PLoS ONE: GSK-3α er en ny Target af CREB og CREB-GSK-3α Signaling Deltager i celle levedygtighed i lungekræft

Abstrakt

Overekspression eller aktivering af cyklisk AMP-respons element-bindende protein (CREB) har været kendt for at være involveret i flere humane maligniteter, herunder lungekræft. Gener, der reguleres af CREB er blevet rapporteret at undertrykke apoptose, inducerer celleproliferation, inflammation og tumormetastaser. Men de kritiske målgener af CREB i lungekræft er ikke blevet godt forstået. Her, der er konstateret vi GSK-3α som en af ​​CREB målgener, som er kritisk for levedygtigheden af ​​lungecancerceller. Den CREB knockdown væsentligt reduceret ekspression af GSK-3α og den direkte binding af CREB på promotoren for

GSK3A

blev identificeret. Kaplan-Meier-analyse med en offentlig database viste en prognostisk betydning af afvigende GSK-3α ekspression i lungekræft. Inhibering af GSK-3α undertrykt cellelevedygtighed, kolonidannelse, og tumorvækst. For første gang har vi vist, at GSK-3α reguleres af CREB i lungekræft og er nødvendig til cellelevedygtigheden. Disse resultater implicerer CREB-GSK-3a-aksen som en ny terapeutisk mål for lungekræft behandling

Henvisning:. Park SA, Lee JW, Herbst RS, Koo JS (2016) GSK-3α er en ny Target af CREB og CREB-GSK-3α Signaling Deltager i celle levedygtighed i lungekræft. PLoS ONE 11 (4): e0153075. doi: 10,1371 /journal.pone.0153075

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, UNITED STATES

Modtaget: Februar 6, 2015; Accepteret: 23. marts 2016 Udgivet: April 6, 2016

Copyright: © 2016 Park et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute tilskud R01-CA126801 (til Ja Seok Koo) og Cancer center Support Grant CA-16359 (til Yale Cancer Centrum). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

transskription faktor cyklisk AMP-respons element-bindende protein (CREB) regulerer forskellige cellulære processer, som omfatter celledifferentiering, spredning, overlevelse, glukosemetabolismen, immune regulering, og synaptisk plasticitet er forbundet med hukommelse [1-7] . Tidligere viste vi, at CREB er kritisk for regulering af slimhinderne differentiering af normale menneskelige tracheobronchial epitelial (NHTBE) celler [8]. Desuden blev nedsat overlevelse varighed signifikant associeret med overekspression af CREB eller aktiveret CREB (p-CREB) hos ikke rygere med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [9] og knockdown af CREB undertrykker levedygtighed lungecancerceller [10]. Adskillige serin-threonin-kinaser kan aktivere CREB og p-CREB inducerer ekspressionen af ​​multiple cAMP responselementet-holdige gener, de som spiller vigtige roller i funktionen af ​​CREB. Der er rapporteret adskillige fremgangsmåder til identifikation af CREB målgener [11-14], men distinkte målgener af CREB i lungekræft forbliver stort set ukendt.

GSK-3, som har to isoformer af GSK-3α og GSK- 3β, er en serin /threoninproteinkinase, som er involveret i cellecyklus-progression, differentiering og apoptose. GSK-3 er konstitutivt aktiv i hvilende celler, og det phosphorylerer og hæmmer oncogen signalering såsom β-catenin /WNT pathway [15-21]. Selvom GSK-3 er blevet undersøgt som en tumorsuppressor [22-24], er der stigende tegn på, at GSK-3 spiller en onkogen rolle i forskellige humane cancere. De fleste undersøgelser har fokuseret på den rolle, som samlede GSK-3 eller GSK-3β [25-27], men nylige undersøgelser impliceret den onkogene rolle af GSK-3α i akut myeloid leukæmi (AML) [28], prostatacancer [29], og pancreascancer [30]. Interessant nok har CREB overekspression eller dens øgede aktivitet blevet forbundet med progressionen af ​​disse humane cancere [31-36]. Især CREB fungerer som et proto-onkogen i AML [31, 37] og GSK-3α er også et kritisk mål for AML terapi [28]. For nylig er GSK-3α og GSK-3β blevet rapporteret at være nye kinase mål for tivantinib, som er en potent selektiv hæmmer af receptortyrosinkinase c-MET, i lungecancerceller. Tivantinib viste højere styrke for GSK-3α mere end for GSK-3β og hæmning af GSK-3α eller GSK-3β udtryk forårsagede apoptose i lungekræft celler [38].

