PLoS ONE: Overekspression af Promigratory og Prometastatic PTK7 receptoren er associeret med uønskede kliniske hændelser i kolorektal Cancer

Abstrakt

Biomarkører og nye terapeutiske mål er et presserende behov i kolorektal cancer (CRC). Pseudo tyrosinkinasereceptor 7 (PTK7) er involveret i plane cellepolaritet og det er dereguleret i forskellige maligniteter, herunder CRC. Men kun lidt om dens proteinekspression i human CRC, eller om en mulig korrelation af dets ekspression med kliniske endepunkter. Ved hjælp af en klinisk kommenteret Tissue Microarray (TMA) fremstillet af fra 192 konsekutive CRC patienter behandlet med indledende kirurgi, vi undersøgte PTK7 udtryk ved immunhistokemi i tumor væv og matches normal slimhinder, og korreleret sit udtryk med klinisk-patologiske funktioner og patient resultat. PTK7 udtømning af specifikke shRNA i HCT116 og HCT15 CRC cellelinjer viste sig at påvirke celleproliferation, resistens over for lægemidler og celle migration. Tumorvækst og metastatisk fænotype blev undersøgt

in vivo

anvendelse af et xenotransplantat musemodel for CRC-celler med moduleret ekspression af PTK7 niveauer. PTK7 var signifikant opreguleret i CRC væv sammenlignet med matchede raske slimhinder, og betydelig overekspression blev fundet i 34% af patienterne. PTK7 overekspression var signifikant associeret med en reduceret metastase overlevelse i ikke-metastatiske patienter. I HCT116 og HCT15 celler, shRNA PTK7 reducerede migration, men påvirkede ikke celledeling og resistens over for lægemidler. I en xenograft mus HCT15 celler, nedregulering af PTK7 førte til reduceret vækst tumor, mens dets overekspression i PTK7-negative cancerceller ført til øget metastatiske begivenheder. PTK7 udtryk repræsenterer således en potentiel prognostisk biomarkør og en roman terapeutisk mål i CRC

Henvisning:. Lhoumeau A-C, Martinez S, Boher J-M, Monges G, Castellano R, Goubard A, et al. (2015) Overekspression af Promigratory og Prometastatic PTK7 receptoren er associeret med uønskede kliniske hændelser i kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (5): e0123768. doi: 10,1371 /journal.pone.0123768

Academic Redaktør: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Modtaget 2 oktober, 2014 Accepteret: 21 februar 2015; Udgivet: 11 maj, 2015

Copyright: © 2015 Lhoumeau et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af La Ligue Nationale Contre le Cancer (Label Ligue JPB) https://www.ligue-cancer.net/, Fondation pour la Recherche Médicale (ACL) https://www.frm.org/, Region PACA (SM) https://www.regionpaca.fr/, SIRIC (INCA-DGOS-Inserm 6038) https://www.oncopaca.org /fr /. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Med 447 000 tilfælde og 215 000 dødsfald om året i Europa, kolorektal cancer (CRC) er fortsat et stort problem for folkesundheden [1,2]. Integration af 5-FU, og oxaliplatin adjuverende kemoterapi til kirurgisk resektion i node-positive-patienter har forbedret overlevelse [3,4], men et betydeligt antal af disse patienter stadig i sidste ende tilbagefald og dør af metastatisk sygdom. På samme tid, er node-negative patienter, der normalt ikke behandlet med adjuverende systemisk behandling, mens nogle af dem kunne drage fordel af denne strategi [5]. Således er et presserende behov identifikation af gyldige og robuste biomarkører, der kan skelne mellem en gruppe af patienter, der betydelig risiko for tilbagefald. Desuden selv om nogle molekylære målrettede lægemidler har bidraget til at øge overlevelse i metastaserende CRC [6-9], blev ingen af ​​dem vist sig at forbedre overlevelsen i adjuverende [10,11]. Derfor er det stadig ivrigt nødvendigt at identificere molekylære skuespillere, der spiller en relevant rolle i tyktarmskræft biologi og kan tjene som mål for nye biologiske behandlinger.

