PLoS ONE: MIR-205 og MIR-373 er ​​forbundet med Aggressive Menneskelig mucinøs Colorectal Cancer

Abstrakt

mucinøs adenocarcinom (MAC) repræsenterer en særskilt histopatologisk enhed af kolorektal cancer (CRC), der er forbundet med sygdommen progression og dårlig prognose. Her fandt vi, at ekspressionsniveauer af MIR-205 og MIR-373 blev specifikt opreguleret kun hos patienter med mucinøse coloncancere, men ikke i CRC som mangler mucinous komponenter. For at undersøge effekten af ​​miR-205 og miR-373 på intestinal epitelcelle (IEC) biologi ved GAIN- og tab af funktion eksperimenter i et proof-of-concept tilgang, valgte vi tidligere etableret

in vitro

human Caco-2-baserede modeller for differentieret, ikke-invasiv (udtrykker TLR4 vildtype, betegnes Caco-2 [WT]) versus udifferentierede, invasive (udtrykker TLR4 mutant D299G; betegnes Caco-2 [D299G]) IEC. Enterocytterne-lignende Caco-2 [WT] viste lave niveauer af miR-205 og miR-373 udtryk, mens begge miRNA var signifikant opreguleret i colorectal carcinom-lignende Caco-2 [D299G], hvilket ligner miRNA udtryk mønster af parrede normale versus tumorprøver fra MAC patienter. Brug af stabil transfektion, genereret vi MIR-205- eller MIR-373-udtrykkende og MIR-205- eller MIR-373-inhiberende subkloner af disse IEC linjer. Vi fandt, at indførelsen af ​​MIR-205 i Caco-2 [WT] førte til udvidelse af slim-secernerende bægercelle-lignende celler, som var forbundet med induktion af KLF4, MUC2 og TGFp1 ekspression. Aktivering af miR-205 i Caco-2 [WT] induceret kemoresistens, mens hæmning af miR-205 i Caco-2 [D299G] fremmes kemosensitivitet. Caco-2 [WT] overekspression miR-373 udviste mitotiske abnormiteter og gennemgik morfologiske ændringer (tab af epitelial polaritet, cytoskeletal reorganisering, og junktionel forstyrrelser) forbundet med epitelial-mesenkymale overgang og progression til inflammation-associerede colon karcinom, som korreleret med induktion af phosphoryleret STAT3 og N-cadherin ekspression. Funktionelt, indførelse af MIR-373 i Caco-2 [WT] medieret tab af celle-celle-adhæsion og øget proliferation og invasion. Omvendt inhibering af MIR-373 tillades mesenkymale IEC at genvinde epitel egenskaber, som korrelerede med fraværet af neoplastisk progression. Brug af xenotransplantater i mus demonstrerede MIR-373-medieret acceleration af malign intestinal tumorvækst. Afslutningsvis vores resultater giver første dokumentation for, at miR-205 og miR-373 differentielt kan bidrage til den aggressive fænotype af MAC i CRC

Henvisning:. Eyking A, Reis H, Frank M, Gerken G, Schmid KW , Cario E (2016) MIR-205 og MIR-373 er ​​forbundet med Aggressive Menneskelig mucinøs kolorektal cancer. PLoS ONE 11 (6): e0156871. doi: 10,1371 /journal.pone.0156871

Redaktør: Aamir Ahmad, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: April 12, 2016 Accepteret: 20 maj 2016; Udgivet: 6 juni 2016

Copyright: © 2016 Eyking et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant CA226 /4-3 til EF) og murene finansiering (Interne Forschungsförderung Essen til EF). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

colorectalt carcinom (CRC) er en af ​​de mest almindelige cancere og en af ​​de førende årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Inden den heterogene CRC spektrum, mucinøs adenocarcinom (MAC) udgør en særskilt histologisk undertype, som er kendetegnet ved rigelig produktion af ekstracellulær mucin ( 50% af tumorvolumenet) [2]. Typisk er colon bæger celleafledt mucin MUC2 udtrykkes i høje niveauer i MAC [3]. Slimhypersekretion er blevet forbundet med ændringer i tarmens mikrobiota og induktion af inflammatoriske reaktioner, der kan fremme tumorudvikling [4]. Mens prævalensen varierer fra 4% til 11% af alle CRC tilfælde, afhængigt af den geografiske placering [5], MAC er langt mere almindeligt diagnosticeret hos patienter med CRC i colitis ulcerosa (UC) [6]. Det menes, at kronisk inflammation i UC kan lette afvigende mucin differentiering i CRC patogenese [7], men de signalveje er endnu ikke forstået.