Her har vi først identificeret, at GSK- 3α, ikke GSK-3β, reguleres af CREB i lunge kræftceller. Endvidere undersøgte vi, at der er en positiv korrelation mellem høj GSK-3α ekspression og kortere overlevelse af patienter med lungecancer. Knockdown af GSK-3α dæmper cellelevedygtighed, kolonidannelse, og tumorvækst. Sammen disse resultater implicerer, at GSK-3α er en kritisk target gen af ​​CREB og CREB-GSK-3α signalering er en potentiel terapeutisk mål for lungekræft.

Materialer og metoder

Cell kultur

human lunge cancercellelinier (H1993, H1437, H1734, og A549) blev opnået fra American Type Culture Collection. Lungecancerceller blev dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen), suppleret med 10% (volumen /volumen) varmeinaktiveret føtalt bovint /serum (FBS; Sigma-Aldrich), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin G natrium og 100 ug /ml streptomycinsulfat (Invitrogen). Normale humane tracheobronchial epitelceller (NHTBE) blev opnået fra Lonza Walkersville, Inc. og dyrket i BEGM

™ med flere kosttilskud. Alle celler er blevet passeret direkte fra originale lav passage lagre og blev anvendt før passage 30. Cellerne blev også testet inden for de sidste tre måneder til korrekt morfologi i mikroskop og at detektere forurening med mycoplasma under anvendelse af en MycoAlert mycoplasma detektion kit (Lonza Walkersville, Inc .). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2.

Antistoffer /Kemikalier

monoklonalt anti-β-actin-antistof (A2228) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. Kanin polyklonalt antistof mod GSK-3α (ab28833) blev købt fra Abcam. Forskolin (3828), anti-CREB (9197), anti-p-CREB (9198), anti-cyclin A2 (4656), anti-cyclin B1 (4138), anti-cyclin E2 (4132), og GSK-3β ( 12456) blev opnået fra Cell Signaling Technology. Kanin monoklonalt cyclin D1 antistof (2261-1) blev købt fra Epitomics

Knockdown /overekspression af gener

Lyddæmper CREB siRNA og GSK-3a siRNA’er blev købt fra Thermo videnskabelig eller Invitrogen.; CREB siRNA (109.994, Invitrogen), GSK-3α siRNA-1 (L-003009-00-0005, ON-TARGETplus SMARTpool, ThermoScientific), og GSK-3α siRNA-2 (145.366, Invitrogen). BLOCK-det Fluorescent Oligo (Invitrogen) blev anvendt som kontrol. Hver siRNA blev transficeret under anvendelse af lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen). Også blev celler inficeret med lentiviral shScrambled eller shRNAs målretning CREB eller GSK-3α med 8 ug /ml polybren og de inficerede celler blev selekteret med puromycin. Sekvenserne af shRNAs er anført i S1 tabel (tilgængelig online). For CREB overekspression blev H1437 og A549-celler transficeret med plasmid-DNA af pCMV-tomt eller pCMV-CREB (Clontech Laboratories, Inc.) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

cellelevedygtighed

Cell levedygtighed blev vurderet ved MTT-assayet. Efter celler blev transficeret med siRNA’er i 72 timer blev cellerne inkuberet med MTT (slutkoncentration 0,5 mg /ml) i 4 timer ved 37 ° C inkubator. Efter MTT inkubering blev 150 pi 100% DMSO tilsat for at opløse krystallerne. Levedygtige celler blev talt ved aflæsning af absorbansen ved 570 nm under anvendelse af en mikropladelæser SpectraMax (Molecular Devices).

kolonidannelse Assay

24 timer efter transfektion ved de angivne siRNA’er, 2 x 10

3 celler blev overført i plader med 6 brønde og lodes vokse i 7-14 dage. Mediet blev fjernet, fikseret med 10% formalin i 15 minutter, efterfulgt af farvning med krystalviolet til visualisering af kolonierne.

kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev oprenset fra celler under anvendelse af en RNeasy Mini Kit (Qiagen). Revers transkription af totalt RNA blev udført ved anvendelse af M-MLV revers transkriptase (Promega). Kvantitativ PCR (qPCR) blev udført under anvendelse

SYBR of Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems) og iCycler thermal cycler (Bio-Rad Laboratories). Primersekvenser er angivet i S1 tabel (tilgængelig online).