celleoverfladereceptor PTK7, også kendt som coloncarcinom kinase-4 (CCK-4), er en evolutionær konserverede medlem af receptortyrosinkinase-superfamilien, som først blev identificeret i humane normale melanocytter [12] og i human coloncarcinom [13]. Består af syv ekstracellulære immunglobulin domæner, en transmembran region og et intracellulært tyrosinkinasedomæne, det har en defekt kinaseaktivitet og ingen kendt ligand. Selv om dens nøjagtige biologiske rolle er uklar, har nylig dokumentation knyttet PTK7 på den plane cellepolaritet (PCP) pathway [14]. Mens apico-basal polaritet arrangerer epitelcelle fastgørelse langs en XY akse, PCP styrer positionen af ​​celler i planet af en epitelial struktur, der garanterer, at de vender i samme retning, og derved spiller en stor rolle i forskellige udviklingsprocesser, herunder epitelcelledifferentiering og bevægelser [15]. Notatet kan deregulering af PCP forårsage forskellige patologiske lidelser, herunder kræft. Kendte regulatorer af PCP omfatter Wnt ligander og Frizzled (Fz) receptorer, der aktiverer den Dishevelled adapter på plasmamembranen, og initierer den såkaldte Wnt vej enten i sin kanoniske (β-catenin-afhængig) eller ikke-kanoniske (β-catenin-uafhængig) organisation [16]. PTK7 blev foreslået at regulere PCP siden dens mutation i Xenopus eller i musen førte til åbenlyse PCP-relaterede udviklingsforstyrrelser, herunder neurale rør lukning defekter [17,18]. Endvidere blev PTK7 vist at direkte interagere med Dishevelled, hvilket fører til dets rekruttering på membranen og efterfølgende phosphorylering /aktivering med FZ7 [19]. Vi og andre har vist, at PTK7 også kan aktivere den kanoniske Wnt-vejen i et kinasedomæne-afhængig måde [18,20].

For nylig blev fundet PTK7 at være overudtrykt i forskellige humane cancere, herunder epiteliale tumorer sådanne som gastrisk, bryst, spiserør, galde kanal og lungekræft [21-26], men også i sarkom [27] og i blodkræftsygdomme, herunder akut og kronisk myeloid leukæmi [28-30]. Overraskende, mens PTK7 først blev beskrevet i humane tyktarmskræft cellelinjer [13], ingen data er i øjeblikket med hensyn til dens protein-ekspression i CRC væv fra klinisk kommenterede patienter. Således har vi evalueret PTK7 proteinekspression på en TMA sammensat af CRC primære væv og matchede sunde slimhinder, og vurderet mulige korrelationer af sit udtryk med konventionelle kliniske og patologiske parametre, samt med patientens resultat. PTK7 ekspression blev således vist at være associeret med metastatisk resultat og nedsat overlevelse i ikke-metastatiske CRC patienter. Vi undersøgte derefter virkningen modulere sit udtryk i prækliniske modeller og fandt, at PTK7 inducerer en pro-vandrende og pro-metastatisk fænotype, i overensstemmelse med de kliniske data.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af Institut Paoli-Calmettes (IPC) Institutional Review Board (IRB, Comité d’Orientation stratégique, COS). Det IRB fandt ikke så obligatorisk at indhente informeret samtykke fra patienterne, men data blev analyseret efter alle patientoplysninger er blevet fuldt anonymiseret. For dyr forskning, blev udført alle forsøg i enighed med de franske retningslinjer for håndtering af dyr og godkendt af den etiske komité i dyreforsøg i Marseille (C2EA-14). Dyrene blev opstaldet i SPF betingelser, i individuelt ventilerede bure (Tecniplast, Frankrig, Sealsafe Plus Mouse-Mouse IVC grønne linje) med 4-5 kammerater.

Alle mus fik lov fri adgang til autoklaveret og filtreret vand og bestrålede fødevarer i en 10-14 timers lys /mørke-cyklus, med en rumtemperatur på 21 ± 2 ° C og en luftfugtighed på 55 ± 15%. Alle bure indeholdt træspåner, sengetøj og en poppel træuld reden (Anibed, Frankrig) for miljøberigelse.

