PLoS ONE: Tyrosin 23 phosphoryleringsafhængige Cell-Surface Lokalisering af Annexin A2 er nødvendig for invasion og metastaser af kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

aggressivitet af pancreas ductal adenocarcinom (PDA) er kendetegnet ved sin høje metastatisk potentiale og mangel på effektive behandlingsformer, som er resultatet af en manglende forståelse af de involverede i at fremme PDA metastaser mekanismer. Vi identificerede Annexin A2 (ANXA2), et medlem af Annexin familien af ​​calcium-afhængige phospholipid-bindende proteiner, som et nyt molekyle, der fremmer PDA invasion og metastaser. Vi fandt ANXA2 at være en PDA-associeret antigen genkendt af efterbehandling sera fra patienter, som viste forlænget overlevelse efter behandling med en PDA-specifik vaccine. Celleoverflade ANXA2 stiger med PDA udvikling og progression. Knockdown af ANXA2 udtryk ved RNA-interferens eller blokering med anti-ANXA2 antistoffer inhiberer

in vitro

invasion af PDA celler. Derudover efter vaccination patientsera inhiberer

in vitro

invasion af PDA-celler, hvilket antyder, at terapeutiske anti-ANXA2 antistoffer induceret af vaccinen. Endvidere celle-overflade lokalisering af ANXA2 er tyrosin 23 phosphorylering-afhængig; og tyrosin 23 phosphorylering kræves til PDA invasion. Vi viste, at tyrosin 23 phosphorylering resulterer i overfladeekspression af ANXA2 er påkrævet for TGFp-inducerede, Rho-medierede epithelial-mesenchymal overgang (EMT), der forbinder den cellulære funktion af ANXA2 som tidligere blev vist at være associeret med små GTPase-regulerede cytoskelet-omlejringer , til EMT-processen i PDA. Endelig ved hjælp af musen PDA modeller, viste vi, at shRNA knock-down af

ANXA2

, en mutation ved tyrosin 23, eller anti-ANXA2 antistoffer inhiberer PDA metastaser og forlænge musenes overlevelse. Således ANXA2 er en del af en roman molekylær pathway underliggende PDA metastaser og et nyt mål for udvikling af PDA terapi

Henvisning:. Zheng L, Foley K, Huang L, Leubner A, Mo G, Olino K, et al. (2011) Tyrosin 23 Phosphorylering-afhængig celle-Surface Lokalisering af Annexin A2 er nødvendig for invasion og Metastaser af kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 6 (4): e19390. doi: 10,1371 /journal.pone.0019390

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: Marts 4, 2011; Accepteret: 28 marts 2011; Udgivet: 29 April, 2011

Copyright: © 2011 Zheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af NCI SPORE i Gastrointestinal Cancers P50 CA062924-14 (EMJ), Lustgarten Foundation (EMJ), Broad Foundation (EMJ), NCI R01 CA88058 (EMJ), Viragh Foundation, NIH 1K23 CA93566-01A1 (DL), ASCO Young Investigator Award (LZ), NIH 5T32 CA0090701-28 Training Grant (LZ), Sol Goldman kræft i bugspytkirtlen center (LZ). Dr. Jaffee er den første modtager af Dana og Albert “Cubby” Broccoli Begavet professorat. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Jeg har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: Under en licensaftale mellem BioSante og Johns Hopkins University, er universitetet berettiget til milepælsbetalinger og royalties på salg af vaccinen produkt er beskrevet i dette manuskript. Vi har ikke andre relevante interessekonflikter skal offentliggøres. P. Illei har givet et foredrag sponsoreret af Leica Microsystems. Dette ændrer ikke vores tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDA) er fortsat en dødelig cancer med en samlet 5-års overlevelse på 5% [1]. Manglende evne til at diagnosticere tidligt, høj metastatisk potentiale, og medikamentresistens konto for sin lave overlevelsesrate. Selvom det er veletableret, at patogenesen af ​​PDA’er følger trinvise faser, der viser stigende cellulære atypi og ophobes klonale mutationer eller afvigende ekspression af onkogener eller tumorsuppressorgener såsom

K-Ras

,

p16

,

p53

,

og DPC4 /Smad4

[2], har lægemidler rettet mod disse molekylære abnormiteter endnu ikke oversat til forbedrede kliniske respons [3]. Den aggressive natur PDA er featured ved sin høje forekomst af metastaser på tidspunktet for første diagnose og høj forekomst af tidlig metastaser efter kirurgisk resektion. Men lidt om de molekylære mekanismer bag invasionen og metastatiske processer. En bedre forståelse af disse mekanismer er afgørende for udviklingen af ​​innovative og forbedrede behandlinger for PDA.

