PLoS ONE: en mutation i Kulhydratgenkendelse Domæne Drives en Fænotypisk switch i rolle galectin-7 i prostata Cancer

Abstrakt

Den iagttagelse, at galectin-7 (gal-7) er specifikt udtrykt i brystkirtler myoepithelial (basal) celler fik os til at undersøge, om dette protein udtrykkes i de basale celler i andre væv. Eftersom brystkræft og prostatakræft har bemærkelsesværdige underliggende biologiske ligheder og givet de vigtige roller basale celler i prostata cancer, vi undersøgte ekspressionsmønstre og rolle gal-7 i human prostatacancer. Under anvendelse af væv microarray, fandt vi, at skønt gal-7 let udtrykkes i basale celler i normalt prostatavæv, er det nedreguleres i prostatacancer (PSA) celler.

De novo

ekspression af gal-7 i prostatacancerceller forøger deres følsomhed over for apoptose som respons på etoposid og cisplatin. Vurderingen af ​​et kulhydrat-anerkendelse domæne (CRD) -defective mutant form for gal-7 (R7S) viste, at evnen af ​​dette protein til at modulere apoptose var uafhængig af dens CRD aktivitet. Denne aktivitet var også uafhængig af dens evne til at translokere til det mitokondrielle og de nukleare rum. Imidlertid CRD aktivitet var nødvendig for at inhibere den invasive adfærd af prostatacancerceller.

In vivo

, gal-7 overekspression i PCA celler førte til en beskeden endnu signifikant reduktion i tumorstørrelse, mens CRD-defekt mutant form, væsentligt forøget tumorvækst sammenlignet med kontrolgruppen. Taget sammen antyder disse resultater, at selvom

de novo

ekspression af gal-7 kan være en interessant midler til at øge tumorigene fænotyper af PCA-celler, ændringer i CRD aktiviteten af ​​dette protein drive et fænotypisk switch i dets rolle i PCA celler. Denne CRD-uafhængig aktivitet repræsenterer et paradigmeskift i vores forståelse af funktionerne i galectin. Den R74S model vil være nyttigt at skelne CRD-afhængige og CRD-uafhængige funktioner gal-7 i kræft progression

Henvisning:. Labrie M, Vlădoiu M, Leclerc BG, Grosset AA, Gaboury L, Stagg J, et al. (2015) en mutation i Kulhydratgenkendelse Domæne Drives en Fænotypisk switch i rolle galectin-7 i prostatakræft. PLoS ONE 10 (7): e0131307. doi: 10,1371 /journal.pone.0131307

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: 9. januar 2015; Accepteret: 1 jun 2015; Publiceret: 13 jul 2015

Copyright: © 2015 Labrie et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af de canadiske Institutes for Health Research (Grant nr MOP-89.697) til YSP (http: //www.cihr-irsc. gc.ca/). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Bemærk, at Yves St-Pierre er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

galectin-7 (gal-7) er en p53-induceret gen, der primært udtrykt i stratificeret epitelceller [1, 2]. Dets ekspression kan også induceres af andre transkriptionsfaktorer, herunder mutantformer af p53 og CCAAT /enhancer-bindingsprotein beta (C /EBPβ) [3, 4]. Dens udtryk er også reguleret af epigenetiske mekanismer, herunder DNA methylering [5, 6]. Dens rolle i UVB-induceret keratinocyt apoptose [7], og i re-epitelialisering af hornhinde sår [8] støtter tanken om, at gal-7 er vigtigt for at opretholde homeostase i epitelceller. Unsuprisingly, har en række undersøgelser vist, at dysregulering af gal-7 udtryk har en stærk effekt på progression af flere typer af kræft i epitelial oprindelse. I brystvæv, fx gal-7 udtrykkes specifikt i myoepithelial (basal) celler, og dets overekspression i brystkræft væv korrelerer med resistens mod apoptose og spredning af metastaser til knoglen og lunge [9]. Overekspression af gal-7 er også forbundet med ringe overlevelse hos patienter med epitelial ovariecancer [6, 10] og med malignitet hos patienter med pladecellecarcinom af tungen [11]. Disse associationer mellem unormalt højt indhold af gal-7 og dårlig prognose er også til stede i esophageal og hypopharyngeal pladecellecarcinomer [12, 13]. Men som en række undersøgelser har vist, gal-7, i lighed med andre galectins, spiller en dobbelt rolle ved cancer og kan have en beskyttende rolle i visse tilfælde, især ved forøgelse af følsomheden af ​​cancerceller til pro-apoptotiske stimuli og ved at reducere cellevækst og angiogenese. Disse aktiviteter er blevet forholdsvis veldokumenteret i gastriske, urotelial og coloncancer, såvel som i cervikalt skæl carcinoma [6, 14, 15]. Faktisk de iagttagelser, at gensplejsede cervikale, gastriske og colon cancerceller overudtrykker gal-7 inducerer ikke gastriske tumorer i xenotransplanterede mus tyder på, at epigenetiske lægemidler eller gal-7-specifik genterapi kan anvendes til at undertrykke udviklingen af ​​særlige typer cancer [6, 14, 15]. I betragtning af den stigende popularitet af epigenetiske behandlinger for kræft, er det således nødvendigt at afgøre, om gal-7 har en pro- eller anti-tumor-funktion i en given form for kræft, især dem af epitelial oprindelse.