I den postoperative periode blev smerter afløst af en subkutan administration af meloxicam (Metacam injicerbar, Boehringer Ingelheim, 1 mg /kg en gang dagligt i 3 dage) og Baytril (Bayer) -supplemented vand blev desuden administreret til mus i 7 dage forud xenograft til forebyggelse af infektion under 3 uger efter operationen.

human aflivning af mus blev udført ved anvendelse inhaleret kuldioxid anæstesi efter den etiske komité i dyreforsøg i Marseille (C2EA-14)

patienter og væv

Archival væv fra 192 konsekutive patienter med trin i til IV kolorektal carcinom (CRC ) behandlet på vores institution (institut Paoli-Calmettes, Marseille, Frankrig) ved indledende kirurgisk resektion blev indsamlet mellem 1990 og 1998. Iscenesættelse brugt det fælles udvalg amerikanske om kræft kriterier [31]. Alle prøver blev fikseret i formalin og indlejret i paraffin, og evalueret i Biopathology afdelingen. Patienterne fik adjuverende 5FU kemoterapi i tilfælde af lymfeknuder engagement eller metastatisk sygdom ifølge standard anbefalinger. Efter behandling er afsluttet, blev overvågningen udført med intervaller 3 måneder for de første 2 år og 6 måneders intervaller derefter. Patienterne blev overvåget for metastatisk tilbagefald ved klinisk eksamen og blodprøver, årlig røntgenbillede af brystkassen og leveren ultralyd og /eller CT-scanning. Kliniske og patologiske funktioner samt resultatet karakteristika blev ekstraheret fra vores prospektivt opretholdes institutionel database. Hertil kommer, at undersøge eventuelle forskelle i PTK7 udtryk mellem metastatisk og primære væv, 7 PTK7-positive levermetastaser og parret primære CRC blev udvalgt til sammenlignende immunhistokemi.

væv microarrays byggeri

TMA blev forberedt som beskrevet tidligere [32,33]. For hver prøve blev 3 repræsentative områder valgt blandt en hæmatoxylin-eosin-farvede snit af en donorblok. Core cylindre med en diameter på 0,6 mm blev udstanset og sat på 3 separate modtager paraffinblokke ved hjælp af en specifik opstillingsindretningen (Beecher Instrumenter, Silver Spring, MD, USA). Modtagerblokken indeholdt par af tumor og normal slimhinde samt kontrol- normale og godartede væv (tyndtarmen, adenomer) og cellelinje pellets. Fem um snit af det resulterende TMA blok blev anvendt til IHC-analyse efter overførsel på objektglas. To coloncancer-cellelinjer (CaCo2, HT29) og en gastrisk cancercellelinie (HGT1) blev anvendt som kontroller.

Immunhistokemi analyse

I PTK7 farvning gede-IgG, anti-human /mus /rotte PTK7 /CCK-4 affinitetsrenset polyklonalt antistof blev opnået fra R GAPDH fwd 5′-ATGGGGAAGGTGAAGGT-3 ‘og rev 5′-AAGCTTCCCGTTCTCAG-3’

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev vurderet ved CellTiter 96 assay (Promega, USA). Celler blev podet ved en densitet på 5000 celler i plader med 96 brønde og inkuberet i DMEM indeholdende 10% FCS i den angivne tid. Derefter blev pladerne inkuberet med CellTiter 96 ved 37 ° C i 2 timer. Absorbans ved 490 nm blev målt under anvendelse af en 96-brønds plade-læser.

Resistensbestemmelse assays

Celler blev podet ved en densitet på 5 000 celler i plader med 96 brønde og inkuberet i DMEM indeholdende 10% FCS til 24 timer. Derefter blev lægemidler (Irinotecan, 5-fluoruracil og cisplatin) tilsat, og cellerne blev yderligere inkuberet i 72 timer CellTiter 96 blev derefter tilsat, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 2 timer. Absorbans ved 490 nm blev målt under anvendelse af en 96-brønds plade-læser.

cellemigrationsassay

Celler blev podet ved en densitet på 5 000 celler i 6-brønds plader, der tidligere er overtrukket med kollagen I og var inkuberet i 24 timer. Derefter blev celler sultet natten over og stimuleret med DMEM 10% FCS eller DMEM uden FCS som kontrol. Cellemigrering målt ved celle tracking bruge video-mikroskopi og Metamorph software (Molecular Device) til 8 timer.