Western blot-analyse

Standard SDS-PAGE og Western blotting-procedurer blev anvendt til at analysere ekspressionen af ​​forskellige proteiner. Helcellelysater fra hver af de testede blev fremstillet under anvendelse af SDS lysepuffer lung cancercellelinier (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol og 0,02% bromphenolblåt) indeholdende proteaseinhibitorer og phosphatase. Alle proteiner blev visualiseret ved hjælp af en peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof og Amersham ECL

™ Western Blotting Detection Reagenser (GE Healthcare Life Sciences). Intensitet af individuelle bånd blev kvantificeret ved hjælp ImageJ densitometri software og udtrykt i forhold til actin signal, som et mål for protein relativ overflod i de forskellige prøver.

chromatin Immunfældning (chip)

SimpleChIP Enzymatisk kit (Cell Signaling) blev anvendt som beskrevet af producenten. PCR blev udført med primere specifikke for de angivne promotorområder og reaktionerne blev udført tre gange og 1% af det samlede input prøve blev anvendt som kontrol. Primer sekvenser er anført i S1 Table (tilgængelig online).

Immunfarvning

For immunfluorescens, påvisning af primære antistoffer blev udført ved hjælp af fluorescerende konjugater af Alexa Fluor

® 488-antistof (Invitrogen) sammen med forlænge

® Gold antifade Reagens med DAPI (Invitrogen). Før farvning af faste paraffinindlejrede væv, fulgte vi den standard protokol, som omfattede skridt såsom afparaffinering, antigen hentning, og permeabilisering.

flowcytometri

For cellecyklus flowcytometri, cellerne fikseret i 70% ethanol og farvet med propidium iodfarvning (BD Pharmingen) til DNA-indhold. Apoptose blev målt ved hjælp af FITC Annexin V Apoptose Detection Kit (BD Pharmingen) efter producentens anvisninger.

In Vivo

Studies

Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Yale University og var i overensstemmelse med de juridiske mandater og føderale retningslinjer for pasning og vedligeholdelse af forsøgsdyr (protokol #: 2012-11464). Kvinde J: NU nøgne mus blev opnået fra Jackson Laboratory og bruges, når 6-7 uger gamle. H1993-celler blev forbehandlet med 20 nM kontrol siRNA eller GSK-3α siRNA i 24 timer, efterfulgt af transplantation (2 x 10

6 celler /flanke, xenograft n = 7 /gruppe) i siden af ​​musene. Også blev H1993-shScrambled, H1993-shGSK3A # 2, eller H1993-shGSK3A # 4 celler podet på dorsale flanker (6 x 10

5 celler /flanke; shScrambled n = 9, shGSK3A # 2 n = 4, og shGSK3A # 4 n = 5). Alle xenotransplantater blev transplanteret i både højre og venstre dorsale flanker af mus. Tumor volumen blev målt med digital skydelærer og beregnet ved formlen 0,52 x længde x bredde

2. Mus blev aflivet ved afslutningen af ​​den undersøgelse, som er anbragt i en carbondioxid kammer.

Statistiske metoder Salg

Kvantificeringen resultaterne præsenteres som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Den statistiske signifikans af forskelle mellem grupperne blev bestemt ved Students

t

-test, med en

P Drømmeholdet værdi under 0,01 anses for at være statistisk signifikant. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at analysere univariat overlevelse, og sammenligninger af overlevelse distributioner blandt grupper blev udført ved hjælp af log-rank test.

Resultater

GSK-3α reguleres af CREB i lunge kræftceller

for at undersøge de kritiske CREB målgener i lungekræft, vi udførte qPCR-analyse ved hjælp af specifikke primere mod en delmængde af gener relateret til celle overlevelse, proliferation og levedygtighed i CREB knockdown celler. Vi fandt, at mRNA-niveauet af GSK-3α, ikke niveauet af GSK-3β, blev signifikant nedreguleret af CREB siRNA i alle lungekræft cellelinier vi testede (H1993, H1437, H1734, og A549) (fig 1A). Desuden blev proteinet ekspression af GSK-3α dramatisk undertrykt af CREB knockdown i alle fire lungekræft cellelinier vi testede (Fig 1B), men proteinniveauet af GSK-3β blev ikke ændret ved CREB knockdown (Fig 1C).

