PLoS ONE: ADAM15 er funktionelt associeret med metastatisk progression for Human blærekræft

abstrakt

ADAM15 er et medlem af en familie af katalytisk aktive disintegrindomæne membran metalloproteinaser, der fungerer som molekylære signalsystemer afbrydere, skur membranbundne vækstfaktorer og /eller spalte og inaktivere celleadhæsionsmolekyler. Afvigende metalloproteinase funktion ADAM15 kan bidrage til tumor progression gennem frigivelse af vækstfaktorer eller forstyrrelse af celleadhæsion. I denne undersøgelse anvendte vi humane blærecancer væv og cellelinier for at evaluere udtrykket og funktion af ADAM15 i progressionen af ​​human blærecancer. Undersøgelse af genom og transkriptom databaser afslørede, at ADAM15 rangeret i top 5% af forstærkede gener og dens mRNA var signifikant overudtrykt i invasive og metastatiske blærekræft i forhold til ikke-invasiv sygdom. Immunfarvning af en blære tumorvæv matrix designet til at evaluere sygdomsprogression afslørede forøget ADAM15 immunreaktivitet forbundet med stigende cancer stadium og udviste betydeligt stærkere farvning i metastatiske prøver. Omkring halvdelen af ​​de invasive tumorer, og de fleste af de metastatiske tilfælde udviste høj ADAM15 farvning indeks, mens alle lav kvalitet og invasive tilfælde udviste negativ eller lav farvning. Knockdown af ADAM15 mRNA-ekspression inhiberede signifikant blære tumorcellemigration og reducerede invasive kapacitet blære tumorceller gennem Matrigel

TM og monolag af vaskulært endotel. Knockdown af ADAM15 i en human xenograft model af blærecancer inhiberede tumorvækst med 45% sammenlignet med kontroller. Strukturel modellering af det katalytiske domæne førte til konstruktionen af ​​et hidtil ukendt ADAM15-specifik sulfonamidinhibitoren som viste bioaktivitet og væsentligt reduceret levedygtighed blære cancerceller

in vitro

i humane blærekræft xenotransplantater. Tilsammen resultaterne afslørede en ubeskrevet rolle ADAM15 i invasionen af ​​menneskelige blærecancer og foreslog, at ADAM15 katalytiske domæne kan repræsentere et levedygtigt terapeutisk mål i patienter med fremskreden sygdom

Henvisning:. Lorenzatti Hiles G, Bucheit A, Rubin JR, Hayward A, Cates aL, Day KC, et al. (2016) ADAM15 er funktionelt associeret med metastatisk progression for Human blærekræft. PLoS ONE 11 (3): e0150138. doi: 10,1371 /journal.pone.0150138

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: 23, 2015; Accepteret: 9. februar 2016 Udgivet: 1. marts 2016

Copyright: © 2016 Lorenzatti Hiles et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning er delvist understøttet af R01CA154252 (MLD), University of Michigan Cancer center Support Grant (P30 CA46592) og blære forskningsmidler fra gavmilde donorer til University Michigan Urologi afdeling. Dette arbejde blev også delvist understøttet af de europæiske egyptiske Pharmaceutical Industries. GLH understøttes af UL1TR000433 (Postdoc Translational Scholars Program, Michigan Institut for Klinisk og sundhed forskning) og University of Michigan. Den bidragyder EEPI ydet støtte i form af konsulenthonorarer for forfattere [MLD og LE], men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« afsnittet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og forfatterne af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser: MLD er en betalt konsulent Europæiske Egyptian Pharmaceuticals, Alexandria, Egypten. Forfatterne også erklære, at denne støtte fra EEPI ikke ændrer deres tilslutning til PLoS ONE politikker på datadeling og materialer

