PLoS ONE: Gentagelse af første trin tyktarmskræft forudsagt af Expression Mønster af cirkulerende microRNAs

Abstrakt

Systemisk behandling af patienter med debuterende kræftformer forsøg på at udrydde okkult metastatisk sygdom til at forhindre gentagelser og øget sygelighed. Imidlertid er forudsigelse af tilbagefald af en analyse af den primære tumor begrænset, fordi disseminerede cancerceller kun en lille delmængde af den primære læsion. Her analyserer vi udtryk for cirkulerende microRNA (Mirs) i serum opnåede præ-kirurgisk fra patienter med tidlig stadie kolorektal kræft. Grupper af fem patienter med og uden tilbagefald blev anvendt til at identificere en informativ panel af cirkulerende Mirs hjælp kvantitativ PCR af hele genomet miR ekspression samt et sæt af offentliggjorte kandidat Mirs. Et panel af seks informative Mirs (miR-15a, mir-103, miR-148a, miR-320a, miR-451, miR-596) blev taget fra denne analyse og vurderet i et særskilt validering sæt af tredive patienter. Hierarkisk gruppering af ekspressionsniveauerne af disse seks cirkulerende Mirs og Kaplan-Meier analyse viste, at risikoen for tilbagefald af tidligt stadium tyktarmskræft kan forudsiges ved denne panel af Mirs der er målbare i cirkulationen på tidspunktet for diagnosen (P = . 0,0026; Hazard Ratio 5,4; 95% CI på 1,9 og 15)

Henvisning: Shivapurkar N, Weiner LM, Marshall JL, Madhavan S, Deslattes Mays A, Juhl H, et al. (2014) Gentagelse af første trin tyktarmskræft forudsagt af Expression Mønster af cirkulerende microRNA. PLoS ONE 9 (1): e84686. doi: 10,1371 /journal.pone.0084686

Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA

Modtaget: August 19, 2013; Accepteret: November 18, 2013; Udgivet: 6 Januar 2014

Copyright: © 2014 Shivapurkar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev delvist understøttet af NIH tilskud CA108440 (AW), P30 CA051008 (LW), HHSN2612200800001E (SM), den Lombardi Cancer center (NS) og Ruesch center (NS, JLM, SM, og AW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. En af forfatterne (Dr. Juhl) er affiliatiated Indivumed, GmbH. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer og giver ikke en interessekonflikt.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje førende årsag til kræft dødelighed, der påvirker mænd og kvinder lige. Worldwide tegner sig for cirka en million nye kræft og en halv million dødsfald, der repræsenterer 10 procent af kræftdødsfald [1]. Resultater for patienter med tidlige fase CRC er heterogene, med sygdomsspecifikke 5-årige overlevelsesrater for patienter med stadie II i 72-88% og 40-71% for fase III [2]. De fleste patienter med stadie II-sygdom er helbredt ved kirurgi alene, mens yderligere kemoterapi kan give overlevelse fordele for patienter med senere sygdom. Alligevel vil ca. 1 ud af 4 patienter med tidligt stadie sygdom lider tilbagefald og biomarkører, der identificerer patienter med høj risiko på tidspunktet for første diagnose og kirurgi ville gøre det muligt at vælge de patienter for tættere overvågning og muligvis systemiske behandlinger ([3], [ ,,,0],4], [5]. revideret for nylig i [6])

microRNA (miRNA eller Mirs) er små, ikke-kodende RNA, som spiller en væsentlig rolle i at kontrollere aktiviteterne i cellulære veje både i fysiologi og patologi (se f.eks [7]). Den tydelige funktion af Mirs i forskellige cancertyper er blevet mere indlysende i de senere år [8], [9], og mange undersøgelser viser, at MIR signaturer kan anvendes til at skelne mellem forskellige cancere [10], [11], [12], [13], prognoser [14], [15], afslører potentielle mål [16], ændrede signalveje [17], eller ondartet progression fra in situ carcinom til invasiv sygdom [18]. Mest overraskende, en sammenligning af MIR og mRNA profiler af primære og metastatiske cancer læsioner viste, at Mirs giver en mere pålidelig og karakteristisk signatur end mRNA’er og fandt, at MIR signaturer var bedre mRNA’er identificere organet kilde af metastaser af ukendt oprindelse [19] , [20]. En tidligere undersøgelse [21] ved brug af ekspression profilering af 315 Mirs i væv fra trin II tyktarmskræft viste forskelle i mønstre for tilbagevendende sygdom. Ekspressionsniveauerne af specifikke Mirs i vævene korreleret med sandsynligheden for fornyet overlevelse af multivariat analyse. Disse resultater antyder, at forstyrret ekspression af Mirs i tyktarmskræft kan have en prognostisk potentiale.