(A) Effekt af CREB knockdown på mRNA niveau af

GSK3A

,

GSK3b

, og

CREB

. Hver af de angivne celler blev transficeret med kontrol siRNA eller CREB siRNA (40 nM, hver) i 48 timer, efterfulgt af qPCR analyse. Alle værdier i graferne repræsenterer gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. Tosidet

t-

test. *,

P

0,01. (B-C) Effekt af CREB knockdown på proteinet niveauer af GSK-3α (B) og GSK-3β (C). Hver af de angivne celler blev transficeret med kontrol siRNA eller CREB siRNA (40 nM, hver) i 72 timer, efterfulgt af Western blot-analyse.

Vi bemærkede, at

GSK3A

promotor indeholdt adskillige formodede CREB bindingssteder som bestemt ved TFSEARCH (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (fig 2A). For at undersøge om CREB binder til det humane

GSK3A

promotor, udførte vi ChIP assay ved anvendelse immunopræcipitation af CREB-antistof og IgG som en negativ kontrol. Ikke kun primersæt A, som dækker CREB konsensus bindingssite (-39 til -53), men også tre andre primersæt (B: -459 til -476, C: -545 til -557, og D: -603 til – 616) viste binding af CREB på

GSK3A

promotor. Men ikke-specifikke regioner (NS-1, NS-2, og NS-3) af promotoren ikke nogen binding af CREB (Fig 2B). Derudover knockdown af CREB markant undertrykt associering af CREB med

GSK3A

promotoren (fig 2C). I overensstemmelse med tidligere data, som viste CREB knockdown undertrykt ekspression af GSK-3α, overekspression af CREB kraftigt induceret GSK-3α ekspression på proteinniveauet efter transient eller stabil overekspression af CREB (Fig 2D). Faktisk blev udtrykkene for p-CREB og GSK-3α steg med forskolin, som aktiverer enzymet adenylylcyclase og øger intracellulære niveauer af cyklisk AMP (fig 2E). Tilsammen foreslår vi, at CREB er en potentiel opstrøms regulator af GSK-3α i lunge kræftceller.

(A) Skematisk diagram, der viser positionerne for CREB bindende elementer placeret i genet promoter af menneskelig

GSK3A Hotel (TFSEARCH). AD: de specifikke regioner for primere, der dækker CREB bindende elementer, A: -39 til -53, B: -459 til -476, C: -545 til -557, D: -603 til -616, NS-1, – 2, og -3: regionerne for primere som omfatter ikke-specifikke bindende elementer NS-1: -126 til -230, NS-2: -183 til -378, og NS-3: -1214 til -1356. Primersekvenser er i S1 tabel (tilgængelig online). (B) direkte binding af CREB på

GSK3A

promotor. En chip assay blev udført med kromatin fremstillet af H1993 og H1734 celler. Bindingen af ​​CREB til

GSK3A

promotor blev påvist ved visualisering af PCR-produktet. De enkelte bands opdaget i input prøver indikerer specificiteten af ​​PCR primere. (C) Direkte binding af CREB på

GSK3A

promotor i CREB-knockdown celler. Proteinet niveau af CREB i hver stabil cellelinie blev bekræftet ved Western blot analyse. (D) Effekt af CREB overekspression på ekspressionen af ​​GSK-3α. H1437-celler blev transficeret med den samme mængde pCMV-tomt eller pCMV-CREB ekspressionsvektor og ekspression af CREB, p-CREB, og GSK-3α blev undersøgt ved Western blot-analyse (til venstre). A549-kontrol (A549-ctrl) eller A549-CREB-celler blev transficeret med pCMV-vektorer og vælges af puromycin (1 ug /ml). Virkningen af ​​CREB på ekspressionen af ​​GSK-3α blev også bekræftet (højre). (E) Effekt af forskolin på induktionen af ​​niveauet af p-CREB og GSK-3α. A549 og H1437-celler blev behandlet med forskolin (10 pM, 30 minutter), og ekspression af hvert protein blev undersøgt ved Western blot-analyse.

