemperatur i 1 time med intermitterende rystning PEG-PE2kDa: DOPE-PEI vægtforhold var 2: 1 [36]. Tomme formuleringer blev fremstillet ved hydratisering af filmen med kun polymeropløsningen. Hver mus fik en dosis på 3,5 ug siRNA i en endelig udformning volumen på 100 pi. Hver rotte modtog en dosis på 20 ug siRNA i en endelig udformning volumen på 200 pi. Hver dosis blev administreret ved intraperitoneal injektion (IP) på udvalgte tidspunkter som angivet ovenfor.

Tumor høst

Dyr blev aflivet på angivne tidspunkter ovenfor under anvendelse af carbondioxid eutanasi skitseret. Den målvæv (primære sted for ablation, ubehandlet leverlap, eller fjernt tumor) blev høstet, og gennemskåret vinkelret på retningen af ​​elektroden insertion [17,30]. Distant tumorer blev også høstet og snit. Alle prøver blev fikseret i 10% formalin natten over ved 4 ° C, indlejret i paraffin, og snit med en tykkelse på 5 um. Væv blev farvet med H . E for grov patologi

Kvantificering af IL-6 og VEGF niveauer

Serum og væv niveauer af IL-6 (Mouse /M6000B og Rat /R6000B Quantikine kit, R p = 0,04 vs. RFA alene, p = 0,46 vs. sham). Nedsat RFA /MNP scrambled siRNA øget lokal væv IL-6 niveauer (1924 ± 141pg /ml; p 0,001 vs. humbug, p = 0,01 vs. RFA alene, p = 0,001 vs. RFA /anti-IL6 siRNA). Tissue IL-6-niveauer efter MNP anti-IL6 siRNA med sham behandling var 1,110 ± 42pg /ml, og efter RFA /tom bærer var 1783 ± 125pg /ml.

(A) Lever ELISA kvantificering af IL-6 niveauer 12-timers efter behandling (gennemsnit ± standardafvigelse). C57BI mus blev randomiseret til at modtage simuleret behandling, lever RF ablation, lever RFA /IP MNP anti-IL6 siRNA, MNP anti-IL6 siRNA alene, RFA /MNP scrambled siRNA, eller RFA /tom luftfartsselskab (n = 5-6 pr gruppe) . Lever RFA øgede lokale 12h lever IL-6-niveauer (1.463 ± 108 pg /ml), der blev undertrykt med adjuvans IP MNP anti-IL6 siRNA (1.139 ± 159 pg /ml, p = 0,04). Derudover adjuverende MNP anti-IL6 siRNA givet 15 minutter efter hepatisk termisk ablation (D, E) i C57BI mus undertrykt periablational infiltration af α-SMA positive myofibroblaster forhold til hepatisk termisk ablation alene (B) eller RFA kombineret med røræg siRNA (C) (F, gennemsnit ± standardafvigelsen, s 0,01)

som tidligere rapporteret [23], standardiseret RF termisk ablation af normal lever resulterede i infiltration af periablational kant ved α-SMA-positive aktiveret. myofibroblaster (også kendt som hepatiske stjerneformige celler, en surrogatmarkør for komplekset periablational cellulær infiltration, der forekommer efter termisk ablation) ved 4 dage efter behandling (60,1 ± 26,3% positive celler /HPF inden fælgen, fig 1B-1E). Adjuverende MNP anti-IL6 siRNA væsentligt reduceret α-SMA positive periablational cellulær infiltration i forhold til andre behandlingsmuligheder arme (31,7 ± 14,3% positive celler /HPF vs. RF alene: 60,1 ± 26,3%; RF /krypteret siRNA: 72,9 ± 33,0%; p 0,001). blev ikke observeret nogen forskel i hepatocytproliferation i en fjern, ubehandlet lever lap for RFA /MNP scrambled siRNA (28,1 ± 16,7% /HPF) i forhold til RF ablation alene (p = 0,12) eller RFA /MNP anti-IL6 siRNA (p = 0,15 ) [figur 2A-2D].