forskellige roller gal-7 i cancere i epiteloprindelse er i øjeblikket uklart, og kan være forbundet med en række forskellige faktorer. Man skal først overveje betydningen af ​​den subcellulære opdeling af gal-7, som er blevet fundet i cytosoliske, mitokondrie, og nukleare rum [15-17]. Gal-3, for eksempel, kan fremkalde resistens over for apoptose, og denne aktivitet afhænger af dets translokation fra cytosolen til mitokondrierne [18]. Hvorvidt en sådan intracellulær compartimentalization er også vigtigt for gal-7 til at regulere apoptose er ukendt. Alternativt kan den dobbelte rolle gal-7 afhænge sine bindingspartnere, fordi det er velkendt at binde glycosylerede proteiner via sin kulhydrat-genkendelse (CRD). Der er stigende tegn på, imidlertid, at galectins også interagere med ikke-glycosylerede proteiner i en CRD-uafhængig måde [19]. Denne observation er veldokumenteret for intracellulære galectins. Det vigtigste element af intracellulære galectins kan være deres evne til direkte at binde Bcl-2-familiemedlemmer via en CRD-uafhængig interaktion. Denne aktivitet er blevet vist i mange galectins, herunder gal-7 [16]. Den galectin /Bcl-2 interaktion forskyder balancen i aktivitet mellem pro- og anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien til regulering af apoptose [16, 20, 21]. Andre CRD-uafhængige funktioner galectins omfatter RNA behandling i kernen [22], og reguleringen af ​​cellecyklusprogression [23]. Alle disse CRD-uafhængige funktioner er afhængige af protein-protein-interaktioner. Faktisk er visse galectins, såsom gal-10, havnen markant lave tilhørsforhold til galactosider og menes at virke hovedsageligt gennem andre faktorer [24]. Disse CRD-uafhængige funktioner repræsenterer et paradigmeskift i vores forståelse af galectin funktion og i udviklingen af ​​galectin-specifikke inhibitorer.

Den iagttagelse, at gal-7 specifikt udtrykkes i epitelceller, især i brystkirtler myoepithelial (basal ) celler (men ikke i luminale celler), fik os til at undersøge, om det er udtrykt i de basale celler i andre væv. Eftersom bryst- og prostatacancer har bemærkelsesværdige underliggende biologiske ligheder [25] og i betragtning af den vigtige rolle, basale celler i prostatacancer [26], studerede vi ekspressionsmønsteret og rolle gal-7 i human prostatacancer.