Kræft immunterapi behandling tilgange er under udvikling til PDA. Vi udviklede en allogen, granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) secernerende PDA vaccine til patienter med PDA [4], [5], [6]. Fase I og II forsøg, der vurderer denne vaccine til patienter med opereret PDA demonstrerede både kliniske og immunologiske responser [4], [5]. Denne immunterapi tilgang leveres immuniserede lymfocyt reagenser til at identificere nye PDA-antigener, der er ved at blive testet som mål for PDA terapi [7], [8]. De potentielle terapeutiske targets identificeret hidtil har også givet vigtige spor til studiet af molekylære mekanismer bag PDA udvikling og metastaser. Her rapporterer vi anvendelsen af ​​en funktionel proteom tilgang, der er konstateret Annexin A2 (ANXA2) som ny kandidat PDA mål for immunresponset. Desuden viser vi, at tyrosin 23 fosforylering-afhængig celle-overflade lokalisering af Annexin A2 er nødvendig for epitelial til mesenkymale overgang, invasion, og metastaser dannelse af PDA’er.

Resultater

Identifikation af ANXA2 som en ny kandidat PDA tumor-associerede antigen og biomarkør

Vi brugte immuniserede sera fra to emner, som demonstrerede både tegn på post-vaccination cellulære immunreaktioner og forlænget sygdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS) i en fase II undersøgelse af en GM-CSF secernerende hel celle PDA-vaccine [4] til at screene helcelleekstrakter fra PDA-vaccine cellelinier, som tjente som proteom. Proteinekstrakter blev separeret ved en todimensional elektroforese (2-DE); og immunoblotanalyse blev udført for at sammenligne antigen genkendelse af før og efter vaccination sera. Proteiner er anerkendt af post-vaccination sera i forhold til at pre-vaccination sera blev identificeret ved massespektrometri. ANXA2 var et protein identificeret på de post-vaccination sera immunoblots af både patienter evalueret. For yderligere at vurdere forekomsten af ​​post vaccination humorale reaktioner på ANXA2 blev oprenset rekombinant ANXA2 anvendt til screening før vaccination og efter vaccination sera fra 16 yderligere patienter behandlet i denne fase II studie af både ELISA og Western blot (fig S1). Vaccine-induceret anti-ANXA2 antistoffer, målt ved en sandwich-ELISA, blev påvist i 6 af 7 patienter, der demonstrerede en DFS mere end 36 måneder [4], og kun i en af ​​de andre 9 patienter, som ikke udviser langsigtet DFS ( tabel 1). Disse data giver den første bevis på, at ANXA2 er et antistof mål for immunresponser mod PDA.

ANXA2 er rapporteret at være overudtrykt i en række forskellige cancere, herunder PDA sammenlignet med normale væv [9]. Men ANXA2 er normalt en cytoplasmatisk og luminale bosat protein i bugspytkirtlen væv, og tidligere undersøgelser [9] har ikke bestemt, om celleoverfladen ANXA2 udtryk er en dominerende mønster i PDA væv. Derfor analyserede vi placeringen af ​​ANXA2 udtryk ved immunhistokemi (IHC) i de resektion tumorer fra 52 af de 60 patienter, der blev behandlet i vores fase II studie, for hvem prøver var tilgængelige for farvning. Vi fandt, at normale pancreas duktale epitelceller viser svag cytoplasmatisk og luminale farvning ved IHC, mens celle-overflade lokaliserede ANXA2 stiger med progression fra Panin læsioner Invasiv PDA (Figur S2). Specifikt har 39 (75%) af 52 friske pankreastumor vævsprøver testede forøget celleoverfladeekspression af ANXA2 (figur S2). Disse data yde yderligere støtte, at ANXA2 overflade udtryk er forbundet med PDA udvikling og som sådan kan tjene som en immunologisk mål.