Adjuverende MNP anti-IL6 siRNA givet 15 minutter efter hepatisk termisk ablation (C) i C57BI mus (n = 5-6 dyr /arm) undertrykt hepatocytproliferation i det fjerne, ubehandlet lever lap (med CDC47 farvning, gennemsnit ± standardafvigelse) i forhold til nedsat termisk ablation alene (A, D, s 0,01). Hepatisk termisk ablation kombineret med MNP scrambled siRNA ikke var signifikant forskellig fra enten termisk ablation alene eller ablation kombineret med MNP anti-IL6 siRNA (B, D).

Nanopartikel anti-IL6 siRNA undertrykker termisk ablation- induceret stimulering af fjerne R3230 tumorvækst og serum IL-6 niveauer efter RF ablation af normal leverparenchym

for at bestemme virkningen på fjernt tumorvækst at simulere den fælles tilstand fjernmetastaser, vi brugte en subkutan bryst tumor model (R3230), hvor hepatisk RF ablation har været forbundet med fjerne tumorvækst [26]. Her blev følgende behandlingsgrupper sammenlignet (n = 6-7 dyr /arm): hepatisk RF termisk ablation alene, fingeret procedure, RFA /MNP anti-IL6 siRNA (20 mcg af siRNA, IP levering), RFA /MNP scrambled siRNA , MNP anti-IL6 siRNA alene, RFA /tomt køretøj. Virkningen af ​​disse seks behandlingsgrupper på fjerne subkutan tumorvækst blev vurderet. Alle tumorer voksede med samme hastighed over 5d før randomisering til forskellige behandlingsarme. Termisk ablation af normal lever øget fjernt R3230 tumorvækst til 7d efter behandling sammenlignet med sham /kontrolbehandling (p 0,001, Fig 3A, tabel 1). Adjuvans MNP anti-IL6 siRNA undertrykt de termiske ablation-inducerede virkninger på fjernt R3230 tumorvækst, således at den gennemsnitlige tumorstørrelse hos 7d med kombinationsbehandling var lavere end enten sham (ikke-ablation) og hepatiske RFA alene grupperne (p = 0,02 vs. . sham, s 0,001 vs. hepatisk RFA alene, fig 3A, tabel 1). Nedsat RF ablation kombineret med MNP scrambled siRNA resulterede i den største fjernt tumor diameter på 7d forhold til alle andre behandlingsarme (19,3 ± 1,7 mm, p 0,03 for alle sammenligninger).

(A) Subkutan R3230 tumorer implanteret i Fisher 344 rotter med lignende vækstrater blev randomiseret på dag 0 til én af seks forskellige behandlingsarme (n = 6-7 dyr /arm). Hepatisk termisk ablation alene eller kombineret med enten tomme bærer eller MNP krypteret siRNA resulterede i signifikant større tumorvækst og ændringen i diameter (5d før-7d efter behandling) sammenlignet med sham behandling (p 0,01 for alle sammenligninger, gennemsnit ± standardafvigelse for alle tal præsenteret). Adjuverende MNP anti-IL6 siRNA kombineret med termisk ablation resulterede i fjernt tumor vækst og ende diameter, der var den laveste af alle behandlingsgrupper arme (p 0,01 for alle sammenligninger). (B) Adjuvans MNP anti-IL6 siRNA kombineret med hepatisk termisk ablation også reduceret fjernt tumor proliferation (Ki-67) til sham niveau sammenlignet med hepatisk termisk ablation alene eller kombineret med tom bærer eller MNP scrambled siRNA (p 0,01 for relevante sammenligninger) . (C) Nedsat termisk ablation alene eller med MNP scrambled siRNA øget serum IL-6 niveauer på 6 timer i forhold til simuleret procedure (n = 3-4 dyr /arm, p 0,02). Denne virkning blev undertrykt med adjuvans MNP anti-IL6 siRNA (p = 0,03 vs. RF lever alene). Sammenligning (D) af virkningen af ​​siRNA administration timing viste, at adjuvans MNP anti-IL6 siRNA administreret på dag 0 resulterede i den laveste post-behandling tumorvæksthastighed og endpoint diameter (n = 3-4 dyr /arm, p 0,05 for alle sammenligninger). Adjuverende MNP anti-IL6 siRNA administreret 3d post-ablation reducerede endpoint diameter sammenlignet med hepatisk ablation alene, men var stadig betydeligt større, at enten sham eller kombineret-Dag 0 behandling (p 0,05 for alle sammenligninger)