GSK-3α er en dårlig prognose faktor i lungekræft

der er beviser for, at GSK-3β er overudtrykt i lungekræft. Den overekspression af GSK-3β fungerer som en uafhængig markør for dårlig prognose for NSCLC og dets hæmning undertrykker celleproliferation i NSCLC celler [39]. Men rollen som GSK-3α i lungekræft stadig brug for mere undersøgelse. Her fandt vi, at GSK-3α overudtrykkes i multiple lungekræft cellelinier sammenlignet med NHTBE celler (Fig 3A).

(A) Protein niveauer af GSK-3α, p-CREB, og CREB i flere lunge cancercellelinjer sammenlignet med NHTBE celler. (BD) Kaplan-Meier analyse af den samlede overlevelse ved lav eller høj

GSK3A

(

GSK3A

sonde sæt 202210_x_at) udtryk i (B) 1760 lungekræftpatienter, (C) 487 lungeadenokarcinom patienter og (D) 422 lunge pladecellecarcinom med adjuverende behandling. Samlet overlevelse analyse af patienterne blev udført ved hjælp af Cox proportional hazard modeller og opfølgende data for den angivne periode.

For yderligere at vurdere, om vores fund af

GSK3A

overekspression er relevant til human lungecancer, brugte vi offentligt tilgængelige Kaplan-Meier plotter (https://kmplot.com/analysis), der er består af 1760 lungecancerpatienter, der modtager kemo /strålebehandling baseret på databaser (CARRAY: n = 504; GSE14814 : n = 90; GSE19188: n = 156; GSE29013: n = 55; GSE31210: n = 246; GSE3141: n = 111; GSE37745: n = 196; GSE4573: n = 131; GSE8894: n = 138, og TCGA: n = 133). For at afgøre om

GSK3A

mRNA (202210_x_at) overflod i tumorer var forbundet med total overlevelse, vi udført på samlet overlevelse analyse af de patienter, der bruger Cox proportional hazard modeller og opfølgende data for 200 måneder efter operationen. Overekspression af

GSK3A

mRNA niveauer blev forbundet med dårlig samlet overlevelse af patienter med lungecancer (harzard ratio (HR) = 1,42, logrank P = 4.9e-06) (fig 3B). Interessant,

GSK3A

mRNA niveauer blev mere stærkt forbundet med dårlig samlet overlevelse af patienter med lungecancer med adenocarcinom (HR = 1,99, logrank P = 2.4e-06) (fig 3C). Imidlertid positiv

GSK3A

ekspression blev ikke signifikant korreleret med kortere overlevelsestid af patienter med pladecellecarcinom histologi typen (fig 3D). Vi fandt også, at overekspression af

CREB

mRNA niveau blev forbundet med dårlig samlet overlevelse af patienter med lungecancer med meget lignende mønster for

GSK3A

mRNA (S2 Fig). Vores resultater på kliniske tumorprøver viser, at afvigende aktivering af GSK-3α er forbundet med menneskelige dødelighed af lungekræftpatienter, især med lunge adenocarcinom.

Hæmning af GSK-3α undertrykker levedygtigheden af ​​lungekræft celler

for at bestemme virkningen af ​​GSK-3α, som er et CREB målgen, bekræftede vi effekten af ​​CREB knockdown på cellelevedygtigheden i multiple lungekræft cellelinier. I overensstemmelse med vores tidligere rapporter [10], CREB hæmning undertrykt levedygtigheden af ​​lungekræft celler (Fig 4A). Dernæst knockdown af GSK-3α med dets specifikke siRNA resulterede i et fald i levedygtighed alle lungekræft cellelinier vi testede (Fig 4B). Desuden knockdown af GSK-3α førte til reduceret kolonidannelse af cellerne (Fig 4C). Følgelig GSK-3α knockdown undertrykte signifikant cellelevedygtigheden af ​​KRAS-WT lungekræft cellelinier (H1993 og H1437), sammenlignet med KRAS-mutant lungekræft cellelinier (H1734 og A549). Vi undersøgte yderligere virkningen af ​​GSK-3α knockdown på celledød under anvendelse af FACS-analyse. Som vist i figur 4D, cellerne, som udtrykte shGSK3A viste forøget celledød i forhold til hver kontrol-cellelinie. Validering af siRNA’er eller shRNAs på ekspressionen af ​​GSK-3α blev udført ved qPCR eller western blot-analyse i multiple lungecancer-cellelinjer (S1 Fig). Disse resultater antyder, at GSK-3α positivt regulerer levedygtigheden af ​​lungecancerceller.