xenotransplantat musemodeller

NOD /SCID (ikke-overvægtige diabetiske /svær kombineret immundefekt) /yc null mus (NSG) blev opnået fra Charles River Laboratory (Frankrig). HCT15 celler, der udtrykker shCTRL eller shPTK7 blev inficeret med lentivirus vektor, der udtrykker LUC2 og 2,10

6 celler blev subkutant injiceret i 9 uger gamle NSG mus (vægt: 25g). LUC2 udtryk niveau blev kontrolleret før injektion. Tumor udvikling blev fulgt i løbet af 8 uger og beregnes ved hjælp af formlen V = 0.52x (LxB

2). På dag 50 blev tumorresektion udført og tumorvægt blev målt. Derefter blev udvikling af metastaser efterfulgt af bioluminescens analyse ved hjælp Photon imageur (Biospace Lab, Paris, Frankrig). Ved forekomst af metastatiske signaler eller færdiggørelse af analysen (dag 130), blev musene obduceret og orgel luminescens blev udført. Billede analyse blev udført ved hjælp af M3 vision software (Biospace lab). Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de franske retningslinjer for håndtering af dyr.

Statistisk analyse

Sammenligning af kategoriske variable fordeling blev udført af χ2 eller Fishers eksakte test. For kontinuerlige variabler blev t-test og ikke-parametriske Mann-Whitney U test anvendes. Opfølgning blev beregnet ud fra diagnose til datoen for sidste nyheder for patienter i live. Metastase overlevelse (MFS) blev målt fra diagnose til første metastatisk begivenhed eller død. For patienter uden metastatisk tilbagefald eller død på tidspunktet for den sidste opfølgning, blev censur udført på datoen for sidste opfølgning. Samlet overlevelse (OS) blev målt fra diagnose til død eller datoen for sidste opfølgning. Overlevelse blev estimeret med Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet mellem grupper med log-rank test. For multivariat analyse blev en Cox proportionel risiko anvendte model. Dataene indberettes i overensstemmelse med de rapporterende anbefalinger til tumormarkør prognostiske undersøgelser (bemærkning) [35]. For at sammenligne tumor vækstkurver i prækliniske eksperimenter blev to-vejs ANOVA udført. Alle statistiske tests var to-sidet. Statistiske analyser blev udført enten med R softwareversion 2.15 eller Prism-software (Graphpad software, San Diego, CA, USA)

Resultater

PTK7 protein markant opreguleret i CRC

for bedre at forstå den rolle PTK7 i kolorektal tumorigenese, vi undersøgte sin proteinekspression ved immunhistokemi på en TMA indeholder tumorvæv fra 192 primære CRC’er (de kliniske karakteristika er vist i S1 tabel) og matchet normal slimhinde. PTK7 immunfarvning kunne evalueres i 138 CRC (72%) og 142 normale væv (74%), henholdsvis. Vi har detekteret PTK7 udtryk i primære tumorer i 78 patienter (56%), med en intensitet på 2 eller 3 i 48 patienter (35%) og en i det væsentlige cytoplasmatisk subcellulære placering (fig 1A og 1B). Til sammenligning kun 32 patienter (22%) havde påviselig immunfarvning i matchet normal slimhinde, med en intensitet på 2 eller 3 i 20 patienter (14%) (p = 1.91.10

-8, chi-2 test, fig 1A og 1B). Desuden, når PTK7 blev udtrykt, var den gennemsnitlige procentvise antal positive celler var 31% (95% CI: 25-37%) i tumorvæv versus 2% (95% CI:. 1,2-3,8%, p = 5,74 10

-14, Mann-Whitney U-test) i matchet normal mucosa (fig 1C og 1D). Ved hjælp af en cut-off på mindst 10% af positive celler med en intensitet på 2 eller mere (som vil blive anvendt derefter som definitionen af ​​PTK7 overekspression), 47 patienter havde detekterbar PTK7 overekspression i tumorvæv (34%), men kun 3 i normal mucosa (2%) (fig 1D). Således blev PTK7 overudtrykt i et betydeligt antal primære CRC, men ikke eller næsten ikke i normalt væv