Forkortelser:. ADAM, A disintegrindomæne And Metalloproteinase; DMEM, Dulbeccos modificerede Eagle-medium; EGF, epidermal vækstfaktor; EGFR, epidermal vækstfaktor receptor; FBS, kalvefosterserum; FRET, Fluorescence Resonance Transfer; GAPDH, glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; GPCR, G-protein-koblet receptor; HB-EGF, heparinbindende epidermisvækstfaktor; HUV-EC-C, Human navlestrengsveneendotelceller; MTS, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium; OD, optisk densitet; PBS, phosphatpufret saltvand; PMS, phenazinmethosulfat; RFLP, polymorfisme; SCID, Svær kombineret immundefekt; SD, standardafvigelse; sE-cad, opløselig E-cadherin; SEM, Standard afvigelse på middelværdi; shRNA, kort- hårnål RNA; TBST, Tris-saltvand plus Tween; TEM, Trans-Endotel Migration; TGFa, transformerende vækstfaktor alpha; TGFp, transformerende vækstfaktor Beta

Introduktion

Blærekræft er den fjerde mest almindelige årsag til kræft, og den ottende mest almindelige årsag til kræft død hos mænd. Det anslås 74.000 mænd og kvinder vil blive diagnosticeret og 16.000 mennesker vil dø af blærekræft ved udgangen af ​​2015 [1]. Mens størstedelen af ​​blære kræft er til stede som noninvasive fase tumorer tidligt, op til en tredjedel af ikke-muskel invasiv sygdom vil udvikle sig til muskel invasiv sygdom og metastaserer over tid [2]. På trods af effektiviteten af ​​cisplatin kemoterapi for lokalt fremskreden og metastatisk blærekræft, den manglende holdbarhed af svarene og fraværet af andetvalgsbehandling peger på behovet for mere effektive behandlinger [3, 4]. Kritisk til nye terapeutiske udviklinger er identifikationen af ​​specifikke onkogene veje med lovende terapeutiske interventioner, og den korrekte identifikation af patienter, der sandsynligvis vil drage fordel af en given terapi (individuelt kræftbehandling).

De fleste blære kræftformer udtrykkelig forhøjede niveauer af den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) [5,6,7]. EGFR modulerer cellevækst og proliferation samt regulering af genekspression, angiogenese, motilitet og apoptose resulterer i øget malign potentiale [8,9,10]. Forhøjet EGFR er almindelig i primære blære kræft med omkring 50% af tilfældene udviser overekspression [8]. Derudover har et flertal af metastatiske blæretumorer vist sig at udtrykke EGFR [11]. Endvidere synes EGFR overekspression at være en betydelig negativ prædiktor for overlevelse [5]. Således biologiske veje, der forbedrer vækstfaktor signalering gennem EGFR vil kunne bidrage til at blærekræft progression og metastase. Cellebundne EGFR-ligander, såsom heparin-bindende epidermal vækstfaktor (HB-EGF), amphiregulin, transformerende vækstfaktor alpha (TGFa), og betacellulin vides at blive frigivet gennem virkningen af ​​membranbundne proteaser, herunder medlemmer af ADAM (a disintegrin And Metalloproteinase) familie [12-14].

ADAM familien består af ca. 40 proteiner, men kun få udviser proteolytisk aktivitet [15-17]. Den proteolytisk aktive Adams, eller sheddases, trafik til membranen i en latent form, som kan aktiveres af den proteolytiske udgydelse af en N-terminal inhiberende prodomæne [12,13]. De enzymatisk aktive protein spalter og frigiver flere fysiologiske celleoverfladeproteiner inklusive membranforankrede vækstfaktorer og deres receptorer, ecto-enzymer og celleadhæsionsmolekyler såsom E-cadherin og N-cadherin. Disse funktioner placere specifikke Adams live i fundamentale roller for cellulær signalering og regulering af celleadhæsion og cellulære motilitet [12,15]. Adskillige ADAM’er har også været impliceret i human tumorgenese [13,14,16,18,19] og øget ekspression og funktion af disse ADAM’er ofte korrelerer med tumorprogression og aggressivitet sygdom [18,20].