(A) Effekt af CREB knockdown på cellelevedygtigheden. Lung cancer cellelinjer (H1993, H1437, H1734, og A549) blev kortvarigt transficeret med kontrol siRNA (50 nM) eller CREB siRNA (10, 50 nM) i 72 timer, efterfulgt af MTT-analysen. Alle værdier i graferne repræsenterer gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. Tosidet

t

-test. *,

P

0,01. (B) Virkning af GSK-3α knockdown på cellelevedygtigheden. Cellerne blev transient transficeret med kontrol siRNA, eller GSK-3α siRNA (40 nM, hver) i 72 timer, og kvantitative data blev efterfulgt af MTT-assayet. Alle værdier i graferne repræsenterer gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. Tosidet

t-

test. *,

P

0,01. (C) Effekt af GSK-3α knockdown på kolonidannelse. En dag efter transfektion af kontrol siRNA (40 nM) eller GSK-3α siRNA (10, 40 nM), blev cellerne podet igen i 6-brønde med lav densitet (2 x 10

3 /brønd) og inkuberet i 7-14 dage. Middelværdi ± standardafvigelse i tre uafhængige forsøg. Tosidet

t-

test. *,

P

0,01. (D) Virkning af GSK-3α knockdown på celledød. H1734 og H1993 celler blev inficeret med lentiviral udtrykker shRNA rettet mod GSK-3α (to sekvenser, shGSK3A # 2 og shGSK3A # 4) med 8 ug /m polybren. Efter 48 timer infektion blev cellerne udvalgt med 0,5 ug /ml puromycin i 3 dage. De udvalgte celler blev udført ved farvning af annexin V og PI analyse apoptotisk celledød ved LSRII.

CREB-GSK-3α signalering er kritisk for regulering af cycliner

For at få indsigt i den rolle af GSK-3α i lungekræft cellelevedygtighed, vi først undersøgt, om GSK-3α regulerer cellecyklus anvendelse af FACS-analyse. Interessant, GSK-3α knockdown undertrykt S-fasen af ​​cellens cyklus, hvilket kan bidrage til den nedsatte cellelevedygtighed af lungecancerceller (Fig 5A). Som vist i fig 5B blev proteinet ekspression af adskillige cykliner herunder cyclin A2, cyclin B1, cyclin D1, og cyclin E2 markant undertrykt af GSK-3α knockdown i lungekræft cellelinier. Desuden er disse resultater var konsistente med tidligere rapporter, at CREB kan regulere ekspressionen af ​​cykliner [12, 31, 40, 41]. Samlet set viser disse resultater antydede, at GSK-3α kan fungere positivt i levedygtigheden af ​​lungecancerceller ved at regulere ekspressionen af ​​cycliner.

(A) Virkning af GSK-3α knockdown på cellecyklussen. Angivne celler blev udsultet i serumfrit RPMI-medium i 24 timer og genopfyldes med RPMI suppleret med 10% FBS i yderligere 24 timer. Høstede celler blev farvet med PI analyse cellecyklus ved LSRII. (B) Effekt af GSK-3α knockdown på gen udtryk relateret til cellernes levedygtighed eller cellecyklus inklusive cyclin A2, cyklin B1, cyklin D1, og cyclin E2. Lungekræft celler blev transient transficeret med kontrol siRNA, eller GSK-3α siRNA (40 nM, hver) i 48 timer og blev efterfulgt af western blot analyse.

GSK-3α er kritisk for tumorvæksten

Vi næste rettet rollen GSK-3α i tumorvækst

in vivo

hjælp subkutane injektioner af kontrol eller GSK-3α-forarmet celler. Væksten af ​​tumorer blev monitoreret over fem uger efter at cellerne blev eksplanteret i nøgne mus. Repræsentative fotografier af mus ved udgangen af ​​fem uger viste, at udviklingen af ​​tumorer afledt af GSK-3α-depleterede celler blev markant undertrykt sammenlignet med tumorer afledt fra kontrolceller (fig 6A). I overensstemmelse med vores hypotese og data, GSK-3α knockdown resulterede i en signifikant undertrykkelse i tumorvækst og tumor volumen (Fig 6B). Vi bekræftede virkningen af ​​GSK-3α udtømning på ekspressionen af ​​GSK-3α eller cyclin B1 i væv afledt fra xenotransplantater (S5 Fig). Gentagne gange, bemærkede vi, at den fuldstændige sletning af

GSK3A

i cellerne kunne ikke udvikler tumorer i nøgne mus (Fig 6C og 6D). Samlet set har disse data viser tydeligt, at de reducerede niveauer af GSK-3α forringe lungekræft tumorvækst

in vivo

.