.

tumor proliferativ indeks (Ki-67) i det fjerne R3230 subkutane tumor blev målt for alle behandlingsgrupper arme [fig 3B, tabel 1]. Hepatisk termisk ablation øget fjernt tumorproliferation ved 7d sammenlignet med sham procedure (p = 0,001). Kombination adjuvans MNP anti-IL6 siRNA og hepatisk termisk ablation signifikant reduceret fjernt tumor proliferation (p = 0,045 vs. sham, s 0,001 vs. hepatisk RFA alene). Termisk ablation kombineret med enten tomme bærer eller MNP scrambled siRNA resulterede i øget fjernt tumor prolilferation (p 0,04 sammenlignet med sham behandling). Der var ingen forskel mellem simuleret behandling og MNP anti-IL6 siRNA alene arme (p = 0,59).

Dernæst serum IL-6-niveauer blev kvantificeret ved ELISA ved 6 timer efter behandling for hver af de seks arme (n = 3-4 dyr /arm) for at bestemme virkningen af ​​adjuvans MNP anti-IL6 siRNA på ablation-fremkaldt systemisk IL-6-niveauer. Dette tidspunkt blev valgt som serum IL-6-niveauer toppede på 6 timer i denne model efter hepatisk RFA. Serum IL-6-niveauer blev forøget efter termisk hepatisk ablation (266 ± 9PG /ml) sammenlignet med sham behandling (199 ± 18pg /ml, p = 0,005) [Fig 3C]. Tilsætningen af ​​MNP anti-IL6 siRNA reduceret serum IL6 niveauer 6 timer (229 ± 16pg /ml) sammenlignet med RFA alene (p = 0,03) eller RFA /MNP scrambled siRNA (298 ± 18pg /ml, p = 0,02). RFA /tom bærer også øget serum IL6 niveauer 6hrs ligner RFA alene (298 ± 18pg /ml, p = 0,57).

Endelig timingen af ​​siRNA administration blev sammenlignet, og MNP anti-IL6 siRNA indgives straks efter hepatisk RFA (dag 0) resulterede i fuldstændig undertrykkelse af RFA-induceret tumorvækst sammenlignet med administration på et senere tidspunkt (3d) efter hepatisk RFA (dag 0 vs. Day 3, s 0,02) [fig 3D, tabel 1] . Tilsvarende for leverens RFA /nano anti-IL6 siRNA på dag 0, tumor proliferative indeks på 7d var signifikant lavere i forhold til Dag 3 administration (p = 0,001).

Nanopartikel anti-IL6 siRNA undertrykker hepatisk ablation -induceret fjernt tumorvækst gennem reduktion i VEGF-medieret tumor angiogenese

Periablational levervæv niveauer af VEGF blev forøget efter termisk ablation, toppede på 72 timer. Her blev væv VEGF-niveauer i periablational rand sammenlignet ved anvendelse af ELISA på 72 timer efter behandling for følgende våben: hepatisk RF termisk ablation alene, sham procedure, RFA /MNP anti-IL6 siRNA (20 g siRNA, IP levering), RFA /MNP scrambled siRNA, MNP anti-IL6 siRNA alene, RFA /tomme køretøj (n = 3-4 dyr /arm). Nedsat ablation øget periablational væv VEGF niveauer sammenlignet med sham behandling på 72 timer (2359 ± 233pg /ml vs. 1429 ± 83pg /ml, p = 0,002) [Figur 4A]. Adjuverende MNP anti-IL6 siRNA nedsat lever- VEGF niveauer efter termisk ablation (1799 ± 71pg /ml, p = 0,02 vs. ablation). Hepatisk ablation kombineret med adjuvans scrambled siRNA førte til lignende liver VEGF-niveauer sammenlignet med RFA alene (2229 ± 42pg /ml; vs. RFA alene: p = 0,51; vs. sham: p = 0,001). Ingen forskel blev observeret for termisk ablation kombineret med den tomme bærer sammenlignet med andre behandlingsarme (1804 ± 370pg /ml; vs. RFA alene: p = 0,09; vs. sham: p = 0,16). MNP anti-IL6 siRNA alene havde større liver tissue VEGF-niveauer sammenlignet med sham (2234 ± 195pg /ml, p = 0,002).