A- PTK7 udtryk ved immunhistokemi (IHC) på TMA indeholder primære CRC væv:. Farvning af tumor kerner viser høj ( øvre panel) og ingen /lav (nederste panel) ekspression i repræsentative cancervæv (forstørrelse x 400). B- intensitet PTK7 farvning ved IHC i primær CRC og matches normal slimhinde: farvning blev klassificeret som 0, 1+, 2+ og 3+ som beskrevet i materialer og metode afsnittet. Andele blev sammenlignet ved Chi-2 test. C-Mean procentdel af celler med PTK7 farvning i primær CRC og matches normal slimhinde. D- Tumor kerner af primær CRC viser PTK7 overekspression (som defineret ved farvning af 10% af celler eller mere, med intensitet på 2 eller flere) og matches normal mucosa (forstørrelse x 400). Procentdele blev sammenlignet under anvendelse Mann-Whitney U test. *** = P 0,001. E- Kaplan-Meier-analyse af metastase-fri (til højre) og samlet (venstre) overlevelse af ikke-metastatiske CRC patienter i henhold til PTK7 overekspression på TMA. Overlevelse blev sammenlignet ved hjælp af log-rank test.

PTK7 overekspression er forbundet med dårlig overlevelse i ikke-metastaserende CRC

Vi undersøgte, om PTK7 overekspression var korreleret med de vigtigste kliniske og patologiske funktioner. Som vist i S2 tabel, blev ikke signifikant sammenhæng fundet mellem PTK7 overekspression og parametre såsom alder, køn, colon eller rectum placering, tumor stadium, lymfeknude forlængelse, metastatisk stadie, lymfo-vaskulær invasion (LVI), differentiering kvalitet og kolloid mukøse komponent. Af note, der var en ikke-signifikant tendens mod en lavere ekspression i tumorer med mikrosatellit instabilitet-høj fænotype. Vi fokuserede derefter på scenen I-III, M0 CRC patienter og evaluerede virkningen af ​​PTK7 overekspression på overlevelse. Ved univariat analyse, sammen med lymfekirtelinvolvering og kolloid mukøse komponent blev PTK7 overekspression associeret med en signifikant reduceret MFS (tabel 1). Den 5-årige MFS var 75,7% (95% CI: 65 til 88,1%) i PTK7-negative tumorer versus 54% (95% CI: 38,8 til 75%) i PTK7-positive tumorer (HR = 2,1 [1-4,1] ; p = 0,034, log-rank test, fig 1E). Ved multivariat analyse, kun kolloid mukøse komponent bevaret uafhængig prognostisk værdi for MFS, men PTK7 nærmede statistisk signifikans (tabel 1). Lignende tendenser blev observeret i form af samlet overlevelse (Fig 1E, tabel 1). Således blev PTK7 overekspression i ikke-metastaserende CRC er forbundet med et negativt resultat. For at undersøge eventuelle forskelle mellem primære og metastatiske tumorer, vi undersøgte yderligere primære væv fra en lille gruppe af 7 PTK7-positive levermetastaser. I alle prøver, PTK7 udtryk var ens i begge væv (S1 Fig)

PTK7 nedregulering ikke påvirker celledeling og narkotika-modstand, men det reducerer celle migration af humane CRC cellelinjer

for at undersøge det biologiske grundlag for øget aggressivitet i PTK7 overekspression CRC, vi etableret et knockdown model af PTK7 i humane CRC cellelinier HCT15 og HCT116, som udtrykker en stor mængde endogent PTK7 (fig 2A). Celler blev inficeret med lentivirus udtrykker en ikke-targeting shRNA kontrol (shCTRL) eller to forskellige shRNA rettet PTK7 (shPTK7-1 og shPTK7-2) og effektiviteten af ​​PTK7 knockdown blev bekræftet på mRNA og protein niveauer (Fig 2A og 2B).