(A) Repræsentative billeder af xenografter afledt af kontrol siRNA eller GSK-3α siRNA -behandlede H1993 celler. Efter 24 timer siRNA transfektion (20 nM, hver) blev cellerne inokuleret subkutant i højre og venstre side dorsale flanker af nøgne hunmus (xenograft n = 7 /gruppe). (B) Tumorvolumen af ​​xenotransplantater afledt fra kontrol eller GSK-3α-deficiente H1993-celler blev evalueret ved hvert tidspunkt som angivet. Tumor volumen blev målt med digital skydelærer og beregnet ved formlen 0,52 x længde x bredde

2. Tosidet

t

-test. *,

P

0,01. (C) Repræsentative billeder af xenografter afledt af H1993-shScrambled, shGSK3A # 2, eller shGSK3A # 4 celler. Cellerne blev podet subkutant i dorsale flankerne af nøgne mus (venstre: shScrambled celler, højre: shGSK3A celler) og tumor volumen blev målt over de angivne tidspunkter (shScrambled n = 9, shGSK3A # 2 n = 4, og shGSK3A # 4 n = 5). Tosidet

t

-test. *,

P

0,05

Diskussion

I denne undersøgelse har vi først identificeret GSK-3α som en ny mål for CREB i lunge kræftceller.. Vores undersøgelse afslører onkogene roller GSK-3α som CREB målgen og som en ny prognostisk biomarkør i lungekræft. GSK-3α har vist sig at være et terapeutisk mål i multiple humane cancere herunder AML, pancreascancer, og prostatacancer. Men stadig stort set forbliver ukendt, hvilken rolle af GSK-3α i lungekræft. Her vores resultater viser, at nedsat mængde GSK-3α forringer levedygtigheden af ​​lungekræft celler

in vitro

og

in vivo

. GSK-3α overudtrykkes i multiple lungekræft cellelinjer og lunge tumorvæv. Desuden blev det uregelmæssige overekspression af GSK-3α forbundet med en kortere overlevelsestid især hos patienter med lunge-adenocarcinom. Vigtigere, CREB regulerer ekspressionen af ​​GSK-3α, men ikke GSK-3β, hvilket antyder, at der er en specifik arm af CREB-GSK-3α signalering i lungekræft.

Aktiviteten af ​​CREB reguleres af multipel phosphorylering mekanismer og phosphorylering af CREB i serin-133 er påkrævet for rekruttering af co-aktivator CREB-bindende protein (CBP) /p300 og dets transskriptionelle aktivitet. Faktisk har GSK-3 været kendt som en repressor af CREB aktivitet. CREB DNA bindende aktivitet inhiberes af GSK-3β overekspression og steg med lithium eller natriumvalproat som er GSK-3-inhibitorer i humane neuroblastomceller [42]. Desuden har GSK-3β blevet beskrevet at repressere flere CREB-målgener [43, 44]. Omvendt har nylig undersøgelse blevet rapporteret, at GSK-3 fremmer foreningen af ​​CREB og dets co-aktivatorer med MEIS1, et homeobox (HOX) DNA-bindende cofaktor, at fremkalde HOX-medieret transskription og transformation i MLL leukæmier [45]. Selvom den funktionelle konsekvens af CREB aktivitet ved GSK-3 er ikke endnu klar, vores undersøgelse tyder på, at CREB positivt regulerer GSK-3α, ikke GSK-3β, i lungekræft celler, hvilket giver et nyt koncept for CREB-GSK-3α signalering .