One af det katalytisk aktive Adams, ADAM15, er blevet rapporteret at være overudtrykt i mange maligniteter, herunder melanoma, prostatacancer og brystcancer [20,21]. Listen af ​​substrater for ADAM15 indeholder flere centrale celle regulatoriske molekyler, herunder E-cadherin og N-cadherin, desmoglein og EGFR-ligander, transformerende vækstfaktor Beta (TGF), amphiregulin, epiregulin og HB-EGF [16,21,22]. Niveauet af overekspression af ADAM15 i bryst- og prostatacancer er blevet korreleret med tumor aggressivitet og metastatisk progression [20]. Vi har vist, at inhibering af ADAM15 ekspression i PC-3 prostatacancerceller reduceret tumorvækst og forhindrede metastase [23]. Et link mellem ADAM15 og angiogenese er også blevet bemærket [24,25].

De biologiske og molekylære profiler af blære kræft foreslog, at overekspression og aktivering af ADAM15 kan være relevant for udviklingen af ​​denne sygdom. Første, blære kræft udtrykker høje niveauer af EGFR, hvor den lokale frigivelse af EGFR-ligander vil fremme blærekræft vækst [5-7,11]. For det andet, E-cadherin, et andet substrat for ADAM15, er blevet fundet i det enzymatisk forarbejdet form i både serum og urinprøver fra blærecancerpatienter som også korrelerede med dårlig klinisk resultat [26,27]. For det tredje, blærekræft progression er tæt knyttet til angiogenese [9,28-30], som også kan blive påvirket af den biologiske aktivitet af ADAM15 [24,25].

ADAM15 fremstår som en potentiel regulator af tumor mikromiljø og sit løfte til terapeutisk målretning er stigende. Foreløbig undersøgelse af ADAM15 ekspression i væv, cellelinier og xenograftmodeller af human cancer (histologisk ligner den primære tumor) foreslog sin funktionelle rolle i progressionen af ​​human blærecancer. Men lidt var kendt om ekspressionsniveauerne af ADAM15 i human blærecancer eller hvordan ADAM15 kunne funktionelt medierer invasion og metastase af blære cancerceller. I den aktuelle undersøgelse, vi satte os for at validere sammenslutning af ADAM15 udtryk med fremskreden menneskelig blærecancer og etablere den funktionelle deltagelse ADAM15 i progressionen af ​​denne sygdom.

Materialer og metoder

Cell kultur

Menneskelig blære kræft cellelinjer UM-UC-6 [31,32] og UM-UC-9 [32] blev opnået fra ophavsmanden (HB Grossman, The University of Texas-MD Anderson cancer center, Houston TX). SV-40 immortaliseret human uroepitele celler (SV-HUC-1) [33] var en venlig gave fra C.A. Reznikoft (University of Wisconsin, Madison, WI). Etableret human navlestrengsveneendotelceller (HUV-EC-C) blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler blev udnyttet inden kortvarig passage og testet af restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (RFLP) til autentificering (Research Animal Diagnostic Laboratory, Columbia, MO). Celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Life Technologies, Grand Island, NY), med høj glucose, suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies). De HUV-EC-C-celler blev holdt i endotelcellevækst Medium EBM-2

TM (Lonza Inc., Allendale, NJ) suppleret med EGM ™ -2 BulletKit ™ (Lonza Inc.) og 10% FBS.

Generation of ADAM15 knockdown cellelinier

UM-UC-6 og UM-UC-9 ADAM15-knockdown blære cancerceller blev genereret ved hjælp af et lentivirus transporterer ADAM15-specifikke knockdown kort hårnål RNA (shRNA) ( shA15), eller tomme vektor kontrol sekvens og /eller krypteret shRNA sekvens udformet som en kontrol for off-target effekter (ctlA15) som vi tidligere rapporteret [22,23]. De fremadrettede og komplementære målsekvenser for ADAM15 var 5′-AACCCAGCTGTCACCCTCGAA-3 ‘og 5′-TTCGAGGGTGACAGCTGGGTT-3’.

Patient prøver

tumor prøver til dette arbejde blev opnået bevare patientens fortrolighed under skriftligt informeret samtykke ved University of Michigan blærekræft Tissue Bank. Hver kilde overholder Medical School Institutional Review Board godkendte protokol (IRBMED HUM00042401). Vævet microarray bestod af 110 kerner på 37 blærecancerpatienter, og omfattede prøver fra normal blære samt overfladiske, invasive og metastatiske blære kræft.