Materialer og Metoder

cellelinjer og dyr

PC3 [27] og DU-145 [28] cellelinjer var en generøs gave fra Dr. Benoit Ochietti (McGill University, Montreal, QC) , og LNCaP celler [29] blev venligst leveret af Dr. Thomas Sandersons (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC. Den HaCaT-cellelinje [30] blev leveret af Dr. Thierry Magnaldo (Génétique ET Physiopathologie des kræftformer Épidermiques, Faculté de Médecine, Nice, Frankrig). Alle cellelinier anvendt i dette studie blev oprindeligt opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). de DU-145 og HaCaT cellelinjer blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium . PC3 og LNCaP-cellelinjer blev opretholdt i en F-12k blanding af næringsstoffer og RPMI 1640-medium, henholdsvis. Dyrkningsmedier blev suppleret med 10% (v /v] kalvefosterserum, 2 mmol /l L-glutamin, 10 mmol /l HEPES-puffer, og 1 mmol /L natriumpyruvat. Alle cellekulturprodukter blev købt hos Life Technologies (Burlington , ON, Canada). NOD /SCID-mus blev opnået fra The Jackson Laboratory. Dyrene blev huset under sterile forhold med

ad libitum

adgang til mad og vand. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalget af Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal

Immunhistokemi

væv microarrays blev brugt til at analysere 32 vævsprøver af prostata adenocarcinom, 20 hyperplasi, 5 Sækformet ectasia og 3 kræft -adjacent normale prostatavæv (US Biomax, Rockville, MD, USA og LifeSpan Biosciences, Seattle, WA, USA). immunfarvning reaktioner for gal-7 blev udført under anvendelse af en Discovery XT automatiseret immunostainer (Ventana Medical Systems). afparaffinerede snit blev inkuberet i celle conditioning opløsning, pH 8,0 (Ventana Medical Systems), for antigen hentning og derefter farvet i 60 minutter med et anti-humant gal-7-polyklonalt antistof (R R Epitomics, Burlingame, CA, USA), et muse-anti-β-actin (1: 20000; Sigma-Aldrich), et kanin-anti-COX IV (1: 1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), en kanin-anti-tubulin (1: 1000; Cell Signaling Technology) eller en muse-anti-lamin a /C (1: 1000; Cell Signaling Technology) antistof. Sekundære antistoffer inkluderet peberrodsperoxidasekonjugeret æsel anti-kanin (GE Healthcare, Baie-d’Urfé, QC, Canada), æsel anti-ged (R dog mRNA blev udtrykt på et lavt men påviseligt niveau i PC3-celler (figur 1). Samlet set viser disse resultater viste, at selv gal-7 let udtrykkes i basale celler i normale prostatavæv, det er helt fraværende i prostatacancerceller.

immunhistokemisk (IHC) farvning af gal-7 i 3-um tykke sektioner af formalinfikserede paraffinindlejrede (A) sund prostatavæv og (B) væv associeret med patologiske sygdomme i prostata. (C) Semi-kvantitativ RT-PCR og (D) Western blot analyse af gal-7-ekspression i DU-145, PC3 og LNCaP human prostatacancer-cellelinier. HaCaT keratinocyt cellelinien blev anvendt som en positiv kontrol. GAPDH og β-tubulin blev anvendt som indlæsning kontroller. LC: luminale celler, BC: basale celler, og ECM:. Ekstracellulære matrix

Produktion og karakterisering af vildtype og CRD-defekte gal-7 protein

For at undersøge de funktioner af gal-7 i prostatacancerceller og for at bestemme betydningen af ​​sin CRD, genereret vi en serie af stabile transfektanter, der udtrykker vildtype-gal-7 og en muteret form (R74S) af proteinet (fig 2A). Denne mutation er kendt for at hæmme evnen hos gal-7 til at binde lactose og at reducere dets translokation fra cytosolen til mitokondrierne og /eller cellekernen [17]. Vores tidligere analyse ved hjælp løsning NMR spektroskopi viste, at R74S mutationen inducerede kun begrænsede og lokale ændringer i gal-7 foldning. For yderligere at bestemme, i hvilket omfang CRD af gal-7 er afbrudt af R74S-mutation, vi sammenlignet sine bindende egenskaber til dem i vildtype gal-7 under anvendelse af en CFG glycan matrix (version 5.2) [31]. Hele listen over testede glykaner og resultaterne af de bindingsassays kan findes online (https://functionalglycomics.org/). Vores resultater bekræftede, at R74S-mutation undertrykte CRD aktivitet uafhængig af de glycan motiver vurderet (Fig 2B, S1 tabel). Denne undertrykkelse af CRD-aktivitet blev bekræftet ved flowcytometrisk analyse af bindingen af ​​FITC-mærket rekombinant gal-7

wt og gal-7

R74S på overfladerne af DU-145 prostatacancerceller (Fig 2C og 2D) . Tilsammen viser disse resultater, at R74S afskaffer CRD aktivitet af menneskelig gal-7.

