PLoS ONE: modulatorer af prostatakræft Cell Proliferation og levedygtighed Identificeret af Short-Hårnål RNA Bibliotek Screening

Abstrakt

Der er et betydeligt behov for at identificere nye prostatakræft lægemiddeltargets fordi de nuværende hormon behandlinger i sidste ende mislykkes, hvilket fører til en lægemiddelresistent og dødelig sygdom betegnet kastrationsresistent prostatacancer. Til funktionelt at identificere gener, der, når tavshed, nedsætter prostatacancer celleproliferation eller inducerer celledød i kombination med antiandrogener, anvendte vi et RNA interferens-baserede korte hårnål RNA stregkode skærm i LNCaP humane prostatacancerceller. Vi identificeret og valideret fire kandidatgener (

Akt1

,

PSMC1

,

STRADA

, og

TTK

), at forringet vækst, når tavshed i androgen receptor positiv prostata cancer celler og forbedret de antiproliferative virkninger af antiandrogener. Hæmning af AKT med en farmakologisk hæmmer også induceret apoptose, når det kombineres med antiandrogener, i overensstemmelse med de seneste beviser for PI3K og AR pathway krydstale i prostata kræftceller. Inddrivelse af hårnåle rettet mod en kendt prostatakræft vej validerer nytten af ​​shRNA biblioteket screening i prostatakræft som en bred strategi for at identificere nye kandidat lægemiddelkandidater

Henvisning:. Dahlman KB, Parker JS, Shamu T, Hieronymus H, Chapinski C, Carver B, et al. (2012) Modulatorer af prostatakræft Cell Proliferation og levedygtighed Identificeret af Short-Hårnål RNA Library Screening. PLoS ONE 7 (4): e34414. doi: 10,1371 /journal.pone.0034414

Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: September 20, 2011; Accepteret: 27 februar 2012; Udgivet: 11 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Dahlman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af AACR-Amgen, Inc. Fellowship i klinisk og translationel forskning (KBD); Prostata Cancer Foundation (www.pcf.org) (BSC); Howard Hughes Medical Institute (www.hhmi.org) (CLS); National Cancer Institute (www.cancer.gov) (CLS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. CLS er en co-opfinder af MDV3100 og ejer lager i Medivation. KBD blev støttet af AACR-Amgen, Inc., mens dette arbejde blev udført. JSP er ansat af Expression Analysis. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om deling af data og materialer. De øvrige forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Prostatakræft er den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald i amerikanske mænd med en anslået 217,730 nye tilfælde og mere end 32.000 dødsfald som følge sygdommen i 2010 [1]. Mens de fleste tidlige fase lokaliseret sygdom held kan behandles ved strålebehandling og /eller kirurgi, mænd der får sen-fase metastatisk cancer har en median overlevelse på 3-7 år [2]. Desuden vil så mange som 50% af patienterne behandlet med lokaliseret sygdom har lokalt recidiv eller fjernmetastaser [2].

Aktuelle behandlinger for recidiverende eller metastatisk sygdom omfatter målrettet androgen receptor (AR) signalering gennem brug af antiandrogener , såsom bicalutamid, og lægemidler, der forebygger produktionen af ​​androgener i testiklerne og binyrerne, såsom gonadotropin-releasing hormon-agonister og ketoconazol [3]. Selv om disse aktuelle hormon behandlinger har første virkninger i reducere tumor byrde, mange mænd bliver resistente over for disse behandlinger og udvikle kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Mænd med CPRC har en dårlig prognose og tegner sig for størstedelen af ​​dødsfald af sygdommen.

Mænd med CPRC ofte udviser en stigning i tumor androgen receptor (AR) niveauer [4]. AR er en 110 kDa nukleare hormon receptor, der, som reaktion på androgener, aktiverer transkriptionen af ​​målgener involveret i celleproliferation, differentiering og overlevelse. I prostatas luminale epitel, AR regulerer differentiering og proliferation, og AR i prostatacancerceller fremmer cellecyklusprogression [5]. Tidligere arbejde i vores laboratorium har vist, at denne øgede AR plan er nødvendig og tilstrækkelig til progressionen af ​​prostatacancer til CRPC og dets funktion er afgørende for at opretholde tumorvækst [6]. Udover CRPC,

AR

udtrykkes i næsten alle prostata tumorer og er nødvendig for tumor vedligeholdelse [4], [7], [8]. Tilsammen tyder disse data, at AR signalering spiller en kritisk rolle i hormon-følsomme og CRPC og er stadig et vigtigt mål for prostata kræftmedicin.