Protein Isolering og Immunoblotting

Celler blev høstet ved skrabning og den resulterende cellepellet blev vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS), og nedfrosset ved -80 ° C før ekstraktion. Cellepellets blev lyseret i lysisbuffer (50 mM Tris [pH 7,6], 120 mM NaCl, 0,5% NP40, 1 mM EGTA, 100 ug /ml phenylmethysulfonyl fluorid, 50 ug /ml aprotinin). Ekstrakter blev klaret ved centrifugering ved 10.000 RPM i 10 minutter, og supernatanter blev opsamlet og protein kvantificeret under anvendelse af Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA). Cellulære ekstrakter (20 ug /bane) blev derefter separeret på præ-støbte gradient 4-20% Tris-glycin SDS-polyacrylamid-geler (Novex, Life Technologies, Carlsbad, CA) og overført til en forstærket 0,2 um nitrocellulosemembran (EMD Millipore, Billerica, MA). Membraner blev derefter blokeret, probet og fremkaldt. Blokerende buffer bestod af 10% fedtfri tørmælk i TBST (Tris-bufret saltvand med 0,1% Tween 20; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). Primære og sekundære antistof-inkubationer blev udført i 2,5% fedtfri tørmælk i TBST. Primære antistoffer mod GAPDH (monoklonal muse MAB374 antistof parti 2.322.571, EMD Millipore, Billerica, MA) og ADAM15 (kanin polyklonale AB19036 antistof-, Lot 2.316.790, EMD Millipore) blev anvendt ved slutfortynding 1: 10.000 og 1: 2.000, henholdsvis. De sekundære antistoffer blev ged anti-mus IRDye

TM 680RD 1: 5000 (fra 926 til 68.070, meget C30502-01, Li-Cor, Lincoln, NE) og gede anti-kanin IRDye

TM 800CW 1: 10.000 ( C30521-01, meget C30521-01, Li-Cor). Membraner blev afbildet med Li-Cor Odyssey CLX

TM (Li-Cor, Lincoln, NE) ved at følge producentens instruktioner.

Immunhistokemi

Paraffin vævssnit blev afparaffineret og behandlet med peroxid i methanol for at blokere endogen peroxid aktivitet. Antigen genfinding blev udført under anvendelse citratpuffer antigen-genvinding efter fabrikantens anvisning (Citra, Biogenex, San Ramon, CA). Immunfarvning blev udført under anvendelse af avidin-biotin kompleks farvning (ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Primære kanin polyklonalt antistof mod ADAM15 (AB19035, parti 0603024760, EMD Millipore) blev fortyndet 1:50 i 5% FBS i PBS. En præ-fortyndet kanin isotype-opløsning (Life Technologies, Carlsbad, CA) blev anvendt som en negativ kontrol. Reaktionen blev afsluttet ved udvikling i 5 minutter med substrat (3,3′-diaminobenzidin plus peroxid). Objektglassene blev derefter modfarvet med hematoxylin. Objektglas blev evalueret af en patolog (LPK) og sorteres til farvning intensitet (på en 1-4 skala; 1 = negativ, 2 = svag, 3 = mellemprodukt, 4 = stærk) og procentdel af tumorceller farvning. En “intensitet score” (farvning intensitet ganget med procentdelen af ​​celler farvning) blev anvendt til at sammenligne resultaterne.

Sårheling Assay

UM-UC-9 og UM-UC-6 celler podet i 6-brønds vævskulturskåle og fik lov til at nå konfluens. Monolaget af celler blev ridset med en ny 5 ml pipettespids hen over midten af ​​brøndene til dannelse af et kors. Efter ridser blev brøndene forsigtigt vasket to gange med medium for at fjerne løsnede celler og derefter genopfyldes med frisk DMEM suppleret med 10% FBS. Fotografier blev taget og digitaliseret for at dokumentere den oprindelige revne. UM-UC-9 og UM-UC-6-celler blev derefter inkuberet i 18-20 og 12 timer. Fotografier blev taget og digitaliseret til at dokumentere migration. Den helbredende hul blev målt ved billedanalyse Software

TM fra Olympus (Olympus, Center Valley, PA).