PTK7 ekspressionsniveau i shCTRL- eller shPTK7 (1 og 2) -inficerede HCT15 og HCT116 cellelinjer blev kontrolleret ved western blot (A) og Q-PCR-analyse (B). Cellelevedygtighed blev kvantificeret ved celle titer-assay i 3 dage (C-D). Cellelevedygtighed af shCTRL- og shPTK7 (1 og 2) inficerede HCT15-celler blev vurderet ved celle titer-assay, 72 timer efter adjunction af cisplatin, irinotecan og 5-fluorouracil (E).

Vi derefter analyseret effekten af ​​PTK7 på celleproliferation og overlevelse ved anvendelse af en celle titer-assay. I denne proliferation assay, nedregulering af ekspressionen af ​​PTK7 i HCT15 og HCT116 cellelinjer havde ingen effekt på proliferativ kapacitet af cancerceller (fig 2C og 2D). Fordi PTK7 er involveret i Wnt veje, vi kontrolleret, om dens potentielle indvirkning på spredning kunne være afhængig af Wnt ligand stimulation [14,18]. Således proliferation blev yderligere undersøgt i nærvær af konditionerede medier fra L-celler, der udtrykker Wnt3a og Wnt5a, som er kendt aktivatorer af kanoniske og ikke-kanoniske pathways hhv. Men selv under Wnt stimulation, vi ikke afsløre eventuelle virkninger af PTK7 udtryk på CRC celleproliferation (S2 Fig).

Vi har tidligere fundet, at PTK7 udtryk øger resistens i akut myeloid leukæmi celler [28]. Derfor, for at undersøge dens indvirkning på resistens i CRC-cellelinjer, vi evaluerede celle levedygtighed HCT15 celler, der udtrykker eller ikke PTK7 efter behandling med forskellige doser af cisplatin, irinotecan og 5-FU. Som vist i figur 2E, gjorde nedregulering PTK7 udtryk ikke give nogen supplerende følsomhed HCT15 til cytostatika. Lignende resultater blev opnået med HCT116 (S3 Fig).

Derefter undersøgte vi, hvilken rolle PTK7 i cellemigrering. HCT15-celler blev udsultet i 24 timer, derefter stimuleret med FCS og cellemigration blev efterfulgt af live-cell tracking. Da FCS blev tilføjet som en faktor, migreringen af ​​HCT15 shCTRL celler steget med 2,5 gange. Men i PTK7-knockdown HCT15 celler blev FCS-induceret migration afskaffet. Lignende resultater blev fundet for HCT116 celler (Fig 3A og 3B). Således ikke PTK7 udtryk ikke påvirker hverken celledeling eller resistens, men det giver pro-vandrende kapacitet til humane CRC-cellelinjer.

shCTRL- og shPTK7 (1 og 2) inficerede HCT15 celler blev udsultet natten over og inkuberet med eller uden FCS. Celle migration blev målt ved celle tracking bruge video-mikroskopi og Metamorph software. Afstand af migration blev beregnet for hver tilstand og midler blev sammenlignet under anvendelse Wilcoxon Rank Sum (A). Repræsentative vandreklitter kurser blev vist i (B).

PTK7 nedregulering reducerer tumorvækst og metastase udvikling i xenograft musemodeller

For at undersøge tumorigen aktivitet PTK7

in vivo

vi subkutant transplanterede selvlysende HCT15 celler (shCTRL eller shPTK7) i NSG mus og overvåges både tumorvækst og metastatisk spredning. Som vist i fig 4A og 4B, blev effektiviteten af ​​PTK7 knockdown kontrolleres i tumorer ved både mRNA og protein niveauer. I PTK7 knockdown HCT15-celler, blev tumorvolumen reduceret med næsten 50% (figur 4C; p = 0, 0125, to-vejs ANOVA) sammenlignet med kontrolceller. Tilsvarende blev tumormasse faldt med 2,6 fold i PTK7 Knockdown tumorer (Fig 4D; p = 0, 0025, Mann-Whitney U-test). , PTK7 spiller således en pro-tumorigen rolle

in vivo

. For at vurdere, om dette pro-tumorigen effekt skyldes forskel i celleproliferation, undersøgte vi Ki67 status i tumorxenoplantater, med og uden PTK7 knockdown. Som vist i S4 Fig, sås ingen signifikant forskel mellem HCT15 shCTRL og HCT15 shPTK7 xenografter i form af Ki67 farvning.