Identifikation af nye tilgange til behandling af prostatacancer er et område med intens terapeutisk udvikling . For nylig abirateronacetat blev godkendt på grundlag af en betydelig overlevelse fordel hos patienter med CRPC, og de nye antiandrogener, MDV3100 og ARN-509, er blevet indført med lovende resultater; men de fleste tumorer erhvervet resistens over for disse lægemidler [9] – [13]. Til dato blandt kemoterapeutiske midler kun taxaner docetaxel og cabazitaxel har vist sig at forbedre den samlede overlevelse hos patienter med CRPC [14] – [16]. Som følge af de manglende midler, der opretholder prostatakræft regression, nye prostatakræft terapeutiske mål berettiger yderligere undersøgelser.

For at afdække potentielle prostatakræft terapeutiske mål, vi udførte en fordomsfri multiplex skærm shRNA der identificerede modulatorer af prostatakræft cellelevedygtighed i nærvær af bicalutamid. Fire gener blev valideret til at forstærke antiproliferative virkninger af antiandrogener i en prostatacancer-cellelinie når tavshed. Disse data giver en generel strategi for at identificere prostatakræft lægemiddelkandidater.

Resultater

shRNA multiplex skærmen for at identificere modulatorer af bicalutamid følsomhed

For at identificere gener, der, når tavshed , reducere cellelevedygtighed alene eller i kombination med antiandrogenet, bicalutamid, vi udnyttet en multiplex RNA-interferens-baserede shRNA skærm anvendelse af en tidligere valideret bibliotek (figur 1A). Denne teknologi anvender entydigt barcoded shRNAs, udtrykt fra en retroviral vektor, hvis overflod efter celle manipulation kan identificeres ved mikroarray [17]. Biblioteket bestod af ~6,000 shRNAs rettet kinaser, gener involveret i cellecyklus regulering, og andre gener vides at være involveret i kræft [17]. Analyse af udtryk data fra 147 prostata tumorprøver [18] viste, at 97% af generne er omfattet af shRNAs i biblioteket påvises i mindst 50% af tumorerne. Vi udnyttede androgen receptor (AR) -positiv LNCaP cellelinie til skærmen, da de undergår vækststandsning, når de behandles med AR antagonist bicalutamid, vokser relativt hurtigt, og er let inficeret med retrovirus (figur S1). AR-negative PC3 humane prostatacancerceller tjente som en negativ kontrol af antiandrogen følsomhed (fig S1). Sammenhæng mellem biologiske replikere eksperimenter i hver cellelinje var høj og ikke ændre på senere tidspunkter eller med bicalutamid behandling (tabel S1).

(A) Skematisk af shRNA skærmen. Nærmere oplysninger kan findes i afsnittet Materialer og metoder. (B) En Heatmap blev dannet ved gruppering baseret på prober, der blev udtømte eller beriget (log2 bicalutamid /køretøj ≤ +/- 0,58 og en p-value≤0.01) i bicalutamid (0,4 uM og 1,0 uM) -behandlede LNCaP-celler på T = 1 og T = 2 sammenlignet med vehikelbehandlede celler på samme tidspunkter. The shRNA målgenet forbundet med hver probe er angivet til højre for Heatmap. Målgener, der vises mere end én gang om Heatmap indikerer, at mere end én probe scorede for dette gen.