Klinisk MAC er blevet forbundet med mere avancerede tumor stadier på diagnosetidspunktet, dårlig terapeutiske respons og nedsat overlevelse i flere serier [8-11]. Trods de seneste fremskridt inden for individualiserede terapi og ledelsesstrategier af patienter med MAC, prognose i metastatisk indstilling synes at være endnu værre end for patienter med andre undertyper af CRC [12]. Voksende tegn på, at MAC kan udgøre en genetisk og fænotypisk forskellige sygdomme enhed fra andre typer af colon adenocarcinom (AC) [13-15], men de specifikke molekylære mekanismer, som kan drive tumorprogression og metastatisk transformation i mucinøs carcinogenese er stort set ukendte.

MikroRNA’er (miRNA) er et yderst konserveret klasse af 19-25 nucleotid-lange enkeltstrengede ikke-kodende RNA’er, som regulerer mange biologiske processer, herunder cancer patogenese [16]. Ændring af diverse miRNA profiler er blevet vist at korrelere med tyktarmskræft progression ved modulering af genekspression translatorisk og /eller transkriptionelt i komplekse signalsystemer net [17,18]. Dog kan miRNA udtryk signaturer varierer betydeligt mellem CRC befolkningsgrupper [19], potentielt afspejler fænotypisk variation på grund af forskellige histologiske subtype distributioner i heterogene CRC kohorter [20]. Det er så langt uklart, om de enkelte miRNA kan udløse den biologiske adfærd MAC. For nylig har uafhængige rapporter variabelt rapporterede miR-205 og miR-373 at være forbundet med CRC [21-23], men de enkelte sager blev ikke klassificeret i histologiske undertyper.

MIR-205 interagerer med medlemmer af miR -200 familie (mIR-200a /-200b) [24] og repræsenterer en epitel-specifik miRNA [25], i det væsentlige involveret i normale cellefunktioner, såsom regenerering og stamcelle ekspansion [26]. miR-373 tilhører miR-520 /-373 familie, som består af tre forskellige miRNA klynger (miR-302 /-367, miR-371 /-372 /-373, og miR-520) [27]. MIR-373, først identificeret som en embryonisk stamcelle-specifikke miRNA [28], kan direkte regulere aktiviteten af ​​Wnt /β-catenin pathway [29]. Både MIR-205 og MIR-373 synes at udøve pleiotropiske virkninger på tumorigenese, afhængigt af cellen eller vævet for oprindelse. De målrette flere gener eller proteiner direkte eller indirekte [27,30], og kan dermed fungere enten som onkogener ved at lette tumor initiering eller som tumorsuppressorer ved at hæmme invasion. Signalering via miR-205 og miR-373 kan favorisere epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) og kræft celle migration i visse tumor enheder [24,31-33]. Men de mulige roller miR-205 og miR-373 i CRC patogenese forbliver hidtil ukendt.

Her viser vi, at ekspressionsniveauer af miR-205 og miR-373 specifikt opreguleres kun mucinøs CRC. Funktionelt MIR-205 dirigerer den intestinale epitelcelle skæbne afgørelse mod en mucin-producerende bæger celle-lignende afstamning og MIR-373 driver inflammation-associerede tumorudvikling ved at nedsætte celle-celle-adhæsion og forøgelse invasion. Således giver vi først beviser for, at forskellige signalsystemer effekter af miR-205 og miR-373 differentielt kan bidrage til den unikke fænotype af MAC i CRC.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

En detaljeret liste over alle antistoffer findes i S1 tabel. Methotrexat (MTX) blev opnået fra Pfizer og Matrigel

® fra Corning.