Ud over disse analyser af normale og sygdomsramte væv, nyere rapporter har vist, kan detekteres MIR arter i omløb [22] og selv foreslået, at analysen af ​​serumprøver for definerede Mirs kunne anvendes til at identificere patienter med kræft [23], [24], [25], [26]. Undersøgelser af blodbårne miRome viste også anvendelighed til andre end cancer sygdomme ([27], revideret i [28], [29]). Mirs i kredsløbet at være bemærkelsesværdigt stabil [30], [31] og det blev foreslået, at stabiliteten kan henføres til Mirs at indgå i lipoprotein vesikler, kendt som exosomer [32]. Her studerede vi Mirs i blodprøver opnået præ-kirurgisk fra patienter med tidligt tyktarmskræft, der forblev tilbagefald-fri eller havde sygdomstilbagefald. Vi antager, at ændrede mønstre af cirkulerende Mirs kunne tyde en øget risiko for tilbagefald på grund af okkulte metastatiske frø på tidspunktet for første diagnose. Vi rapporterer, at et sæt af seks Mirs kan være nyttig til at forudsige risikoen recidiv for tidlige stadie tyktarmskræft.

Resultater

Sammenligning Cirkulerende microRNA Expression Ved hjælp af en Kandidat Gene Approach

til måling Mirs i kredsløbet, vi etableret kvantitativ RT-PCR [33] som en påvisningsfremgangsmåde med et dynamisk område på op til 10

6 gange for Mirs i serumprøver [18]. Som et indledende tilgang, vi plukket et panel af seksten Mirs, der var blevet vist at være differentielt udtrykte mellem tyktarmskræft og normale colon væv [21], [34], [35]. Vi løb oprindeligt en pilotundersøgelse og analyseret en række serumprøver fra tidlig stadie kolon kræftpatienter, der forblev sygdomsfri (n = 5) eller havde recidiv (n = 5) inden for gennemsnitligt 26 måneder ( 0,05 vs. ingen gentagelse. figur 1A, B). Fig. 2A viser ca. 100.000 gange koncentrationsområde af seksten cirkulerende Mirs analyseret i pilotundersøgelsen. Vi observerede de forventede tendenser i de respektive op- eller nedregulering i nogle af de udvalgte Mirs (dvs. MIR-20, miR-135b, miR-195, miR-320, miR-615). Imidlertid var forskellene ikke statistisk signifikante (fig. 2B). Det er bemærkelsesværdigt, at MIR-320 var en af ​​to Mirs der viste en nedregulering i væv, der var korreleret med dårlig gentagelse overlevelse [21]. Her miR-320 i kredsløbet var cirka to gange lavere hos patienter med sygdom tilbagefald, selv om det nedregulering ikke var statistisk signifikant (Fig. 2B). Ekspressionen af ​​MIR-498, den anden miR fra undersøgelsen i Ref. [21], blev opdaget kun ved meget lave niveauer i kredsløbet og dermed ikke egnet til analysen.

A, fra et pilotstudie med 10 patienter kandidat Mirs prædiktiv for tilbagefald blev identificeret og testet for deres forudsigelse for tilbagefald i en valideringsundersøgelse. B, Kaplan-Meier plot for tilbagefald hos patienter i pilotundersøgelsen. Patienter med recidiv (n = 5) vs ingen gentagelse (n = 5): Chi square 5,47, p = 0,0193; median tid til recidiv = 26 måneder. De Gehan-Breslow-Wilcoxon algoritmer blev anvendt.

Kandidat miR tilgang. Cirkulerende niveauer af 16 Mirs angivet på x-aksen, der var blevet offentliggjort som differentielt udtrykt mellem coloncancer og ikke-maligne colonvæv blev analyseret [21], [34], [35]. Præoperativ serumprøver var fra patienter i pilotundersøgelsen. Patienterne var blevet fulgt for recidiv og de respektive data er i fig. 1B. A, Koncentration af cirkulerende Mirs (i forhold til U6). Bemærk log-skala, der omfatter en række 100.000 gange. B, forhold mellem udtryk mellem patientgrupper. Alhough MIR-20, MIR-195 og MIR-320 viste en ≥2 gange nedregulering, og MIR-135b og MIR-615 a ≥2 gange opregulering i serum fra patienter med tilbagefald, ingen af ​​sammenligningerne nåede statistisk signifikans ved ANOVA (p 0,05).