Microarray analyser afslørede, at 23 prober, der er forbundet med 15 gener, entydigt blev depleteret i bicalutamid-behandlede LNCaP-celler, sammenlignet med vehikelbehandlede celler (log2 bicalutamid /køretøj ≤-0,58, p≤0.01) (figur 1B, tabel 1, og fig S2). Der blev ikke observeret nogen forskel i forarmet sonder tværs høje og lave bicalutamid doser eller tidlige og sene tidspunkter (dag 8 eller dag 21); derfor dataene blev kombineret til analyserne. Af de 15 identificerede gener, 11 var kinaser (

TTK

,

MAST3

,

CIT

,

PRKACG

,

IGF1R

,

TSSK2

,

VEGFβ

,

MAPKAPK5

,

ABL2

,

PLK2

, og

Akt1

) kendte at have funktioner i cellecyklusregulering eller cellelevedygtighed (tabel 1). Denne høje frekvens for at inddrive kinase hits kan være relevante for biologi prostatacancerceller men sandsynligvis også afspejler en skævhed i udvælgelsen af ​​gener for shRNA biblioteket. De resterende 4 gen hits har forskellige funktioner: calmodulin binding (

STRN3

), GTPase aktivering (

RABGAP1

), kinase adaptere (

STRADA

), eller involveret i proteasomet (

PSMC1

). En parallel screening blev også udført i androgen-uafhængig cellelinie, PC3, og, især, ingen af ​​proberne depleteret i LNCaP-celler blev depleteret i PC3-celler i nærvær af bicalutamid anvendelse af den samme afskæringsværdi indeholdende dokumentation for specificitet i antiandrogen sensitive celler (tabel S2).

Validering af kandidatgener

for yderligere at undersøge disse 15 kandidatgener, vi ansat uafhængige knockdown teknologi (siRNA transfektion hjælp siRNA’er rettet mod sekvenser adskiller sig fra dem anvendes i skærmen shRNA) i et andet AR afhængige cellelinie (VCap), som har vist sig at være resistente over for bicalutamid men følsom til anden generation antiandrogen MDV3100 [19]. Silencing af generne blev bekræftet ved QRT-PCR (figur 2B). Som en positiv kontrol blev VCap-celler transficeret med AR siRNAs og som forventet nedregulering af AR reducerede cellelevedygtighed (figur 2A). Silencing af

Akt1

,

STRADA

,

PSMC1

, og

TTK

forbedret væksthæmmende effekt af MDV3100 i VCAP celler (figur 2A, venstre panel ), i overensstemmelse med de observerede med bicalutamid i den oprindelige skærm i LNCaP celler effekter. Interessant, tavshed

Akt1

PSMC1

i VCAP celler også nedsat levedygtighed celle i fravær af antiandrogen (figur 2A, venstre panel).

Kandidat målgener fra LNCaP skærm sonder, der blev forarmet i tilstedeværelse af bicalutamid blev selektivt målrettet hjælp siRNA’er. (A, venstre panel) blev VCap-celler transficeret med siRNAs der scoret i skærmbilledet LNCaP lægemiddel og blev inkuberet med 1 uM MDV3100 eller køretøj, og antallet af levedygtige celler blev målt 6 dage efter behandling. (A, højre panel) blev VCap-celler transficeret og behandlet som i (A, venstre panel) undtagen Caspase 3/7 aktivitet blev målt efter 3 dages behandling.

PLK1

siRNA transfektion blev anvendt som en positiv kontrol. Stiplede linjer angiver niveauet af vækstinhibering eller apoptose induceret af MDV3100, til sammenligning. NT, ikke-målrettet siRNA. (B) Gene silencing (10-50%) blev bekræftet ved RT-qPCR 6 dage efter transfektion af celler med VCap siRNA SMARTpools. Reaktioner blev udført tre gange og normaliseret til RPL27 for hver cDNA og derefter normaliseret til vehikel-behandlede NT. Standardfejl på middelværdien blev beregnet. Bic, bicalutamid.

Vi undersøgte derefter effekten af ​​lyddæmpende

Akt1

,

STRADA

,

PSMC1

, og

TTK

på apoptose, ved hjælp af

PLK1

siRNA’er som en positiv kontrol. Silencing af

AR

,

AKT

, og

STRADA

i kombination med MDV3100 behandling induceret VCAP celle apoptose i kontrol siRNA’er (NT) behandlet med MDV3100 (figur 2A, højre panel ). Med undtagelse af AR, testede ingen af ​​siRNAs induceret apoptose i fravær af MDV3100 (figur 2A, højre panel). Selv silencing af

TTK

i kombination med MDV3100 inducerede ikke apoptose i de NT celler med MDV3100, havde kombinationen reducere antallet af levedygtige celler mere end MDV3100 alene i NT-celler (figur 2A, venstre panel). Tilsammen