(A) vævsniveauer af VEGF (Y-aksen

2, mørk grå søjler) i periablational væv, der omgiver ablationszonen blev kvantificeret ved 72 timer efter forskellige behandlinger (middelværdi ± standardafvigelse, n = 3-4 dyr /arm). Hepatisk termisk ablation øget periablational VEGF-niveauer, som derefter blev undertrykt med adjuvans MNP anti-IL6 siRNA (p 0,05 for alle sammenligninger). (BE) Tilsvarende nedsat termisk ablation ført til øget mikrovaskulære tæthed /angiogenese (immunhistokemi for CD34, A: Y-aksen

1, lysegrå søjler) i fjernt subkutane R3230 tumor der også blev undertrykt med adjuvans anti-IL6 siRNA ( n = 6-7 dyr /arm).

mikrovaskulære densitet (ved hjælp CD34-farvning) blev derefter sammenlignet i fjerne subkutane tumorer for hver af de seks behandlingsgrupper på 7d efterbehandling [fig 4B-4E , tabel 1]. Hepatisk termisk ablation øget fjernt tumor mikrovaskulær densitet ved 7d sammenlignet med sham procedure (p = 0,003). Kombination adjuvans MNP anti-IL6 siRNA og hepatisk termisk ablation signifikant reduceret fjernt tumor mikrovaskulær densitet (p = 0,01 vs. hepatisk RFA alene). Termisk ablation kombineret med enten tomme bærer eller scrambled siRNA resulterede i øget fjernt tumor mikrovaskulære densitet (p 0,003 sammenlignet med sham behandling). Der var ingen forskel mellem fingeret behandling og MNP anti-IL6 siRNA alene arme (p = 0,46). Disse resultater antyder, at blokering af hepatisk ablation-induceret fjernt tumorvækst ved adjuvans anti-IL6 siRNA medieres af suppression af nedstrøms VEGF-produktion og fjernt tumor angiogenese.

Nanopartikel anti-IL6 siRNA undertrykker fjernt tumorvækst efter RF-ablation i en anden primære organ websted (normal nyre)

for tumor vækst undersøgelser, nyre RF termisk ablation alene, fingeret procedure, RFA /MNP anti-IL6 siRNA (20 g siRNA, IP levering), og MNP anti- IL6 siRNA alene blev sammenlignet (n = 6-7 dyr /arm). Tilsvarende RF ablation af normalt nyre øget fjernt R3230 tumorvækst sammenlignet med sham behandling, der også blev undertrykt med enkeltdosis adjuvans MNP anti-IL6 siRNA (givet på dag 0) [Fig 5A, tabel 1]. Tumor proliferative indeks og mikrovaskulære tætheden for kombination nanopartikel anti-IL6 og sham arme var ækvivalente med hinanden og lavere i forhold til gruppen behandlet med RF ablation af normalt nyre alene [Fig 5B, tabel 1].

(A ) Subkutan R3230 tumorer implanteret i Fisher 344 rotter med lignende vækstrater blev randomiseret på dag 0 til en af ​​fire forskellige behandlingsmuligheder arme (n = 6-7 dyr /arm). Termisk ablation af normal nyre alene resulterede i signifikant større tumor vækst og forandring i diameter (5d før 7d efter behandling) sammenlignet med sham behandling eller MNP anti-IL6 siRNA alene (p 0,01 for alle sammenligninger, gennemsnit ± standardafvigelse for alle data ). MNP anti-IL6 siRNA kombineret med termisk ablation reducerede fjernt tumor vækst og endpoint diameter til baseline fingeret niveauer.