Menneskelig tyktarmskræft prøver

Vi udførte en retrospektiv, single-center kohorteundersøgelse blandt patienter med en diagnose af CRC ved hjælp formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) materiale arkiveres fra juli 2003 til november 2013 Patologisk Institut, University Hospital of Essen, Tyskland. Denne undersøgelse overholdt Helsinki-deklarationen og blev godkendt af den lokale etiske komité ( “Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen” # 13-5602-BO, anonym analyse af historiske samling). Tabel 1 viser de histopatologiske træk af de 51 patienter. Kun matches hosliggende ikke-neoplastiske, normalt væv (R

0) og tumor blokpar for hvert tilfælde blev medtaget. Alle tumor og parrede tumor-fri væv blev patologisk revideret, der er klassificeret som kolorektal adenocarcinom (AC) og opdelt i 1. konventionelle (defineret som: 50% kirtel-dannelse, ingen mucinproduktion), 2. mucinøs ( 50% ekstracellulære mucin), eller 3. kronisk UC-associerede (enhver histologisk variant). Subtype oftest observeret i UC-associerede CRC var MAC ( 50% ekstracellulært mucin) eller AC med mucinøs komponent ( 50% af læsion sammensat af mucin) (

n

= 10), mens den resten var signet celle (

n

= 1) eller kirtel-dannende AC (

n

= 2). Ingen af ​​de konventionelle tumorer blev klassificeret som dårligt differentieret i forhold til næsten to tredjedel af mucinøs (60%;

s

0,0001; Fisher eksakt test) eller mere end en tredjedel af UC-associerede (38%;

s

0,01; Fisher eksakt test) tumorer. Alle prøver (tumor vs R

0) fra UC patienter demonstrerede mild til moderat inflammation.

Cellelinjer

Den menneskelige intestinale epithelceller (IEC) linje Caco-2 betegner en almindeligt anvendt model til at studere molekylære begivenheder, der er involveret i differentiering og cancer progression trin [34]. Generation og fænotyper af humane IEC linjer afledt Caco-2 (opnået fra ATCC kat # HTB-37; parti 1.537.739) stabilt transficeret med TLR4-WT eller TLR4-D299G ekspressionskonstruktioner er for nylig blevet beskrevet detaljeret [35]. Caco-2-TLR4-WT udviser typiske morfologiske og funktionelle egenskaber af normale, modne enterocytterne, og blev navngivet Caco-2

WT. Vækstmønster Caco-2

WT er ikke-invasiv og IEC begynder at polarisere dybt konfluens, sammenlignes med parentale Caco-2. I modsætning hertil Caco-2-TLR4-D299G vedtage en aggressiv fænotype af colon carcinomceller [35], og blev betegnet Caco-2

D299G. Den accelereret vækst af Caco-2

D299G er meget invasiv og IEC forbliver i en udifferentieret tilstand trods sammenløb. De beskrevne fænotyper blev tidligere gengivet i 3 kloner af Caco-2

WT og 3 kloner af Caco-2

D299G [35].

Yderligere cellelinjer afledt fra patienter med human colorectal adenocarcinom blev købt fra ATCC: LS 174T (cat # CL-188; parti 3.752.718), HT-29 (cat # HTB-38; parti 1.467.609), HCT-116 (cat # CCL-247; parti 60.286.831) og SW480 (cat # CCL- 228; [36]), som alle variabelt udtrykke MUC2 [37-39]. Caco-2, HT-29 og HCT 116 blev dyrket i høj-glucose (4,5 g /L) DMEM (Life), SW480 i Leibovitz L-15 (Life) og LS 174T i EMEM (ATCC). Alle medier blev suppleret med 100 U /ml penicillin og 100 pg /ml streptomycin (Life eller PAA) og 10% FBS (Thermo; parti RYF35911), undtagen Caco-2, som fik 20% FBS. Alle cellelinjer blev rutinemæssigt testet negativ for mycoplasma (MycoAlert

™, Lonza).