AKT

,

STRADA

, og

TTK

siRNAs synergi med MDV3100 at reducere VCap cellelevedygtighed. Ud fra følgende betragtninger

Akt1

STRADA

lyddæmpning reducerer cellernes levedygtighed, i det mindste delvist, på grund af øget apoptose, når det kombineres med MDV3100,

TTK

synes at virke gennem en alternativ væksthæmmende mekanisme . Selvom

har PSMC1

ikke score i PC3 celler i det indledende shRNA biblioteket skærm, siRNA knockdown af

PSMC1

forringet levedygtighed PC3 celler, hæve muligheden for, at disse antiproliferative effekter kan ikke være specifik for AR-positive prostatacancerceller (figur S3). Derfor har vi ikke forfølge yderligere karakterisering af

PSMC1

.

Overekspression af

TTK

er forbundet med øget sandsynlighed for biokemisk tilbagefald

At udforske om

Akt1

,

STRADA

, og

TTK

ændres i human prostatacancer, vi vurderede antal kopier og udtryk status af disse gener i en tidligere rapporteret menneskelige prostata cancer datasæt [18]. Af de 218 prostata tumorer, havde 34,4% reduceret ekspression af

STRADA

, 18,3% udviste overekspression af

TTK

, 11,7% enten overudtrykt eller havde reduceret ekspression af

Akt1

, og 15,6% af tumorer overudtrykt eller havde forstærket

AR

(tabel 2). Overekspression blev defineret som z-score≥2 og reduceret ekspression blev defineret som z-score 2, sammenlignet med ekspression i normale prostata prøver. I modsætning til

AR

,

STRADA

,

TTK

, og

Akt1

viste lidt tegn på genamplifikation eller tab i humane prostata tumorer. Det store antal prostata tumorer med ændringer i

STRADA

,

TTK

, og

Akt1

udtryk førte os til at se på deres korrelation med biokemiske gentagelse. Interessant overekspression af

TTK

udviste en signifikant sammenhæng med biokemisk tilbagefald (p = 0,003) (figur 3). TTK udtryk ikke signifikant korrelerer med følgende kliniske karakteristika:. Kirurgisk margin, lymfeknude status, sædblære, Gleason score, behandling prostata specifikt antigen (PSA), mener PSA, eller extracapsular forlængelse (tabel S3)

Kaplan Meier plot af risikoen for biokemisk tilbagefald hos patienter (n = 131) med TTK overekspression prostata tumorer (n = 20; grøn linje) versus dem uden TTK overekspression (n = 111; blå linje) tumorer (p = 0,003, log- rank test).

Blokering AKT samarbejder med bicalutamid at fremkalde LNCaP celle apoptose

for yderligere at undersøge den potentielle rolle af disse gener som terapeutiske mål i prostatakræft, vi vendte til farmakologiske inhibitorer. Vi vurderede antallet af levedygtige LNCaP-celler ved anvendelse af en Akt1 /2-inhibitor i nærvær og fravær af bicalutamid. Behandling med bicalutamid eller AKT inhibitoren reducerede antallet af levedygtige celler med 10% og 45%, henholdsvis (figur 4A). I modsætning hertil kombinere forbindelserne reduceret celleproliferation med 100% og induceret apoptose som vist ved en stigning i PARP-spaltning (figur 4B). Disse data tyder på, at AKT kan være en terapeutisk mål for prostatakræft i kombination med antiandrogen terapi, i overensstemmelse med de seneste beviser ved hjælp PI3K inhibitorer [20].

(A) Antal af levedygtige LNCaP celler behandlet over 5 dage med bil , bicalutamid (1 uM), Akt1 /2-inhibitor (1 uM), eller en kombination af bicalutamid og AKT-inhibitor. (B) Apoptose blev målt i LNCaP-celler ved immunoblotting under anvendelse af et PARP-antistof i LNCaP-celler behandlet som i (A). Inhibering af phosphoryleret Akt (Pakt (Ser473)) og phosphoryleret S6 (PS6) blev også målt. Actin blev brugt som en belastning kontrol.