Cirkulerende microRNA Expression Sammenligning ved hjælp af en Uvildige, genom-dækkende analyse

af ovenstående pilotundersøgelse vi udvalgt to patientprøver fra gentagelse-fri ( NRec) og recidiv (Rec) gruppe for en fordomsfri genom-dækkende miR-analyse. Vi plukket patienter fra oven pilotundersøgelse den, der havde vist den mest forskellen udtryk for kandidat Mirs. Vi ræsonnerede, at en sammenligning inden for en sådan prøve par kan tilbyde en større chance for optagning tilbagefald-specifikke Mirs. Vi analyserede dette par patientprøver vha SYBR Green qPCR baserede genom-dækkende mir udtryk arrays til 760 Mirs oprettet i vores laboratorium, anvendelse af kommercielt tilgængelige reagenser (SBI, Bjergudsigt CA). Den respektive resultat for top 70 Mirs er vist i fig. 3 som en Heatmap. For en uafhængig validering studie vi valgt fra dette panel seks Mirs der mødtes to kriterier: (1) tilstrækkelige niveauer af udtryk i serumprøver, dvs. RT-PCR Ct værdier ≤32 og (2) differentiel udtryk ( 3 gange up- eller nedregulering) af en given miR sammenligne Rec og NRec prøver.

Heat kort over genom-dækkende microRNA udtryk analyse ved hjælp kvantitativ RT-PCR. To patienter blev udvalgt fra pilotundersøgelsen (se fig. 1 og 2). Den miRNA udtryk analyse blev udført for 760 miRNA bruger qPCR-baserede udtryk analyse. Data, filtrering og analyse blev udført, og de 70 Mirs, der viser den største forskellen udtryk er repræsenteret i varmen kortet.

Validering af cirkulerende microRNA Expression Mønstre som Predictor for tilbagefald

for at vurdere, om de cirkulerende Mirs identificeret i ovenstående pilotundersøgelse kan forudsige sygdom tilbagefald hos patienter med lav risiko, vi brugte en separat, uafhængig gruppe af tredive patienter med tidlig fase tyktarmskræft med kendte resultater. Femten af ​​disse patienter havde tilbagefald inden for gennemsnitligt 25 måneder, mens den anden femten forblev gentagelse-fri. De kliniske karakteristika for patienterne i denne validering indstillet på tidspunktet for deres første diagnose er givet i tabel 1. På tidspunktet for diagnosen de to grupper af patienter uden og med tilbagefald viste ingen signifikante forskelle med hensyn til alder, køn, tumorstørrelse , tumor stadium, hvor deres primære læsion eller histopatologi (tabel 1). Alle patienter havde node-negative sygdom og mere end tolv lymfeknuder undersøgte. Kun en patient (i den ikke-tilbagevendende gruppe) var en T4, alle andre var T1 til T3 tumorer og således med en lav kendt risiko for tilbagefald.

Ekspression af de seks Mirs afledte identificeret i pilotundersøgelse blev målt ved QRT-PCR, og de resulterende data er vist som rå Ct-værdier samt et koncentrationsområde i fig. 4A (venstre og højre akser henholdsvis). Koncentrationen af ​​de seks udvalgte Mirs i kredsløbet dækker en rækkevidde på ca. 1.000 gange, og dermed en 100 gange snævrere område end Mirs overvåget i pilotundersøgelsen (sammenlign fig. 4A og 2A). En korrelationsanalyse af de data, viste en stærk korrelation af ekspressionsniveauerne af miR-15a, miR-148a, miR-320a og miR-451 (r = 0,746 til 0,897; p 0,0001), mens niveauerne af miR-103 og miR- 596 blev ikke korreleret med niveauerne af de andre Mirs. En Principal Component Analysis (PCA) af datasættet viste en tydelig gruppering af patienter med og uden recidiv (fig. 4B) tyder på, at panel af Mirs kan skelne mellem de forskellige gentagelse risici for patienterne.