Plasmid konstruerer og stabil transfektion

Kloner af eGFP-mærket miExpress

™ precursor miRNA af miR -205 (cat # HmiR0026-MR04) og mIR-373 (cat # HmiR0347-MR04) og tilsvarende precursor miRNA scrambled kontrol klonen (mIR-c) for vektor pEZX-MR04 (cat # CmiR0001-MR04) samt kloner af mCherry -mærket miArrest

™ miRNA hæmmere af miR-205 (α-miR-205, cat # HmiR-AN1314-AM02), miR-373 (α-miR-373, cat # HmiR-AN0461-AM02) og tilsvarende miRNA inhibitor scrambled kontrol klon (α-mIR-c) for vektor pEZX-AM02 (cat # CmiR-AN0001-AM02) blev opnået fra GeneCopoeia (Rockville, USA). Plasmider (EndoFree Maxi, Qiagen) af miRNA blev stabilt transficeret i enterocytterne-lignende Caco-2

WT og miRNA-inhibitorer i carcinoma-lignende Caco-2

D299G hhv. Transfektion blev udført på en Poly-D-Lysin coated 12-brønds plade under anvendelse af 1 ug plasmid /brønd (Lipofectamin LTX, Thermo Fisher). Stabile subkloner blev udvalgt med 1 pg /ml blasticidin og 1-3μg /ml puromycin (InvivoGen). 14-34 subkloner pr plasmid blev ekspanderet og screenet for eGFP /mCherry ekspression ved fluorescensmikroskopi. Blandt de 2-7 resterende kandidater pr plasmid blev individuelle subkloner valgt ud fra bedste ekspressionsniveauer af modent miR-205 og miR-373 bruger qPCR-analyse.

Før eksperimenter, celler (0,7-3 x 10

5/2 ml) blev dyrket i 8 dage, medmindre andet er angivet. Konditionerede medier fra Caco-2

D299G blev koncentreret ved hjælp Amicon Ultra-4 (3 kDa) centrifugalfilter Units (Millipore) og inkuberes med Caco-2

WT i 18 timer.

CD-1

nu /nu

xenograftmodel

Female CD-1

nu /nu

mus (Charles River) blev anbragt under strenge specifikke patogenfrie forhold på Central Animal Facility, University Hospital Essen, Tyskland. Protokoller overholdt den tyske lov til brug af levende dyr og undersøgelsen blev godkendt af Nordrhein-Westfalen statslige agentur for Natur, miljø og forbrugerbeskyttelse. blev udført Xenografting eksperimenter, som tidligere beskrevet [35]. Under isofluran-induceret anæstesi, CD-1

nu /nu

mus (

n

= 4) i alderen ca. 7 uger blev injiceret

s

.

c

. i flankerne med suspensioner af 1 x 10

6 enkelt celler i 200 pi høj koncentration Matrigel

® /PBS (1: 1). Mus blev injiceret

jeg

.

s

. (0,5 mg i 500 pi) hver 5

th dag med polyklonalt anti-asialo GM1 antistof til fjerne naturlig dræbercelleaktivitet. Tumorer blev målt med digitale skydelærer og tumor volumen (

V

) blev beregnet ved hjælp af formlen:

V

= 0,4 x

en

x

b

2 [

en

: længde;

b

: bredde]. Alle mus blev aflivet ved cervikal dislokation. Tumorer blev udskåret efter 11 eller 23 dage fra dræbte mus, gennemskæres, formalin-fikseret og paraffin-indstøbt, og tværsnit (5 um) blev plettet. blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser og til at reducere antallet af dyr, der anvendes.

RNA /miRNA ekstraktion og realtime qPCR ekspressionsanalyse

Cell prøver blev frosset i trizole (RNA) eller Qiazol ( miRNA) ved -80 ° C. Totalt RNA fra celler blev ekstraheret (RiboPure Kit, Thermo Fisher Scientific) og oprenset (RNeasy Kit, Qiagen). miRNA blev isoleret under anvendelse af miRNeasy Kit (Qiagen). FFPE vævsprøver blev skåret i 10 um tykke sektioner efter macrodissection (at berige for regionen af ​​interesse indhold, som nødvendigt). miRNA blev ekstraheret fra en til seks sekventielle sektioner fra den samme paraffinblokken hjælp af miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) med afparaffineringstrinnet opløsning (Qiagen), i henhold til fabrikantens instruktioner. miRNA (1 ug) blev transkriberet til cDNA under anvendelse af miScript II RT Kit (Qiagen). Realtime qPCR analyse blev udført ved anvendelse af et-trins QuantiFast SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen) om “Mastercycler ep realplex