Hæmning af ANXA2 undertrykker

in vitro

invasion af PDA celler

Derefter undersøgte vi, hvorvidt celleoverfladen lokalisering af ANXA2 spiller en biologisk rolle for fremme PDA invasion. ANXA2 er blevet rapporteret at binde membranassocierede phospholipider og har forskellige cellulære funktioner, herunder plasminogen-aktivering, fibrinolyse, membrantransport, cytoskeleton omlejring, angiogenese, celleadhæsion og migrering. ANXA2 fungerer også som en høj-affinitet receptor for flere ekstracellulære ligander, som har været impliceret i cancer udvikling, invasion og metastaser [10], [11], [12], [13]. Til direkte teste, om ANXA2 er involveret i PDA invasion, blev ANXA2 ekspression slået ned i PDA-celler ved RNA-interferens (figur 1A). Knock-down af

ANXA2

undertrykt

in vitro

invasion af PDA celler i en Boyden kammer assay (figur 1B og figur S3). Induktionen af ​​antistoffer mod ANXA2 der er observeret i vaccinerede patienter med langvarig DFS (tabel 1) antyder, at anti-ANXA2 antistoffer kan have en direkte antitumorvirkning. Vi testede derfor både kanin polyklonale og monoklonale muse-anti-ANXA2 antistoffer og fandt, at de specifikt kan inhibere

in vitro

invasion af PDA-celler (figur 1C, D). Desuden sera fra immuniserede patienter, der demonstrerede en post-vaccination reaktion på ANXA2 tilsvarende hæmmet

in vitro

invasion af PDA-celler (Figur 1E). Dataene præsenteret hidtil link stigende celleoverfladeekspression af ANXA2 med PDA invasion kapacitet og foreslår, at vaccine-inducerede antistofreaktioner kan hæmme dette aspekt af PDA progression. Men den mekanisme, hvormed ANXA2 medieret PDA invasion sker, er endnu at blive udforsket. Interessant er det invasive kapacitet PDA celler ikke korreleret med deres proliferative rate tyder en uafhængig mekanisme (figur S3). For at afdække andre reguleringsmekanismer, der tegner sig for invasionen kapacitet PDA celler, vi undersøgt yderligere sub-cellulære lokalisering af ANXA2 i forskellige PDA cellelinier ved fluorescerende farvning med anti-ANXA2 antistoffer (Figur S4). ANXA2 overvejende lokaliseret til cellemembranen i alle 8 PDA cellelinjer fundet at have høj invasion kapacitet, hvorimod ANXA2 er til stede overvejende i cytoplasmaet i cellelinier med lav invasion kapacitet (figur S4 og tabel S1). Disse data støtter yderligere en rolle for ANXA2 translokation fra cytosolen til celleoverfladen /membran i styrkelsen PDA celle invasion.

A. Western blot analyse viser, at

ANXA2

siRNA inhiberer ekspression af ANXA2 i en PDA cellelinie. Helcelleekstrakter fra Panc10.05 behandlet med kontrol siRNA og

ANXA2

siRNA henholdsvis blev blottet ved kanin-polyklonalt anti-ANXA2 antistof (øverste panel) og ved kanin-polyklonalt anti-GAPDH-antistof (nederste panel). B.

In vitro

invasion assay viser, at

ANXA2

siRNA hæmmer invasionen kapacitet 10.05 PDA cellelinje. Invaderede celler blev målt ved MTT-assays og normaliseret til total celleantal. C. Polyklonale anti-ANXA2 antistoffer inhiberer invasion kapacitet Panc10.05 celler. D. Mouse anti-ANXA2 monoklonale antistoffer (mAb) inhiberer invasion kapacitet muse Panc02 og humane Panc10.5 celler. For C og D, kanin-anti-ANXA2 antistof, kanin kontrol Ig, muse-anti-ANXA2 mAb (klon: ZO14) eller muse isotype kontrol IgG1 blev tilsat til dyrkningsmediet i en slutkoncentration på 25 ug /ml i hele

in vitro

invasion assays hhv. E. Kun efter vaccination sera fra patienter (3.009 og 3.028), som demonstrerede anti-ANXA2 antistofrespons, men ikke fra patienter (3,037 og 3,039), der ikke demonstrerer anti-ANXA2 antistofrespons, hæmmer invasion af Panc10.05 celler. Før og efter vaccination sera blev tilsat til dyrkningsmediet i et forhold på 1:50. Tredobbelte forsøg blev gjort for B-E.