(A) 3D-visning af gal-7

wt og gal-7

R74S CRDer i nærvær lactose. (B) En glycan matrix blev anvendt til at verificere bindingen af ​​gal-7

wt og gal-7

R74S til en lang række sukkerarter. Grafen afbilder bindingen af ​​gal-7

wt og gal-7

R74S til sukkerarter. Kun RFUs større end 10.000 præsenteres. navne sukker er opført i S1 tabel. Fejlsøjlerne repræsenterer SDS (n = 6). Flowcytometri analyse viser binding af gal-7

wt og gal-7

R74S til overfladerne af DU-145-celler (C) i fravær eller (D) tilstedeværelse af 0,1 M β-lactose. Bindingsassays blev udført under anvendelse af de angivne koncentrationer af FITC-mærket rekombinant gal-7. MFI: betyder fluorescensintensitet. Resultaterne repræsenterer tre uafhængige forsøg.

Karakterisering af intracellulær lokalisering af vildtype gal-7 og gal-7

R74S

For at undersøge den rolle, gal-7 og dens CRD i prostatakræft, DU-145 transfektanter, der udtrykker enten gal-7

wt eller gal-7

R74S blev genereret. Kontroltransfektanter (genereret ved hjælp af tomme ekspressionsvektorer) ikke udtrykker påviselige niveauer af gal-7 (figur 3A og 3B). Immunoblotting af mitokondrie og nukleare berigede fraktioner viste påviselig udtryk for gal-7

vægt i cytosolen, mitokondrier og kerner af DU-145-celler (Fig 3C og 3D). I modsætning hertil var der ingen detekterbar ekspression af gal-7 i mitokondrierne af transfektanter udtrykkende gal-7

R74S. Begge proteiner blev fundet i det ekstracellulære medie af cellerne (Fig 3e). Elektronmikroskopi analyse af DU-145-celler bekræftede ekspression af gal-7

wt i cytosolen, nucleus, og mitokondriel ydre membran, mens ekspressionen af ​​gal-7

R74S var begrænset til cytosolen (S1 Fig ). Interessant, elektronmikroskopisk analyse viste tilstedeværelsen af ​​gal-7

vægt- og gal-7

R74S-rige fremspring på cytoplasmatiske membran (S1 Fig) i overensstemmelse med tidligere rapporter, hvilket tyder på, at gal-7 associerer med actin cytoskelet til regulering cellemotilitet [10, 32, 33].

(A) Western blot-analyse, der viser ekspressionen af ​​gal-7 i forskellige stabile DU-145 kloner transficeret med ekspressionsvektorer, der koder vildtype- og muterede gal -7. Kontroller indbefattede celler transficeret med tomme SRa vektorer. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) Konfokal afbildning, der viser den intracellulære fordeling af gal-7 i DU-145 transfektanter. (C-D) Western blot-analyse, der viser gal-7-ekspression i cytosoliske, nukleare og mitokondriske fraktioner fremstillet ud fra DU-145-celler. β-tubulin, blev COX IV og lamin A /C anvendes som cytosoliske, mitokondrie og nukleare markører hhv. (E) Western blot-analyse, der viser sekretionen af ​​gal-7 i det ekstracellulære medie af DU-145-celler, der udtrykker gal-7

wt eller gal-7

R74S. p-tubulin ekspression blev overvåget for at udelukke muligheden for cellelysis. Intracellulære proteinekstrakter fra kontrol DU-145-celle og HaCaT cellesupernatanter blev anvendt som positive kontroller for β-tubulin ekspression og gal-7-sekretion, henholdsvis. Alle resultater repræsenterer tre uafhængige forsøg, herunder mindst to uafhængige DU-145 kloner.