2″ (Eppendorf) realtime forstærkersystem. QuantiTect Primer Assays (Qiagen) blev anvendt som gen-specifikke primerpar. miRNA ekspressionsniveauerne blev analyseret ved hjælp miScript Primer Analyser (Qiagen) med miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) på “Mastercycler ep realplex

2″ real-time system. Kopier antal individuelle udskrifter var relateret til GAPDH (mRNA) eller RNU6 (miRNA) som endogene kontroller (x /100.000 eksemplarer) og normaliseret som angivet.

Protein analyse ved immunoblotting

Proteiner blev isoleret fra dyrkede celler i iskold lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X (Thermo Fisher Scientific) suppleret med PhosSTOP phosphatase /komplet Mini proteasehæmmer blanding tabletter og 1 mM PMSF ( Roche)). Immunoblotting blev udført som tidligere [36] beskrevne. For at bekræfte lige protein lastning, blev geler farvet med SimplyBlue (Thermo Fisher Scientific) og blot blev testet igen med anti-GAPDH. Repræsentative blots af mindst 2 uafhængige forsøg er vist.

ELISA

Koncentrationer af CHI3L1 og TFPI i cellekultursupernatanter blev bestemt under anvendelse af human chitinase-3-like 1 og vævsfaktorinhibitoren Quantikine ELISA kits (R 0,05 blev betragtet som signifikant. Alle data er udtrykt som middelværdi ± SEM.

Resultater

Expression niveauer af miR-205 og miR-373 er ​​steget i mucin-producerende humane tyktarmskræft

Vi undersøgte den rolle miR-205 og miR-373 i patofysiologien af ​​forskellige histologiske undertyper af kolorektal cancer ved at vurdere deres udtryk, sammen med andre miRNA, med enheder af konventionelle, mucinøs og UC-associerede menneske colon adenocarcinom. Kun matchede tumorvæv med tilstødende ikke-neoplastiske, normale kirurgiske margener (R

0) af hver patient blev undersøgt. Ekspressionsniveauer af MIR-205 og MIR-373 blev specifikt steget i de to undergrupper af colon-adenokarcinom forbundet med mucinproduktion (mucinøse og kroniske UC-relaterede tarmkræft) i forhold til tilstødende normale colon-mucosa (Fig 1A og 1B). Notatet udtryk for miR-205 var lidt højere i UC-associeret cancer sammenlignet med (ikke-UC) mucinøs kræft. Ingen signifikante forskelle i MIR-205 og MIR-373-ekspression blev identificeret i parret colon tumorvæv og tilsvarende normale slimhinde fra patienter med konventionelle colon adenocarcinom (ikke-mucinøs). Begge miRNA var lige udtrykt ved lave niveauer på tværs af tumor-fri colon væv mellem de tre patientgrupper undergrupper. I modsætning hertil MIR-1, MIR-10a og MIR-133a blev nedreguleret i humane CRC tumorvæv, uanset den histologiske subtype (S1A, S2A og S3A figurerne).

Ekspressionsniveauer af (A) miR- 205 og (B) miR-373 er ​​signifikant opreguleret i human mucinøs (

n

= 20) og kronisk UC (

n

= 13) CRC tumor områder sammenlignet med matchede R

0 margener, bestemt ved qPCR. I modsætning hertil er ikke observeret nogen signifikante forskelle i miR-205 og miR-373 udtryk mellem parret konventionelle CRC (

n

= 18) tumorvæv og tilsvarende normale slimhinde. (C) Mens enterocytterne-lignende Caco-2

WT vise lave niveauer af miR-205 og miR-373 udtryk begge miRNA er betydeligt opreguleret i kolon carcinoma-lignende Caco-2

D299G celler, som vurderet af qPCR . (D) Transfektionseffektivitet af MIR-205 /MIR-373 precursorer eller inhibitorer bekræftes af qPCR i nyligt genererede (se materialer og metoder) Caco-2