Selvom overekspression af GSK-3β og dens funktion som en tumor promotor i lungekræft er påvist [39], rolle GSK-3α i lungekræft stadig undvigende. I vores nuværende undersøgelse fandt vi, at GSK-3α overudtrykkes i lungekræft cellelinier sammenlignet med normale bronchiale epitelceller. Knockdown af GSK-3α i lungecancerceller forårsager undertrykkelse af celleproliferation og også en induktion af væsentlig apoptose. Disse resultater indikerer, at GSK-3α også spiller en kritisk rolle i væksten af ​​lungecancerceller.

Mekanismen af ​​GSK-3α som en tumor promotor i lungekræft praktisk talt ikke. Det er blevet vist, at GSK-3α fremmer onkogen KRAS funktion via IKK-NF-KB-aktivitet i bugspytkirtelkræft. Forfatterne foreslog GSK-3α som en central nedstrømseffektor af mutante KRAS at regulere NF-KB signalveje [30]. Interessant nok viste vores undersøgelse, at GSK-3α knockdown stærkt undertrykt cellelevedygtigheden af ​​KRAS-WT lungekræft cellelinier, H1993 og H1437 celler, sammenlignet med KRAS-mutant lungekræft cellelinier, H1734 (G13C) og A549 (G12S) celler . Selvom det fortsat er uklart, om KRAS-status er direkte relateret til den rolle, som GSK-3α i lunge kræftceller, foreslår vi, at funktionen af ​​GSK-3α i KRAS signalering kan reguleres i en celletypespecifik måde.

for bedre at forstå betydningen af ​​GSK-3α og undersøge de kritiske gener ramt af GSK-3α i lungekræft, vi oprindeligt screenede en delmængde af NF-KB målgener som

MYC

,

WT1

,

BIRC2

,

IL-9

,

HMOX1

, og

TERT

, som blev reguleret af en pan-GSK-3-inhibitor AR -014.418 i bugspytkirtelkræft [30]. Vores data ikke var helt i overensstemmelse med den tidligere undersøgelse, men vi observeret et signifikant fald i mRNA niveauet af TERT af GSK-3α knockdown og lille forskel i den anden NF-KB henvender den analyserede (EDN1, CYP19A1, HMOX1, WT1, og BIRC2) (S3 fig). Derudover fandt vi, at ekspressionen af ​​adskillige cycliner som er kendt som CREB target gens markant blev nedreguleret af GSK-3α knockdown i multiple lungekræft cellelinier. Selvom vores undersøgelse ikke direkte identificere, hvordan cycliner reguleres af GSK-3α, disse resultater kraftigt støtte romanen rolle GSK-3α som en aktiv regulator i levedygtigheden af ​​lungekræft celler.

Teoretisk set hæmning af GSK-3 kan føre til β-catenin stabilisering og hyperaktivering af Wnt /β-catenin signalering [46-49]. Men Doble et al. viste, at begge isoformer af GSK-3 skal inhiberes for β-catenin stabilisering. GSK-3α /β dobbelt-knockout mus embryonale stamceller (ESC), der vises hyperaktiveret Wnt /β-catenin signalering [50]. I overensstemmelse med denne rapport er der stigende tegn på, at den enkelte tab af enten GSK-3α eller GSK-3β isoform ikke fører til β-catenin stabilisering [28, 39]. Vore data viste også, at inhibering af GSK-3α ikke inducerer niveauet af β-catenin og AXIN2, en Axin-relateret protein, som spiller en vigtig rolle i Wnt /β-catenin-signalvejen (S4 Fig). Disse resultater understøtter, at GSK-3α kan fungere uafhængigt af stabilisering af β-catenin i lungekræft, men yderligere analyse skal være afsluttet fuldt ud at forstå rollerne for GSK-3α og GSK-3β i β catenin stabilisering i lungekræft.

De iagttagelser, at GSK-3α udtryk spiller en kausal rolle i overlevelsen af ​​patienter med lungecancer, foreslår GSK-3α kunne være nyttig som en prognostisk biomarkør i lungekræft, især lunge adenocarcinom. Yderligere undersøgelser undersøger mekanismerne til at målrette CREB-GSK-3α vej hos lungekræft vil være afgørende for at bestemme og udvikle de GSK-3a specifikke hæmmere. Som konklusion, foreslår vi, at GSK-3α er en lovende terapeutisk mål som en ny target gen af ​​CREB at diagnosticere tumor og udvikle terapi, med relevans for lungekræft.

Støtte Information

S1 Fig.