Gal-7 fremmer apoptose i prostatacancerceller

Flere undersøgelser har rapporteret, at ektopisk udtryk for gal-7 gør hals-, gastriske og colon cancerceller mere følsomme over for apoptose induceret af pro-apoptotiske narkotika [15]. For at bestemme om denne konstatering gælder også i prostatacancerceller blev DU-145 transfektanter behandlet med stigende doser af pro-apoptotiske lægemidler og analyseret for spaltning af PARP-1, som er et almindeligt anvendt markør af apoptose [34]. Vores resultater viste, at ektopisk ekspression af gal-7 forøgede spaltning af PARP-1 induceret af etoposid sammenlignet med kontrolcellerne (figur 4A). Lignende resultater blev opnået, når fragmentering af kerner i apoptotiske celler blev visualiseret med DAPI-farvning (Fig 4B). Evnen af ​​gal-7 for at forøge følsomheden af ​​DU-145-celler til apoptose blev også observeret ved anvendelse af cisplatin som et pro-apoptotisk lægemiddel (Fig 4C). Interessant gal-7

R74S var lige så effektivt som gal-7

wt øge følsomheden af ​​DU-145 til både pro-apoptotiske lægemidler. I begge tilfælde er den intracellulære lokalisering af gal-7 forblev uændret under induktion af apoptose (S2 Fig). Ved hjælp af en (

3H] -thymidin inkorporering assay vi også målt proliferation af transfektanterne i fravær eller nærvær af cisplatin. Vi fandt, at både gal-7

vægt- og gal-7

R74S-udtrykkende DU-145-celler prolifererede til samme satser sammenlignet med kontrolceller under normale forhold, men prolifererede langsommere i nærværelse af cisplatin (fig 4D), hvilket er i overensstemmelse med evnen hos gal-7 til at fremme lægemiddelinduceret apoptose. tilsammen resultaterne viser, at gal-7 sensibiliserer DU-145-celler til pro-apoptotiske midler er uafhængige af dens CRD aktivitet og intracellulære rumopdeling.

(A) celler blev inkuberet i 16 timer med de angivne koncentrationer af etoposid og testes for apoptose ved at måle PARP-1-spaltning ved western blot. (B) Apoptose blev bekræftet ved at tælle antallet af celler med en fragmenteret kerne visualiseret ved DAPI-farvning. (C) Analyse af PARP-1-spaltning i DU-145-celler behandlet i 16 timer med den angivne koncentration af cisplatin. (D) Celleproliferation af DU-145-celler behandlet med eller uden 5 pM cisplatin målt ved (

3H] -thymidin inkorporering. Alle resultater repræsenterer tre uafhængige forsøg, herunder mindst to uafhængige DU-145 kloner. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, og *** P ≤ 0,001.

Gal-7, men ikke R74S reducerer invasive adfærd af DU-145 celler

Vi næste undersøgt, hvorvidt gal-7 kan modulere invasive adfærd af DU-145 celler ved hjælp af en standard

in vitro

Matrigel invasion assay. Vi fandt, at ektopisk ekspression af gal-7

betydeligt WT reducerede invasive adfærd af DU-145-celler sammenlignet med kontrolgrupper celler, der mangler gal-7 (figur 5A). En tilsvarende forskel blev ikke observeret for DU-145-celler, der udtrykker gal-7

R74S. Fordi celle invasive adfærd kan påvirkes af celle motilitet, brugte vi levende celler til at måle celle bevægelser under en ridse sårheling assay (Fig 5B). Vores resultater viste, at DU-145-celler, der udtrykker gal-7

WT signifikant reduceret celle hastighed sammenlignet med kontrolceller mangler gal-7 eller celler, der udtrykker gal-7

R74S (Fig 5C). Disse gal-7

wt-udtrykkende celler også var lavere akkumuleret og euklidiske afstande på migration (Fig 5D og 5E). Retningen af ​​DU-145 celler blev ikke påvirket ved ekspression af gal-7

wt eller gal-7

R74S proteiner (figur 5F). Brugen af ​​en standard ridse sårhelende assay bekræftede yderligere, at gal-7

vægt- reduceret cellemotiliteten af ​​DU-145-celler. Igen blev en lignende effekt ikke observeret for gal-7

R74S mutant (S3 Fig).