Matrigel

TM Invasion Chamber Assay

BD BioCoat

TM Matrigel

TM invasion Chambers (BD Biosciences, Bedford, MA) blev udnyttet. 24-brønds kamre blev rehydreret med PBS og ctlA15 og sh15 UM-UC-9 eller UM-UC-6-celler podedes på kamrene, ifølge producentens procedure (BD Biosciences). Et volumen på 0,2 ml cellesuspension indeholdende 1×10

5 celler /ml i serumfrit medium blev tilsat til hver indsats. Et volumen på 0,5 ml DMEM plus 10% FBS blev tilsat til den ringere godt. Kamre blev inkuberet ved 37 ° C blev 5% CO

2 atmosfære og UM-UC-9 og UM-UC-6 celler lov til at migrere mod en serum gradient i en periode på 24 eller 12 timer hhv. Efter inkubation blev ikke-invaderende celler fjernet fra den øvre overflade af indsatsen membranen med bomuld tippes applikatorer. Cellerne på den nedre overflade af membranen blev fikseret med 10% formalin og farvet med krystalviolet (BD Bioscience). Celletælling blev udført fra mikrofotografier af 3-5 felter pr insert. Hver af cellelinierne blev undersøgt mindst tre gange.

transendotelial Migration Assay

BD BioCoat

TM skær og plader med 24 brønde (BD Biosciences) blev anvendt til transendotelmigrering migration assay. Fibronectin blev tilsat til belægge hver indsats (Sigma-Aldrich Co.) ved en koncentration på 50 ug /ml. HUV-EC-C-endotelceller blev derefter podet på indsatsen ved en koncentration på 1×10

5 celler /250 pi EBM-2 medium plus supplementer. HUV-EC-C-celler blev inkuberet i 48 timer for at danne en monolag. UM-UC-9 og UM-UC-6, ctlA15 og shA15, celler blev holdt i 24 timer og podet på invasionen indsætter ved en densitet på 1×10

5 celler /250 pi i serumfrit medium. Kontrol- inserter blev fyldt med medium for at vurdere vandrende baggrund af endothelcellerne. Det nedre kammer blev fyldt med 300 pi EBM-2 plus 10% FBS. Kamrene blev derefter inkuberet for at tillade tumorcellerne at migrere gennem endothellaget mod en serum-gradient. UM-UC-9 celler blev inkuberet i 24 og UM-UC-6 i et tidsrum på 12 timer. Ikke-transmigratory celler blev fjernet med en vatpind. Dernæst blev migrerende tumorceller fikseret med 10% formalin og farvet med krystalviolet og fotograferet for at kvantificere tumorcellemigration. Tre felter pr insert blev fotograferet og cellerne tælles med bistand fra ImageJ [34]. Hver tilstand blev kørt i tre eksemplarer.

Struktur-baserede design af en roman Chemical inhibitor Målretning det katalytiske domæne i ADAM15

Den katalytiske site af ADAM15 er unik og antyder muligheden for at designe nye kemiske sonder der er selektive for ADAM15 metalloproteinaseaktivitet. Denne tilgang medførte den første identifikation og validering af ikke-specifikke inhibitor, marimastat, som en strukturel sonde med fremragende forudsagt binding og hæmmende potentiale mod det aktive sted i ADAM15. Yderligere strukturel modellering førte til identifikation af biphenyl sulfonamid metalloproteinase-inhibitor, PD166793 [35], som er udstyret med adskillige egenskaber, der gør det til et attraktivt udgangspunkt for analog syntese af ADAM15 prober. Foreløbigt struktur-baseret design, under hensyntagen til de unikke amfipatiske egenskaber af ADAM15 S1 ‘pocket, tilladt os at designe og syntetisere en ny blyforbindelse, adamastat, der er udformet som en selektiv probe for ADAM15. Optimale bindende modes og relative bindende energier af vores ADAM15 metalloproteinaseinhibitor blev beregnet ved hjælp af den bredt accepterede Autodock Vina program for molekylær docking og virtuel screening [36], som er repræsenteret i S1 tabel. Disse beregninger, forudsiger, at adamastat skal binde selektivt og med høj affinitet til det katalytiske site af ADAM15.

fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) Indhold

Aktiviteten af ​​rekombinant ADAM15 katalytiske domæne (A15cat) blev bestemt under anvendelse FRET assays, der måler spaltningen af ​​et fluorogent ADAM15 substratpeptid. Inhibering af den katalytiske aktivitet af A15cat ved marimastat, PD166793 og adamastat blev bestemt under anvendelse af et fluorogent peptid (dabcyl-HGDQMAQKSK (5FAM-NH2) afledt af ADAM15 spaltningsstedet i den lave affinitet IgE-receptoren (CD23) [37]. I disse eksperimenter substratet i en koncentration på 1 uM blev inkuberet med rekombinant A15cat (0,5 ug /ml) i 24 timer ved 24 ° C i plader med 384 brønde (Corning, Corning, NY) med inhibitor i phosphatpufret saltvand løsninger. Fluorescens blev målt under anvendelse af en PHERAstar (BMG LABTECH Inc., Cary, NC) fluorescenspladelæser (excitation ved 485 nm og emission ved 530 nm).

Cell Proliferation Analyse

for at undersøge effekten af ​​vores ADAM15 knockdowns på celleproliferation, ctlA15 og shA15 UM-UC-9 og UM-UC-6, celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1.000 og 500 celler /brønd i henholdsvis 200 pi medium. End point blev vurderet efter 12, 24, 48 og 72 timers inkubation.

på en tilsvarende måde, anti-proliferative effekt af adamastat blev analyseret ved udpladning SV-Huc-1, UM-UC-9 og UM-UC-6 celler ved en koncentration på 2.000, 1.000 og 500 celler /brønd i henholdsvis 100 pi medium. Celler lodes binde natten over og behandlet med 100 pl /brønd af en 2X adamastat opløsning (ved 5 uM slutkoncentration) eller tilsvarende koncentration af DMSO som vehikelkontrol. Derfor blev celler anbragt i inkubator i 12, 24, 48, 72, 96 og 120 timer.

Celleproliferation blev vurderet ved hvert tidspunkt gennem bioreduktion af en vandopløselig MTS tetrazolium (3- (4,5 -dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) salt til dets formazan produkt af metabolisk aktive celler [38]. Efter tilsætning af 40 pi MTS /phenazinmethosulfat (PMS) (20: 1) opløsning (Promega, Madison, WI) blev cellerne inkuberet i 2 timer ved 37 ° C, og absorbansen af ​​formazan produkt blev målt ved 490 nm .

cellelevedygtighed Analyse

SV-HUC-1 blev UM-UC-9 og UM-UC-6-celler podet i 96-brønds plader ved en koncentration på 2.000, 1.000 eller 500 celler /brønd henholdsvis 100 pi DMEM plus 10% FBS (ingen phenolrødt). Efter inkubation i 24 timer blev cellerne behandlet med en slutkoncentration på 0,1% DMSO (vehikelkontrol), 0,1, 1, 10 eller 100 pM adamastat i 100 pi medium og inkuberet i 96 timer. Efterfølgende blev 40 pi MTS /PMS-opløsning tilsat til hver brønd, og absorbansen ved 490 nm blev målt efter 2 timers inkubation ved 37 ° C [38]. Assayet blev udført i tredobbelte brønde. Blanke brønde, blev kun medium og 2,5 uM staurosporin (Sigma-Aldrich Co.) inkluderet som kontroller. Cellelevedygtighed (%) var vurderer som: (OD prøve-OD staurosporin) /(OD mellemlange OD staurosporin) × 100.

tumorvækst i svær kombineret immundefekt (SCID) Mus

Til undersøge virkningen af ​​silencing ADAM15 på vækst blærecancer, ctlA15 og shA15 UM-UC-6 celler blev subkutant inokuleret i en koncentration på 1×10

6 celler i C57BL /6 SCID-mus, i to grupper på 10 mus. For at bestemme prøvestørrelse for adamastat

in vivo Salg eksperimenter anvendte vi formlen: (n = log 0,10 sandsynligheden for type II fejl divideret med 95% chance for at påvise en vægtforskel på 40% eller derover Log 0,10 delt. ved log 0,6 = 4,5 mus pr gruppe), således 5 mus pr gruppe anvendt i forsøget. Efter 3 uger blev musene aflivet og tumorer vejet.