Validering undersøgelse for seks Mirs identificeret i pilotundersøgelse. Patientkarakteristika er tilvejebragt i tabel 1. Seks Mirs blev afledt fra pilotundersøgelsen. A, Ekspressionsniveauer baseret på tærsklen cyklus (Ct) værdier af QRT-PCR (venstre akse) og miR koncentration beregnet (højre akse). B, Principal Component Analyse af data med de to grupper, der er vist i sort og røde symboler hhv.

En blindet hierarkisk clustering analyse [18] (fig. 5A) viste en signifikant Underindstilling i to forskellige grupper . Tretten af ​​femten patienter med recidiv og elleve af femten patienter, der var en gentagelse-fri var korrekt klassificeret af Mirs i blodprøver før deres første operation (p = 0,0025; odds ratio = 17,9;. Rel risiko = 5,5, 95% CI = 1,5 til 20.7). En Kaplan-Meier analyse af gange til tilbagefald hos patienter tildelt høj eller lav risiko ved hierarchival klyngedannelse viste en signifikant forskellig udfald mellem de to grupper (P = 0,0026, fig. 5B). Således kan de seks Mirs udvalgte her bruges til at forudsige risikoen for tilbagefald af tidligt stadium, lav risiko tyktarmskræft ved analyse af en blodprøve på tidspunktet for den første diagnose.

A, Hierarkisk gruppering af patienter fra valideringen undersøgelse lave og høje grupper risikopræmier baseret på serum MIR-niveauer. Analysen resulterede i en adskillelse i to grupper. B, Kaplan-Meier plot af patienter forudsiges at have høj og lav risiko for tilbagefald. Sammenligningen resulterede i P = 0,0026, Hazard Ratio 5,4 (1,9-15,0 95% CI). I panelet A patienter med tilbagefald er # 1 til # 15 og uden tilbagefald:. # 16 til # 30

Diskussion

Den aktuelle undersøgelse vurderer den mulige anvendelse af cirkulerende microRNA ( Mirs) for at identificere tyktarmskræft patienter med høj risiko for tilbagefald på trods af en diagnose af tidlig fase, lav sygdomsrisiko angivet med etablerede tumor iscenesættelse. Dette kunne hjælpe med at identificere de personer, der vil drage fordel af et tættere overvågning og /eller supplerende systemisk terapi og ville undgå over behandling af patienter, der ikke vil gavne på grund af deres lave risiko (revideret for nylig i [6]). Analysen kan gøres med en lille mængde ( 1 ml). Serum

Oprindelsen af ​​cirkulerende Mirs har været genstand for debat. Tumor-associerede Mirs fundet i cirkulationen kan naturligvis skyldes tumor celledød samt fra aktiv frigivelse af tumorceller. Desuden kan Mirs pakket i beskyttende bærere såsom exosomer blive leveret til modtagende celler, hvor de udøver gendæmpning gennem den samme mekanisme som cellulære Mirs [36], eller kan kaste i kredsløbet. Endvidere er secernerede Mirs blevet antaget at være involveret i mediering af celle-celle-kommunikation. Også vælge sæt Mirs frigives ved cancerceller, og sammensætningen af ​​disse sæt af Mirs er blevet relateret til malignitet [37]. Selvom cancerassocierede cirkulerende Mirs er kan afledes af cancerceller selv, immune eller andre stromale celler i tumormikromiljøet samt andre organer, der reagerer på signaler fra tumoren er mulige kilder [38]. Således kan immunceller udskiller cancerassocierede Mirs og dermed fremme eller inhibering af proliferation, invasion og apoptose [38], [39] og dysregulering af disse Mirs kan være en vigtig forbindelse mellem immunitet og cancer. Selv om nogle undersøgelser fundet parallelle tendenser mellem cirkulerende Mirs og væv Mirs (fx [18], [24]) andre foreslår, at ikke alle de frigivne Mirs afspejler miR overflod i tumorceller (fx [37], [40]). Generelt er Mirs detekteres i kredsløbet fra forskellige organer og fysiologiske regulering eller patologiske ændringer vil ændre udtrykket mønstre af cirkulerende Mirs (for seneste eksempler og anmeldelser se Refs. [29], [41], [42], [43 ]).