WT /MIR-205, Caco-2

WT /miR -373, Caco-2

D299G /a-mIR-205 og Caco-2

D299G /α-mIR-373 kloner (n = 3 pr klon). Resultater er vist i forhold til RNU6 miRNA ekspression. Data er præsenteret som betyder ± SEM (ns: ikke signifikant, *

s

0,05, **

s

0,01, ***

s

0.001, ****

s

0,0001, A, B: Wilcoxon-test for sammenligninger mellem matchede grupper (R

0 vs. tumor), ellers uparret t-test; C, D:. uparret t-test)

Klinisk mucinøse tyktarmskræft vises en mere progressiv tumor stadie fordelingen ved første diagnose sammenlignet med konventionel eller UC-associeret CRC (tabel 1). Fremskreden sygdom med fjernt orgel metastase på tidspunktet for diagnosen blev observeret hyppigere i CRC patienter med mucinøs undertype end hos patienter med konventionelle eller kroniske UC tumorer. Men vi ikke identificere eventuelle sammenhænge mellem miR-205 og miR-373 ekspressionsniveauerne og kræft stadier (herunder histologiske klasse) i nogen undertype.

Angivelse af miR-205 og miR-373 opreguleres i colon carcinoma celler

in vitro

Næste, vi havde til formål at bestemme virkningerne af miR-205 og miR-373 om cellebiologi og funktion i normalt og neoplastisk tarmepitel

in vitro

. Vi har tidligere etableret to

in vitro

modeller for humane polariserede, enterocytterne-lignende (Caco-2

WT) og udifferentieret, colon carcinom-lignende (Caco-2

D299G) celler [35 ], som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. Ved hjælp af realtime qPCR, fandt vi (Fig 1C), som Caco-2

WT viste lave niveauer af miR-205 og miR-373 udtryk, mens begge miRNA var signifikant opreguleret i Caco-2

D299G. Desuden miR-1, miR-10a og miR-133a blev markant nedsat i Caco-2

D299G forhold til Caco-2

WT (S1B, S2B og S3B Fig). Vi screenede også andre CRC linjer, men de undlod at afsløre miRNA ekspressionsmønstre ligner dem observeret i humant colon væv (S4 Fig). Vi besluttede at gå videre ved hjælp af disse IEC underlinjer (Caco-2

WT og Caco-2

D299G), fordi de ideelt spejlet vores miRNA udtryk resultater af parrede normale og mucinøse kolorektale adenocarcinom prøver fra patienter.

Brug stabil transfektion med miRNA precursorer eller inhibitorer, vi genereret (se Materialer og fremgangsmåder) mIR-205-udtrykkende og mIR-373-udtrykkende Caco-2

WT kloner (Caco-2

WT /mIR-205; Caco-2

WT /mIR-373) samt mIR-205-hæmmende og mIR-373-inhiberende Caco-2

D299G kloner (Caco-2

D299G /α-mIR-205; Caco -2

D299G /α-miR-373). Som negative kontroller krypterede vektor-udtrykkende kloner blev anvendt (Caco-2

WT /MIR-c; Caco-2

D299G /α-MIR-c). Den overudtrykte pre-miR-205 og præ-miR-373 lykkedes behandles for at øge ekspressionen af ​​moden miR-205 og miR-373 i Caco-2

WT henholdsvis, hvilket bekræftes af qPCR-analyse (Fig 1D). Overekspression af miR-205- og miR-373- hæmmere medførte nedsat ekspression af moden miR-205 og miR-373 i Caco-2

D299G.

miR-205 inducerer øget mucinproduktion, mens mIR-373 forårsager dedifferentiering

Som vist i fig 2A-2D, kontrol klonen Caco-2

WT /mIR-c viste en søjleformet monolag af normale, polariseret IEC med regelmæssige mucinproduktion, mens kontrolgruppen klon Caco-2

D299G /α-mIR-c viste en udfladet monolag af neoplastiske, udifferentierede celler med mindre mucinproduktion. Stabil overekspression af MIR-205 i Caco-2