Phosphorylering af ANXA2 på Tyr23 fremmer celle-overflade lokalisering af ANXA2 og invasionen kapacitet PDA celler

ANXA2 er et substrat for Src kinase, der phosphorylerer ANXA2 på Tyr23 både

in vivo

in vitro

[10], [11], [12], [13], og Tyr23 fosforylering er blevet foreslået at være vigtig for normal celle spredning og forgrening morfogenese [14], [15]. ANXA2 er også rapporteret at være tyrosin-phosphoryleret, når den lokaliseres til celleoverfladen under stress [16]. Eftersom maligne celler ofte efterligner normale celler, der har været udsat for en række stress stimuli, vi postulerer, at ANXA2 translokeres til celleoverfladen som en tyrosin-phophorylated proteinet under tumorgenese samt. For at teste denne, vi eluerede celleoverfladen del af ANXA2 fra Panc10.05 PDA-celler, som har celleoverfladelokalisering af ANXA2 (fig S4 og tabel S1), og fandt celleoverfladen del af den ANXA2 proteinet er i virkeligheden en tyrosin- phosphoryleret protein (figur 2A). I modsætning hertil kunne ANXA2 ikke elueres fra celleoverfladen af ​​Panc 3.11-celler, en PDA cellelinie, der demonstrerede cytoplasmatisk lokalisering af ANXA2 (fig S4). For at teste, om phosphorylering af ANXA2 ved Tyr23 er vigtig for dens lokalisering til PDA celleoverfladen, genereret vi et panel af plasmider der udtrykker enten vildtype ANXA2 (ANXA2

WT), det ANXA2 mutantprotein (ANXA2

Y23A) hvori Tyr23 blev ændret til en alaninrest gør en ikke-phosphorylatable mutant eller den ANXA2 mutantprotein (ANXA2

Y23E), hvor Tyr23 blev ændret til en glutaminsyrerest efterligne konstitutiv phosphorylering. Når Panc10.05 celler blev transficeret med disse plasmider udtrykker ANXA2 tagget af GFP [17], ANXA2

WT-GFP og ANXA2

Y23E-GFP lokaliseret overvejende til celleoverfladen af ​​PDA-celler. I modsætning hertil ANXA2

Y23A-GFP lokaliseret til cytoplasmaet (figur 2B). Disse resultater blev yderligere bekræftet ved hjælp af en lentivirus til konstitutivt udtrykke ANXA2

WT, ANXA2

Y23A eller ANXA2

Y23E i PDA-celler (Figur S4). Taget sammen viser disse data, at phosphorylering på Tyr23 resulterer i lokalisering af ANXA2 på celleoverfladen.

A. Panc10.05 og Panc3.11 celler blev enten inkuberet med EGTA indeholdende puffer eller EGTA-fri buffer. To forskellige elueringer fra to forskellige PDA cellelinier, som indikeret, blev immunpræcipiteret af anti-ANXA2 antistoffer (bane 1-4) eller anti-phosphotyrosin (anti-pTyr) antistoffer (bane 9-12). Efter eluering blev de to PDA cellelinier lyseret, og lysaterne blev immunoprecipated af anti-pTyr-antistoffer (bane 5-8). B. GFP-mærkede ANXA2 i Panc10.05 celler. Øvre paneler: GFP signaler; lavere paneler: overlappede billeder af GFP signaler og DAPI-farvning af kerner. C. FLAG-mærket ANXA2 ekspression i Panc10.05 celler transficeret med pcDNA-baserede plasmid vektor alene (bane 1,5,9,13), plasmidet bærer ANXA2

WT-FLAG (bane 2,6,10, 14), plasmidet bærer ANXA2

Y23A-FLAG (bane 3,7,11,15), eller plasmid, der bærer ANXA2

Y23E-FLAG (bane 4,8,12,16). Hele celleekstrakter (WCE) (bane 1-4), cell membranfraktioner (bane 5-8, 13-16), eller cytoplasmiske fraktioner (bane 9-12) blev isoleret ved biokemisk fraktionering fra Panc10.05 PDA-celler, henholdsvis og immunpræcipiteret under anvendelse af enten anti-FLAG M2-antistoffer (bane 1-12) eller anti-phosphotyrosin-antistoffer (anti-pTyr) (bane 13-16). Immunopræcipitaterne blev blottet under anvendelse af anti-FLAG M2-antistoffer. D.

In vitro

invasion af Panc10.05 celler. E.

In vitro

invasion af Panc3.11 celler. For både D og E, blev celler transficeret med den tomme pcDNA-baseret plasmidvektor (bane 1,2), plasmidet bærer ANXA2

WT-FLAG (bane 3), plasmidet bærer ANXA2

Y23A-FLAG ( bane 4), eller plasmid, der bærer ANXA2

Y23E-FLAG (bane 5). Bane 1 blev også cotransficeret med scramble siRNA kontrol. Banerne 2-5 blev også cotransficeret med

ANXA2

siRNA duplex. Resultater af dobbelte forsøg er vist.