Angivelse af PTK7 blev tjekket efter tumor resektion af Q-PCR (A) og western blot analyse ( B). Vækst af subkutan xenograft af shCTRL- og shPTK7-inficerede celler HCT15 blev undersøgt (C- D). Billeder fra et repræsentativt HCT15 shCTRL injicerede mus og deres organer blev vist i venstre panel. Antallet af metastase-free or-positive mus i hver betingelse blev evalueret og vist i højre panel. Proportioner blev sammenlignet ved hjælp af Fischers eksakte test (E).

Med hensyn til den kliniske effekt af PTK7 overekspression på MFS og dets pro-vandrende effekt

in vitro

, vi undersøgt, om PTK7 kunne forbedre metastase i xenotransplanteret musemodel. Efter resektion af HCT15-afledte tumorer blev metastatisk udvikling overvåges

in vivo

anvendelse af en luciferase reporter. Der var en ikke-signifikant tendens til mindre metastatisk forekomst i mus injiceret med PTK7-knockdown HCT15-celler, sammenlignet med shCTRL-HCT15 injicerede mus (2 metastatiske begivenheder på 15 mus versus 6 metastatiske begivenheder i 12 mus, henholdsvis; p = 0,0871, Fischers eksakte test) (fig 4E).

for yderligere at undersøge en mulig pro-metastatisk effekt af PTK7, vi byggede en cellulær model af PTK7 overekspression i PTK7-negative cancerceller og undersøgt dens indvirkning på metastaser udvikling

in vivo

. I mangel af tilgængelige PTK7-negative humane CRC celler, brugte vi en B16F10 melanom cellelinje, en PTK7-negative celle med veldokumenteret evne til at producere lungemetastaser i xenograftmodeller [36], som model. Vi transficerede B16F10 celler med PTK7 udtryk eller tom vektor, og kontrollere, at PTK7 stabilt blev udtrykt på plasmamembranen ved FACS-analyse (S5A og S5B Fig). B16F10 celler blev derefter injiceret intravenøst ​​og lunge metastase udvikling blev analyseret. Vi fandt, at overekspression af PTK7 væsentligt forbedret den metastatiske udvikling (p = 0,0024) (S5C og S5D Fig). Ser man på størrelsen af ​​metastaser, fandt vi, at PTK7 overekspression førte til et øget antal små og store metastaser (p = 0,0019 og 0.0080, henholdsvis; S5E Fig). Imidlertid er andelen af ​​små metastaser var højere i PTK7 overudtrykker celler, hvilket antyder en fremherskende virkning på celleinvasion og adhæsion, snarere end på celleproliferation. Således PTK7 overekspression øger metastatiske fænotype

in vivo

.

Diskussion

Mens afvigende mRNA ekspressionen af ​​PTK7 oprindeligt blev påvist i CRC [13], blev rådighed om ingen data dens proteinekspression i klinisk kommenterede CRC prøver. Ved hjælp af immunhistokemi, har vi bekræftet sin protein overekspression i en relevant brøkdel af CRC tilfælde (omkring en tredjedel af patienterne), sammenlignet med matchede raske slimhinder, hvor det ikke var eller næsten påviselige. I denne serie, blev udtryk ikke fundet at være forbundet med nogen specifikke kliniske eller patologiske funktioner, herunder alder, tumorstørrelse, lymfeknude involvering, scene, LVI, kolloid slim komponent, og differentiering klasse. Men i ikke-metastaserende CRC blev PTK7 overekspression forbundet med en betydelig reduceret MFS. Denne dårlig prognose indvirkning på sigt af metastatisk potentiale viste sig at nærme statistisk signifikans i en multivariat analyse, hvorimod lymfeknude involvering ikke blev bibeholdt. Med hensyn til OS, blev lignende tendenser observeret, men uden at nå statistisk signifikans, sandsynligvis på grund af den begrænsede stikprøvestørrelse. Notatet blev fundet nogen signifikant sammenhæng mellem PTK7 overekspression og metastatisk stadie på diagnose, hæve spændende hypotese, at PTK7 udtryk kan gå tabt, når metastaser er etableret.