In vivo

effektivitet af adamastat blev også bestemt i UM-UC-6 xenotransplantater, hvor 1×10

6 UM-UC-6 blære tumorceller blev injiceret subkutant i flanken af ​​SCID-mus. I lyset af den forudsagte adamastat oral tilgængelighed, blev dyr behandlet med sonde med adamastat efter tumorinitiering (10 dage efter injektion). Musene blev opdelt i to grupper på 5 dyr og behandlet dagligt med adamastat (100 mg /kg /dosis) eller vehikelkontrol (PBS) i 3 uger før obduktion. Hver tumor blev reseceret og vejet på samme tid postmortem. Den eksperimentelle enhed var en tumor pr mus og alle tumorer (100%) blev inkluderet i analysen.

Antallet af dyr indgår tidligere afledt ved observation af det minimumsbeløb, der kunne præsentere statistisk signifikans under eksperimentelle betingelser. Alle grupper blev tilfældigt adskilt af buret. Cancercelle inokulering eller adamastat behandling blev startet på samme tid. Musene udviste ikke vægttab og ingen bivirkninger på grund adamastast eller sondeernæring teknik blev observeret.

SCID-mus anvendt i denne undersøgelse var hanner og hunner, 8 til 10 uger gamle, avlet af Ulam Breeding Core. Dyrene blev holdt i et patogenfrit anlæg i ventilerede bure. Deres velfærd blev vurderet dagligt af forfatterne og udstedelse personale fra University of Michigan.

Etik erklæring.

pleje og behandling af musene blev revideret af universitetet Udvalget om brug og pleje af Dyr (UCUCA) og viste sig at være i overensstemmelse med University of Michigan institutionelle retningslinier. University of Michigan UCUCA godkendt disse dyreforsøg ved protokol PRO00004867. Podning af tumorceller blev udført under isofluoran anæstesi for at minimere lidelser. Alle procedurer overholde de ANKOMMER retningslinjer for rapportering dyr forskning, som beskrevet i S1 ANKOMMER Tjekliste.

Statistisk analyse

I væv microarray analyse, score en farvning indeks (intensitet ganget med den procentdel af tumorceller farvning) blev beregnet for hver kerne. Flere kerner af samme kliniske stadium fra den samme patient blev kombineret i en sammenfattende score repræsenterer middelværdien af ​​kernerne. Dette resumé resulterede i 48 datapunkter (svarende til unikke patient-diagnose kombinationer) for ADAM15 farvning evaluering. En envejs ANOVA blev anvendt til at sammenligne farvningen indeks summary score fase. Alle parvise sammenligninger blev foretaget mellem grupper ved hjælp af Tukey-Kramer metode til at korrigere for flere sammenligninger. Svagheden i ANOVA model er, at der kan være sammenhæng i patienten, at der ikke er regnskabsmæssigt med denne metode. En gentagen foranstaltninger model ved hjælp af farvning indeks for hver kerne individuelt med korrelationsstrukturer at tage højde for de gentagne kerner inden patienten og diagnosen blev brugt til at kontrollere resultaterne af ANOVA resumé score model. Denne model brød normalitet antagelser, men havde lignende resultater og de samme konklusioner. For enkelhedens skyld er ANOVA resultater vises. Uparret, 2-tailed t-test blev anvendt til at bestemme, om blev observeret statistisk signifikante forskelle i sårheling, invasion, migration, og

in vivo

mus xenograft eksperimenter. Spredning og levedygtighed celle resultater blev evalueret ved 2-vejs ANOVA og Tyrkiets flere sammenligning tests. Analyse blev udført under anvendelse af GraphPad Prism 6 Software (La Jolla, CA). Data blev betragtet som statistisk signifikant på

s

. 0,05

Resultater

ADAM15 Expression er associeret med lokal invasion og metastatisk progression for Human blærekræft

vi havde tidligere rapporteret, at ekspressionen af ​​ADAM15 var forbundet med den metastatiske progression af brystkræft og prostatakræft [20]. Imidlertid rolle ADAM15 i progressionen af ​​blærecancer ikke var blevet undersøgt,. Vi begyndte denne undersøgelse ved landmåling Oncomine