For at afgøre, om ændringen i ANXA2 lokalisering, der opstår som et resultat af Tyr23 fosforylering påvirker invasionen kapacitet PDA celler, et sæt af plasmider, der udtrykker eksogen FLAG-mærket ANXA2 herunder ANXA2

WT-FLAG, ANXA2

Y23A-FLAG, og ANXA2

Y23E-FLAG blev udviklet. Disse vektorer er RNA-interferens resistente på grund af tavse mutationer i siRNA målstedet. Panc10.05 PDA-celler transficeret med disse plasmider blev fraktioneret i cytoplasmatiske og cellemembran fraktioner (figur S4). Vi først bekræftede, at kun ANXA2

WT-FLAG og ANXA2

Y23E-FLAG, men ikke ANXA2

Y23A-FLAG, lokalisere til cellemembranen fraktion (Figur 2C). Som forventet ANXA2

WT-FLAG-proteinet er tyrosin phosphoryleret i fraktion cellemembranen. Dernæst fandt vi, at co-transfektion af pcDNA plasmid, der udtrykker ANXA2

WT-FLAG eller ANXA2

Y23E-FLAG, men ikke ANXA2

Y23A-FLAG, med siRNA (til at hæmme endogene ANXA2), omvendt siRNA-medieret inhibering af invasion af Panc10.05 celler (Figur 2D). Men i celler med lav invasion kapacitet og kun cytoplasmatisk lokalisering af ANXA2, såsom Panc3.11 (tabel S1), co-transfektion med ANXA2

Y23E-FLAG uden om phosphorylering reguleringsmekanisme ved at efterligne konstitutiv phosphorylering og fremmer invasion af Panc3.11 celler (Figur 2E). Disse data antyder, at Tyr23 phosphoryleret ANXA2 giver PDA invasion kapacitet.

ANXA2 bidrager til Epithelial-Mesenchymale Transition of PDA celler

Phosphoryleret ANXA2 spiller en rolle i celle-spredning i normale morfogenese processer [14] , [15]. Vores data hidtil støtte en rolle for phosphoryleret ANXA2 i PDA invasion. Den epitelial til mesenkymale overgang (EMT) regulerer den normale morfogene proces under fosterudviklingen og væv omstrukturering, og de første trin i invasion og metastaser er foreslået at efterligne EMT [18]. Derfor søgte vi at bestemme, om ANXA2 er påkrævet for EMT i PDA-celler. EMT er karakteriseret ved undertrykkelse af transskription af epitel markører, såsom E-cadherin og induktion af mesenchymale markører, såsom slug og vimentin. ANXA2 er blevet rapporteret at mediere TGFp-aktiverede EMT under processen med hjerteklap udvikling [19]. Desuden er TGFp rapporteret at inducere EMT i dyrkede PDA celler [20], [21]. For at undersøge, om ANXA2 har en direkte rolle i EMT processen med invaderende PDA celler, en lentiviral vektor, der indeholder

ANXA2

shRNA blev brugt til at opnå langsigtet undertrykkelse af ANXA2 i PDA-celler (Figur S3). Real-time PCR-analyse viste, at E-cadherin blev undertrykt, mens slug og vimentin blev induceret under TGFP-induceret EMT i Panc10.05 celler med kontrol shRNA, men ikke i de smittede med

ANXA2

shRNA (figur 3A ). Derudover blev E-cadherin-protein-ekspression undertrykkes i TGFp-behandlede celler med kontrol shRNA, men forblev uændret i TGFp-behandlede celler, der også udtrykte

ANXA2

shRNA (figur 3B, C). Som forudsagt, PDA celler uden

ANXA2

shRNA mister deres celle-celle adhæsion fænotype og scatter omkring kultur tag næste TGFp behandling, der minder om en EMT mønster (figur 3B). Selv ANXA2 er endnu ikke blevet vist at være involveret i Smad4-medieret EMT er det blevet vist at være involveret i Rho (små GTPaser) -medieret Cellefrigørelse, et træk af EMT [15]. Derfor har vi også vurderet, om Rho medierer ANXA2-associeret EMT i PDA og fandt, at Rho aktivering ikke detekteres i PDA celler med shRNA hæmning af ANXA2 efter TGF behandling (figur 3C). Disse resultater viser, at tab af ANXA2 udtryk fører til tab af TGF-Rho-medieret EMT i PDA celler.