Diskussion

Aktuelle behandlinger for prostatakræft omfatte antiandrogener såsom bicalutamid og MDV3100. Selvom næsten alle patienter har indledende reaktioner på disse lægemidler, mange tumorer bliver resistente over for disse behandlinger, hvilket resulterer i CRPC. På grund af den vigtige rolle, som AR spiller i primær prostatacancer og CRPC, AR fortsat en relevant terapeutisk mål. Identifikation af hidtil ukendte tilgange til behandling af prostatacancer, herunder udvikling af kombinationsterapier med antiandrogener, er et område af terapeutisk udvikling. Derfor har vi udført en uvildig multiplex skærm shRNA at identificere modulatorer af prostatakræft cellelevedygtighed. Vores mål var at identificere gener, der kan udnyttes til romanen målrettet terapi.

Fra skærmen shRNA og

in vitro

siRNA validering eksperimenter i en uafhængig cellelinje, vi identificeret og valideret

Akt1

,

STRADA

, og

TTK

som kandidatgener, der synergi med antiandrogener (Figur 1 og Figur 2). Selvom

Akt1

,

STRADA

, og

TTK

scoret som hæmmere af LNCaP celledeling i forbindelse med bicalutamid, validering med siRNAs i samme cellelinje afslørede, at de kan reducere cellelevedygtighed i fravær af bicalutamid (fig S4A). Denne virkning var specifik for LNCaP og blev ikke observeret i AR-negative PC3-celler. En forklaring på denne forskel i fænotype er styrken af ​​shRNA knockdown på skærmen versus siRNA i validerings- eksperimenter, da siRNAs generelt opnå større knockdown end shRNAs på en MOI≤0.5. Faktisk er de siRNAs gjorde udviser en høj grad af gen-silencing i validerings- eksperimenter (Figur s4b).

Det vil være af interesse for at forstå den mekanisme, hvormed hæmning af

Akt1

,

STRADA

eller

TTK

øger antiandrogen aktivitet. En mulighed er gennem regulering af AR-afhængig transskription, men vi undlod at iagttage et fald i mRNA niveauer af

AR

eller AR-target gener (

TMPRSS2

,

FKBP5

,

NKX3.1

, eller

KLK3

), når disse gener blev stille i LNCaP-celler (data ikke vist). En anden mulighed er forstyrrelse af signalvejen crosstalk, hvilket illustreres af de seneste beviser for gensidig negativ feedback som en forklaring på den synergi observeret med kombineret PI3K /AR vej hæmning [20].

TTK, også kendt som monopolar spindel 1 (Mps1), er en serin /threonin og tyrosin kinase, som har været impliceret i opretholdelsen af ​​spindlen samling checkpoint og er nødvendig for korrekt kromosomsegregering under mitose [21], [22]. TTK er af særlig interesse, eftersom andre har rapporteret, at en reduktion niveauer af

TTK

sensibiliserede humane tumorceller til subletale doser af taxol, hvorimod ikke-tumorigene celler ikke kunne sensibiliseret for taxol [23]. Her finder vi, at lyddæmpning

TTK

resulterede i sensibilisering af VCAP celler til en potent antiandrogen. Det faktum, at 18% af humane prostatatumorer overudtrykker TTK og at disse tumorer har en anden kliniske resultater antyder, at TTK inhibitorer i kombination med anti-androgener kan være af interesse.

STE20-relateret kinase adapter alfa eller STRADA, er en pseudokinase, der rapporteres at være nødvendig for korrekt aktivitet af tumor suppressor, lever kinase B1 (LKB1) [24].

STRADA

er nødvendig for funktionen af ​​LKB1 tumorsuppressor; derfor, nedregulering af

STRADA

kunne forventes at fremme tumorigenese. Vores konklusion, at

STRADA

udviste reduceret ekspression i en stor procent af humane prostatakræft er konsistent med en tumor suppressor rolle (tabel 2). Det er imidlertid muligt, at STRADA har funktioner uafhængigt af LKB1 /AMPK signalering, der fremmer vækstinhibering i visse cellulære sammenhænge. Den potentielle rolle STRADA i prostatakræft progression og muligheden for LKB1 /AMPK-uafhængige funktioner garanterer ekstra opmærksomhed.