TM (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI) genekspression database til at vurdere DNA-kopi nummer og mRNA-niveauer af ADAM15 i humane blærekræft arrays. En analyse af 191 prøver viste, at ADAM15 kopi nummer er signifikant forhøjet i avanceret N etape (N1 +) invasiv blærekræft i forhold til noninvasiv (n0) sygdom. Af de 18,823 analyserede gener, ADAM15 rangeret som den 45

th højeste i kopi nummer eller i top 5% (figur 1A). Ved yderligere at analysere 3 uafhængige transkriptom undersøgelser i Oncomine

TM (Sanchez, Lee og Blaveri), fandt vi signifikant overekspression af ADAM15 mRNA i infiltrere blærekræft sammenlignet med normale væv (Fig 1B).

Analyse udnytte Oncomine

TM (Compendia Bioscience) gen browser.

A)

Boxplots opsummere gennemsnitlige antal kopier og standardafvigelse (SD) af et blærekræft genekspression datasæt. ADAM15 kopi nummer blev forhøjet i invasive blærekræft (N1 +) sammenlignet med ikke-invasiv sygdom (n0).

B)

ADAM15 mRNA overudtrykt i invasiv blærekræft i forhold til ikke-invasiv blærekræft. Søjler repræsenterer ADAM15 mRNA-niveauer i tre forskellige offentliggjorte mRNA-ekspression studier.

C)

mikrofotografier af ADAM15 immuno-farvning af en blære kræft progression væv arrays. Tre patologiske stadier er repræsenteret (normale væv, noninvasive, og invasiv blærekræft).

D)

Boxplots repræsenterer ADAM15 farvning indekset i denne TMA som gennemsnit ± SD. Invasive og metastatiske blærekræft prøver udviste øge farvning indeks i forhold til ikke-invasiv sygdom.

Betydningen af ​​disse indlæg til blærekræft progression blev valideret af evalueringen af ​​ADAM15 proteinekspression i kliniske prøver. Immunfarvning af en blærecancer væv microarray blev udført, viser specifik fokal overekspression af ADAM15 i de fleste af de avancerede (invasive og metastatiske) blærekræft prøver. Til sammenligning, alle af lav kvalitet og invasive blærekræft prøver (27/27), udviste lav ADAM15 farvning indeks (0-2), mens 48% (27/56) af den invasive og 72% (13/18) af de metastatiske tilfælde udviste moderat til høj farvning indeks (2-4) (tabel 1). En nærmere histologisk evaluering viste, at ADAM15 lokaliserer i den normale urothelium med en velorganiseret farvning på celle vejkryds, og øget positivitet på paraplyen celle luminale overflade (figur 1C). I modsætning hertil invasive cancer prøver udviste en mere uorganiseret og cytoplasmatisk farvning af ADAM15. Den ADAM15 immuno-positivitet steg i fremskredent stadium (fig 1D) og var signifikant større, da tumorerne skred fra noninvasive til invasiv og metastatisk sygdom. Tilsammen viste disse resultater, at ADAM15 overekspression er tæt forbundet med den lokale invasion og metastatisk progression af menneskelig blærekræft.

Knockdown af ADAM15 Fald Migration for blærekræft Cells

Cellular motilitet er påkrævet for tumorinvasion og metastase. Vi undersøgte den endogene ekspression af ADAM15 i to blærecancer cellemodeller og analyseret, om reduktionen i ADAM15 ekspression inhiberer blære tumorcellemotilitet. Udnytte overgangsbestemmelserne celle carcinom linjer UM-UC-9 og UM-UC-6 [31,32], vi vurderede ADAM15 protein niveau ved immunoblotanalyse hjælp af en cytoplasmatisk antistof mod ADAM15. UM-UC-9 og UM-UC-6 blære cancerceller udtrykte moderate niveauer af ADAM15 protein når normaliseret til GAPDH lastning kontroller (Fig 2A, S1 Fig og S2 Fig).