A. Kvantitativ real-time PCR-analyse af E-cadherin, slug, og vimentin mRNA-ekspression i Panc10.05 PDA-celler med og uden knockdown af ANXA2 af shRNA. De relative forhold mellem mRNA-ekspression med TGFp1 behandling versus uden TGFp1 behandling er vist. Dataene blev normaliseret med β-actin-ekspression. B. Den samme par PDA celler, der anvendes i panel a blev behandlet med TGFp1 for 0, 36 eller 72 timer, henholdsvis og derefter høstes til immunfarvning med anti-E-cadherin antistoffer og PE-konjugerede sekundære antistoffer. DAPI blev anvendt til at farve kerner. C. samme par PDA celler, der anvendes i panel A blev behandlet med TGFp1 for 0, 36 eller 72 timer, henholdsvis og derefter høstet. En fraktion af celleekstrakt blev anvendt til western blot-analyse og blev farvet med anti-E-caherin, anti-RhoA, B, C, eller anti-p-actin antistoffer som den interne kontrol, hhv. Den resterende celleekstrakt undergik en pull down assay gennem en affinitetssøjle, der specifikt binder aktiveret, GTP-bundne former af Rho. Dette blev efterfulgt af western blot analyse med anti-Rho-antistoffer. Bemærk, at anti-Rho antistoffer genkender Rho A, B og C, hvis molekylære vægte er lidt anderledes, hvilket resulterer i to bånd på gelen. Kontrol udpeger cellerne med kontrol shRNA;

ANXA2

shRNA betegner cellerne med

ANXA2

shRNA. D. Kvantitativ realtids-PCR-analyse af E-cadherin, slug, og vimentin mRNA-ekspression i et par Panc10.05 PDA cellelinjer inficeret med lentivirus udtrykker vildtype ANXA2 (ANXA2-WT) eller Y23A muteret ANXA2 (ANXA2-Y23A ), henholdsvis. De relative forhold mellem mRNA-ekspression med TGFp1 behandling (angivet med +) versus uden TGFp1 behandling (angivet med -) er vist. Dataene blev normaliseret med β-actin udtryk.

Vi næste undersøgt, om Tyr23 fosforylering er vigtigt for ANXA2-medieret EMT i PDA celler. Vi observerede, at det endogene ANXA2 ikke længere lokaliseres til celleoverfladen i de celler, der udtrykker tyrosin stedet tabsvarianten ANXA2

Y23A (fig S4). Desuden transfektion med ANXA2

Y23A-FLAG hæmmer invasionen af ​​Panc10.05 celler (Figur S4), hvilket tyder på, at ANXA2

Y23A har en dominerende negativ effekt. I overensstemmelse med offentliggjorte data [22], fandt vi, at ANXA2

Y23A stadig kan binde til sin partner S100A10 /p11 [23] i cytosolen, men ikke i cellemembranen (figur S5). Derfor kan overudtrykt, cytoplasmatisk-lokaliserede ANXA2

Y23A binde alle S100A10 /P11 i cytosolen, og dermed giver en dominerende negativ effekt. Derfor udnytter den dominerende negative effekt af ANXA2

Y23A, og beskæftiger denne ANXA2

Y23A mutant, vi yderligere påvist, at EMT induceres af TGF i celler, der udtrykker ANXA2

WT, men ikke i celler, der udtrykker ANXA2

Y23A (figur 3D). Således er disse data viser yderligere, at Tyr23 phosphorylering af ANXA2 fremmer EMT af PDA-celler og er en tænkelig mekanisme, hvorved ANXA2 lokaliseres til PDA cellemembranen og giver muligheden for PDA-celler at invadere.

Ekspression og tyrosinphosphorylering af ANXA2 er nødvendige for PDA metastaser dannelse

in vivo

Lokal invasion af tumorceller er et kendt trin i processen med metastaser. Vores data viser, at ANXA2 letter invasion af PDA celler

in vitro

. Vi ansat derfor en transplanterbar murine bugspytkirtelkræft model af metastaser (figur S6) til at vurdere betydningen af ​​ANXA2 udtryk, phosphorylering, og celleoverfladelokalisering i PDA metastaser proces

in vivo

. I denne model 100% af musene dør med levermetastaser ved ca. 4-6 uger (figur 4A) efter milt injektion af 2 × 10

6 Panc02 murine PDA celler. Panc02 celler inficeret med en GFP udtrykker lentivirus bærer shRNA specifikt for

ANXA2

knockdown eller kontrol shRNA blev sorteret for GFP-positive celler ved FACS.