Akt1 er en serin-threonin-kinase, som sender signaler fra phosphatidylinositol 3 ‘kinase (PI3K) ved sin fosforylering af downstream mål og deregulering af denne vej er kendt for at bidrage til prostatakræft progression [25], [26]. Det er velkendt, at PI3K /Akt pathway spiller en vigtig rolle i prostatacancer cellelevedygtighed og tumorigenese og det bliver for tiden undersøgt som et terapeutisk mål [27], [28]. Tidligere rapporter har vist, at AKT /PI3K pathway regulerer LNCaP cellevækst og at ekspression af konstitutivt aktive AKT kan blokere bicalutamid-induceret vækstinhibering [27], [29], [30]. Endvidere Akt1 har vist sig at interagere med AR [31]. Tab af funktion af phosphatase og tensin homolog (PTEN), en negativ regulator af PI3K /AKT pathway, optræder hos mindst 50% af fremskreden human prostatacancer [32] – [34]. Dette tab af PTEN funktion resulterer i forøget ekspression af phosphoryleret Akt og efterfølgende aktivering af nedstrøms mål involveret i celleoverlevelse og proliferation [35], [36]. Inhibering af AKT hjælp siRNA’er eller et farmakologisk inhibitor induceret apoptose i kombination med bicalutamid eller MDV3100 i AR-afhængige prostatacancerceller (figur 2A, højre panel og figur 4). Som følge af de rapporterede roller Akt1 i prostatacancer tumorigenese, er PI3K /AKT pathway bliver nøje undersøgt som et terapeutisk mål [25]. Vores data understøtter brugen af ​​Akt-hæmmere i kombination med anti-androgener til behandling af prostatacancer.

Materialer og metoder

Cell kultur og antiandrogener

Menneskelig prostata karcinom cellelinjer (LNCaP, PC3, og VCap) og humane embryonale nyreceller (293T) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og blev holdt under 20 passager i laboratoriet. Celler blev dyrket ifølge ATCC retningslinjer. Ingen abnormiteter blev observeret i vækst eller morfologi for enhver cellelinje under deres respektive vækstbetingelser. Bicalutamid blev købt fra AstraZeneca Pharmaceuticals LP (Wilmington, DE) og MDV3100 blev syntetiseret ved Memorial Sloan-Kettering Cancer Center i Organic Synthesis Core Facility [19].

Udarbejdelse af korte hårnål RNA bibliotek DNA og virus

En plasmid bibliotek (pLMP), der udtrykker ~6,000 korte hårnål RNA (shRNAs) rettet kinaser, gener involveret i cellecyklus regulering og andre gener vides at være involveret i kræft blev brugt i den aktuelle skærm [17]. Den poolede plasmid-bibliotek blev amplificeret i TOP10 elektrokompetente celler (Invitrogen, Carlsbad, CA) og plasmid DNA blev isoleret fra mindst 1.000 transformanter pr hårnål. Virus blev fremstillet i 293FT celler ved co-transfektion af pUMVC3-Gag-Pol-ekspressionsvektor (Addgene, Cambridge, MA), VSVG pantropisk kuvert (Addgene), og shRNA bibliotek DNA isoleret ovenfor.

shRNA interferens skærm

skærmbilledet shRNA indblanding er afbildet i figur 1A. LNCaP og PC3-celler blev inficeret med 6K shRNA puljet bibliotek virus (MOI≤0.5) i tre eksemplarer til at generere i alt 6 millioner inficerede celler pr måleglas, pr cellelinie. Infektion af målceller ved MOI≤0.5 blev bekræftet ved fluorescensmikroskopi og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) 48 timer efter infektion. LNCaP og PC3-celler blev selekteret med 3 ug /ml puromycin og cellerne blev talt og udpladet i vækstmedier indeholdende 0,4 uM bicalutamid, 1,0 uM bicalutamid eller vehikel (DMSO). Celler blev passeret, og bicalutamid og køretøj genopfyldes, hver 4 dage uden at tillade sammenløbet. LNCaP og PC3-celler fra hver replikat blev høstet og cellepellets lynfrosset og opbevaret ved -80 ° C ved flere tidspunkter under skærmen. Celler blev høstet 48 timer efter infektion (T = 0), og efter 8 dage (T = 1) og 21 dage (T = 2) af eksponering for køretøj eller bicalutamid.