ved analysen Mirs i den aktuelle undersøgelse én efter én i stedet for i en multivariat analyse blev fundet to Mirs differentielt udtrykt i kredsløbet, dvs. mIR-103 (nedreguleret) og mIR-596 (opreguleres). MIR-103 var signifikant nedreguleret (p = 0,038) i blodprøver fra patienter med tilbagefald sammenlignet med tilbagefald-fri patienter (fig. 4A). I tarm kryptceller miR-103 er en del af G1 /S overgang regulatoriske netværk under IGF-1 stimuleret proliferation og dette peger på en væsentlig rolle i cellevækst og overlevelse [44]. I modsætning hertil var miR-596 signifikant opreguleret (p = 0,0012) i blodprøver fra patienter med recidiv. Ekspression af MIR-596 var korreleret med ringe overlevelse af patienter med ependymoma [45], men blev inaktiveret i HCC [46] og nedreguleret i pancreas adenocarcinom [47]. Således er der ingen klare beviser endnu at forbinde væv ekspression af denne miR til en distinkt funktionalitet, som ville forbinde den til sygdomsprogression. Mirs med kun små overordnede ændringer mellem patientgrupperne var miR-148a, som er en del af en gruppe af negative regulatorer af proinflammatoriske gener i myeloide celler [48], men er faldet i bugspytkirtelkræft væv [18], udtrykt ved høje niveauer i leveren væv [49] og på leverskade [50]. miR-320a blev rapporteret tidligere som en lovende indikator for ondartet progression i tyktarmskræft [25] selvom vi ikke se en klar indikation af virkningen af ​​miR-320 ændringer på egen hånd i denne undersøgelse. MIR-15a kan forårsage apoptose [51] og er blevet rapporteret at deltage i reguleringen af ​​tumor-stromal krydstale i prostatacancer [52] samt mediere proangiogene veje i iskæmi-associeret patologi [53]. Interessant nok blev MIR-451 karakteriseres som en cirkulerende indikator for tilstedeværelsen af ​​brystcancer [54] og blev vist at blive selektivt frigivet fra transformerede brystkirtler epiteler og bidrage til ændret følsomhed over for kemoterapeutiske eller endokrine målrettede lægemidler i brystcancer (oversigt i [ ,,,0],55]). Det er fristende at spekulere, at de cirkulerende Mirs identificeret her som indikatorer for risikoen for tilbagefald kan bidrage til processen ved at påvirke tumorcelleoverlevelse, tumor stromale interaktioner, angiogenese eller inflammatoriske celle responser på de okkulte metastaser.

Konklusion

risikoen for fornyet tidligt tyktarmskræft kan forudsiges ved at overvåge Mirs i patient blodprøver på tidspunktet for den første diagnose.

Materialer og metoder

miR Detection og kvantificering i blodprøver

indsamling og brug af biospecimen blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) for Georgetown University i henhold til protokol # 2007-345 senest på 2012/10/24. Alle patienter underskrive en samtykkeerklæring tillader anvendelse af donerede væv og krop væskeprøver. De samtykke formularer og deres indhold blev gennemgået og godkendt af IRB. Serumprøver ( 1 ml) blev behandlet efter fjernelse af personlige identifikatorer. miR isolation blev beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt blev serumprøver blandet i et forhold på 1:10 med Qiazol lysis reagens og vortexet. Lysatet blev ekstraheret med CHCI3, og den vandige fase blev yderligere behandlet for total RNA under anvendelse af miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) og beriget for miR hjælp af RT2 qPCR-Grade miR Isolation Kit, MA-01 (SABiosciences).

Dataanalyse

PCA og hierarkisk klyngedannelse blev udført på grundlag af den gennemsnitlige centreret og skaleret mir ekspressionsniveauerne. De klyngedannelse metoder XLSTAT (Addinsoft Inc.) i Excel (Microsoft Inc.) på OSX 10.7.5. Disse fremgangsmåder muliggør beregning af signifikans mellem de hierarkiske klynger og udlede p-værdier under anvendelse af Fishers eksakte test. Prism 5.0 (Graphpad) software blev anvendt til andre tests og visning af data.

Tak

Vi ønsker at anerkende Daksnapriya Balasubbramanian, Anju Preet og Ryan Navarro (alle på Georgetown University) for teknisk hjælp. Drs. Daniel F. Hayes (U Michigan, Ann Arbor), John M. Jessup (National Cancer Institute, Bethesda) Michael B. Atkins, Stephen Byers og Beppe Giaccone (alle på Georgetown University) læse udkast af manuskriptet og forudsat kommentarer og forslag til den dataanalyser og fortolkning.