WT induceret dannelse af sekretoriske celler indeholdende store vesikler med bleg Lucent indhold besætter næsten hele cytoplasmaet (fig 2A). Mucinproduktion blev påvist ved PAS (Fig 2B) og TEM viste store vesikler i den apikale cytoplasma med mindre elektron-tætte materiale (Fig 2C), tyder på mukoide stoffer. Immunofluorescens analyse bekræftede øget produktion af MUC2 i Caco-2

WT /MIR-205 (Fig 2D). I modsætning hertil overekspression af MIR-373 i Caco-2

WT inducerede træk ved ringe differentierede, heterogene celler, der vokser i flade ark, som lignede neoplastiske Caco-2

D299G /α-MIR-c (fig 2A-2D ). Undertrykkelse af MIR-373 vendt nogle af de neoplastiske karakteristika Caco-2

D299G. Stabil hæmning af miR-373 i Caco-2

D299G førte til organisering af polariserede epitelceller, som lignede differentierede Caco-2

WT /miR-c (fig 2A-2D).

( AD) Caco-2

WT overudtrykker mIR-205 eller mIR-373 display signifikante morfologiske ændringer sammenlignet med kontrolpatienter Caco-2

WT /mIR-c. I modsætning hertil undertrykkelse af MIR-373 reverserer nogle af de neoplastiske karakteristika Caco-2

D299G. Repræsentative billeder (

n

≥ 2 prøver /klon), der viser (A) H hvide pile angiver slim (B) eller MUC2 (D) -positive strukturer.

miR-205 og miR-373 forstyrre tarmens epitel barriere integritet

For yderligere at forstå de morfologiske ændringer induceret af miR-205 og miR-373, vi udførte en række immunfluorescensfarvning eksperimenter til at vurdere virkningerne på strukturel organisering af actincytoskelettet (fig 3A), distribution af barriere-associeret stram junktionel ZO-1 (fig 3B) og phospho- p-catenin (fig 3C) og dannelse af mitotiske spindel (fig 3D). Overekspression af MIR-205 i Caco-2

WT medieret forstyrrelse af actin-baserede cytoskelettet og faldt ekspressionen af ​​ZO-1 i cellemembranen, men ændrede ikke mitotiske figurer. Overekspression af miR-373 i Caco-2

WT forårsagede forstyrrelser og uregelmæssig omfordeling af actinfilamenter, stram forbindelsesepitoper ZO-1 og phosphoryleret β-catenin til cytoplasmaet, hvilket indebærer kompromitteret tarm epitel funktion barriere og hegn. Endvidere forstørrede kerner af Caco-2

WT /MIR-373 afslørede grove forstyrrelser af den mitotiske spindel, sammenlignes med Caco-2

D299G /α-MIR-c. I modsætning hertil hæmning af miR-373 i Caco-2

D299G fremmet epitelial stramning af apikal polarisering af actinfilamenter og re-etablering af ZO-1- og phospho-β-CATENIN- associeret barriere integritet, og dermed reducere mesenkymale fænotype af dårligt differentierede Caco-2

D299G. Bemærkelsesværdigt, Caco-2

D299G /α-MIR-373 viste normale mitotiske metafaser, der kan sammenlignes med Caco-2

WT /MIR-c. Men hæmning af MIR-205 i Caco-2

D299G ikke ændre fibroblastlignende udseende med actin cytoskeletal desorganisering, cytoplasmatisk omfordeling af ZO-1 og afvigende mitotiske figurer.

Ekspression af MIR-205 og mIR-373 differentielt (A) ændrer actin cytoskeletal arkitektur, påvirkninger (B) ZO-1 og (C) phospho-β-catenin-associeret barriereintegritet, og (D) inducerer dannelse af flerkernede celler med multipolære spindler. Repræsentative billeder (

n

≥ 2 prøver /klon) af immunfluorescensfarvning med (A) phalloidin (AlexaFluor

® 647;

hvid

, gul bar, 20.29μm [3-dimensionel afstand ], hvid bar, 100 um), (B) anti-ZO-1 (AlexaFluor

® 647;

hvid

, bar, 50 um) og DAPI (

blå og), (C ) phospho-β-catenin (AlexaFluor

® 647;

grøn

, bar, 50 um) og DAPI (

rød

) og (D) anti-phospho-histon H3 (PacificBlue <