Microarray

genomisk DNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af standardbetingelser. Stregkoder og halve hårnåle fra biblioteket plasmid-DNA (oprindeligt anvendt til at fremstille virus) og LNCaP og PC3 celle genomisk DNA isoleret ovenfor, blev PCR-amplificeret under anvendelse af følgende primere: 5′-TAGTGAAGCCACAGATGTA-3 ‘og 5′-AAAGCGCATGCTCCAGACTGCC-3’ . PCR-produkterne blev underkastet gelelektroforese, og de resulterende 350 bp bånd blev geloprenset under anvendelse af QIAEX II Gel Extraction kit (Qiagen, Valencia, CA) .Purified DNA-fragmenter (1,5 ug) fra LNCaP eller PC3 celler blev mærket og microarray hybridisering var udføres under anvendelse af tilpassede Agilent chips som tidligere beskrevet [17].

Microarray dataanalyse

Affymetrix exon array-data fra 147 tumorprøver [18] blev anvendt til at bestemme ekspressionsniveauer af shRNA målgener repræsenteret i biblioteket skærmen. Sonder med baggrund justeret normaliseret intensitet større end 50 blev betragtet som påvist.

Agilent Feature Extractor software blev brugt til at scanne microarray billeder. Feature Extractor normaliseret Cy3 intensitet for hvert array blev udarbejdet og alle yderligere behandling blev udført ved hjælp af den statistiske programpakke R 2.8.1. Kvalitet blev vurderet i hele bruge principal komponent analyse og mere formelt ved at sammenligne interkvartile område på tværs af arrays. Prøver med en log2 forvandlet interkvartile spænder mindre end 6 blev betragtet outliers og ikke behandlet i yderligere analyse. Når dobbelte prøver (tekniske replikater) forbliver, blev den seneste gentagelse af hver brugt. De resterende prøver blev underkastet fraktil normalisering. Prober svarende til hårnåle ikke forekommer i biblioteket blev anvendt som negative kontroller. Den 95. percentil signal intensitet negative kontroller blev brugt som baggrund foranstaltning og blev estimeret ud fra forvalg (T = 0) prøver. Sonder blev fjernet fra yderligere analyse, når de ikke oversteg den specifikke baggrund estimat prøve på et flertal af præ-valg prøver. Statistisk test blev udført for at identificere hårnåle hvis overflod varieret over tid i ubehandlede prøver. Tidsforløbet analyse gennemført i udvinding af differentiel genekspression (EDGE) software blev anvendt til denne analyse [37]. For at identificere hårnåle hvor overflod blev forbundet med tilstedeværelsen af ​​bicalutamid de lineære modeller for microarray bibliotek i R 2.8.1 blev anvendt [38]. Specifikt blev en lineær model konstrueret med hensyn til behandling, tidspunkt, og kopiere. Denne model var egnet til hver probe, og fold ændringer og p-værdier svarende til behandlingseffekten blev anvendt til at identificere prober af interesse. De to bicalutamid doser (0,4 uM og 1,0 uM) og de to tidspunkter opsamlet efter selektion (T = 1 og T = 2) blev kombineret til analyse for at øge statistisk styrke. Væsentlige forskelle mellem bicalutamid doser og tidspunkter blev ikke observeret. Kandidater, der havde en overflod ændring, var forbundet med tilstedeværelsen af ​​bicalutamid blev udvalgt, der resulterede i en log2 bicalutamid /køretøj ≤-0,58 og en p-value≤0.01. Visualisering af kandidater blev udført med hierarkisk klyngedannelse og heatmaps. Alle microarray data MIAME kompatibel. Alle rådata er blevet deponeret i GEO (serie ID GSE32261).

Cell levedygtighed og apoptose analyser

ON-TARGETplus ikke-targeting (NT) siRNA og siRNA SMARTpools målretning

ABL2

,

Akt1

,

AR

,

CIT

,

IGF1R

,

MAPKAPK5

,

MAST3

,

PLK2

,

PRKACG

,

PSMC1

,

RABGAP1

,

STRADa (STRADA)

,

STRN3

,

TSSK2

,

TTK

, og

VEGFβ

blev købt fra Thermo Fisher Scientific (Lafayette, CO). siRNA’er rettet mod

PLK1

blev anvendt som en positiv kontrol for apoptose og blev opnået fra MSKCC High-Throughput Drug Screening Facility. Log fase LNCaP blev PC3 og VCAP celler transficeret med 100 nM siRNA hjælp DharmaFECT (Thermo Fisher Scientific). Cellelevedygtighed bestemtes 3 og 6 dage efter inkubering med bicalutamid (1 uM), MDV3100 (1 uM) eller vehikel ved hjælp af celle Titer-Glo Luminescent celleviabilitetstest (Promega). Apoptose blev analyseret under anvendelse af Caspase-Glo 3/7 assay (Promega) og værdier blev normaliseret til Dag 3 Cell Titer-Glo assay. Assays blev udført in triplo og standardfejl af middelværdien rapporteres. Celleproliferationsassays blev også udført ved at inkubere celler med vehikel (DMSO), bicalutamid (1 uM), AKT-inhibitor (1 uM) (Merck, Whitehouse Station, NJ), eller en kombination af bicalutamid og AKT-inhibitor og tælle cellerne. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og standardafvigelserne rapporteres.

Immunoblotting

Cellelysater til Western blot analyser blev fremstillet under anvendelse af standard RIPA buffer. Antistofferne bruges til western blot analyse og immunhistokemi var Pakt Ser473 (Cell Signaling Technology, 1:1000 fortynding), Akt (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 1:1000 fortynding), PS6 Ser235 /236 (Cell Signaling Technology, 1: 1000 fortynding), PARP (Cell Signaling Technology, 1:1000 fortynding), og Actin (Cell Signaling Technology, 1:1000 fortynding).

Kvantitativ revers transkription-PCR

LNCaP, PC3, og VCap celler omfattet siRNA transfektion blev høstet 4 dage eller 7 dage efter transfektion for at overvåge knockdown af mål-gen (er) ved kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR) (se tabel S4). Reaktioner blev udført tre gange og normaliseret til RPL27 for hver cDNA og derefter normaliseret til vehikel-behandlede NT. Standard af middelværdien blev beregnet.

Biokemisk tilbagefald

genekspression og kopiere antal status

STRADA

,

TTK

,

AR

,

Akt1

,

SKT22B

,

PSMC1

, og

PRKACG

i primær og metastatisk menneskelig prostatakræft (n = 218) blev bestemt ved hjælp af MSKCC Cancer Genomics Pathway Portal [18]. Tyve af de 131 tumorer havde

TTK

overekspression defineret som z-score≥2. Sager blev klassificeret som

TTK

høj og

TTK

normal /lav. Sandsynligheden for frihed fra biokemisk tilbagefald efter radikal prostatektomi (BCR defineret som 0,2 ng /ml og stigende prostataspecifikt antigen) blev rapporteret ved anvendelse af Kaplan-Meier-analyse. P-værdi blev beregnet ved anvendelse af log-rank test.

Støtte oplysninger

figur S1.

Bicalutamid inhiberede LNCaP celleproliferation. Efter infektion med shRNA bibliotek og puromycinselektion (A) LNCaP og (B) PC3 celler blev talt og udpladet i vækstmedier indeholdende 0,4 uM bicalutamid, 1,0 uM bicalutamid eller vehikel (0 uM). Celler blev talt og passeret hver 4 dage for at overvåge væksten i afhængighed køretøjet og bicalutamid. Resultater er præsenteret som det gennemsnitlige antal levedygtige celler (toppaneler) eller som procent af levedygtige bicalutamid-behandlede celler sammenlignet med vehikelbehandlede celler (nederst paneler) ved hvert tidspunkt i løbet 21 dage tidsforløbet for hver lægemiddelbehandling ± standard fejl 3 gentagne eksperimenter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0034414.s001

(TIF)

Figur S2.

shRNA sonder forarmet i LNCaP celler. Boxplots af den relative forekomst af prober i køretøjet og bicalutamide- (lægemiddel) behandlet LNCaP-celler. Data fra T = 2 og T = 3 blev kombineret for køretøjet eller bicalutamid-behandlede boxplots. Begge bicalutamid doser (0,4 uM og 1,0 uM) blev også kombineret for narkotika boxplots.