PLoS ONE: Panel Based MALDI-TOF Tumor Profilering er en følsom metode til påvisning af mutationer i Klinisk ikke-småcellet lungekræft Tumour

Abstrakt

Baggrund

Analyse af tumor prøver for mutationer bliver stadig vigtigere i kørsel personlig terapi i kræft. Som mere målrettede behandlinger er udviklet, at optioner undersøgelse mutationer i flere gener i en enkelt tumor prøve vil blive stadig mere attraktive og forventes at blive grundlaget for molekylær diagnostik i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) i fremtiden.

Materialer og metoder

238 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tumor prøver blev analyseret ved hjælp af en brugerdefineret panel af 82 mutation analyser på tværs 14 onkogener, herunder

KRAS

EGFR

bruge Sequenom IPLEX Matrix Assisted Laser desorption /Ionisering Time of Flight massespektrometri (MALDI-TOF). Vi sammenlignede data, der genereres for

KRAS

mutationer til dem opdaget af Amplification Refractory Mutation System (ARMS) baseret DxS TheraScreen K-RAS Mutation Kit.

Resultater

De ARMS opdaget mutationer i 46/238 tumorprøver. For prøver med mutationer detekteres af begge fremgangsmåder, blev der observeret 99,1% samlet aftale. Den MALDI-TOF-metoden opdaget yderligere 6 prøver som

KRAS

mutation positive og også forudsat data om samtidige mutationer, herunder

PIK3CA

TP53

.

konklusioner

Sequenom MALDI-TOF metode giver en følsom panel tilgang, som gør effektiv brug af patientens diagnostiske prøver. Denne teknologi kan være en mulighed for at levere omfattende screening af relevante biomarkører til klinikken tidligere i forvaltningen af ​​sygdomme, uden behov for gentagelse biopsi og give mulighed for yderligere downstream analyse i NSCLC, hvor tilgængelige væv kan være udtømt.

Henvisning : Sherwood JL, Müller S, Orr MCM, Ratcliffe MJ, Walker J (2014) Panel Based MALDI-TOF Tumor Profilering er en følsom metode til påvisning af mutationer i Klinisk ikke-småcellet lungekræft Tumor. PLoS ONE 9 (6): e100566. doi: 10,1371 /journal.pone.0100566

Redaktør: Anthony WI. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Marts 21, 2014 Accepteret: 23. maj 2014 Udgivet: 23 Jun 2014

Copyright: © 2014 Sherwood et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Data er tilgængelige i tal i manuskriptet og i den supplerende tabel

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af AstraZeneca. Den bidragyder forudsat støtte i form ofmsalaries for forfattere JLS, MCMO, MJR, og JW og Sequenom GmbH til forfatteren SM, men havde ikke nogen rolle i studie design, indsamling data eller analyser, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet.

Konkurrerende interesser: JLS, MCMO, MJR, og JW er medarbejdere i og ejer aktier i AstraZeneca, hvis selskab finansierede denne undersøgelse. SM er ansat i Sequenom GmbH. Patenter vedrørende selumetinib er som følger: patentid patenttitle, US200903005, 8, tosylat salt af 6- (4-br0m0-2-chl0r0phenylamin0) -7-fluor-N- (2-hydroxyethoxy) -3-methyl-3H-benzimi dazole – 5 – carboxamid, MEK-inhibitor nyttige til behandling af cancer, US200924627, 4 farmaceutisk præparat 271 US201013051, 9 kombinationsterapi omfattende AZD2171 og azd6244 eller MEK-inhibitor. II, US200323286, 9 N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, us7842816 N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US7777050 N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US7576114 N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-hæmmere, US8193229, metode til behandling med N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US8193230, sammensætninger omfattende N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer og metoder til anvendelse heraf, us7235537, N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US7973170, N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US8003805, N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer , US7425637, N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer, US8178693, N3 alkylerede benzimidazolderivater som MEK-inhibitorer. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

NSCLC udgør omkring 85% af alle lungekræfttilfælde [1]. Ca. 20% af kaukasiere med NSCLC, stigende til over 26% af dem med adenokarcinomer (ADC) har aktiverende mutationer i

KRAS

[2]. Asiatiske befolkninger har en

KRAS

mutation forekomst på 11% i ADC. Mutationer i

EGFR

er til stede i 48% af asiatiske NSCLC ADC versus 19% i kaukasiske ADC.

EML4-ALK

mutationer er til stede i 6% af kaukasisk NSCLC ADC og 5% af asiatisk [2] ADC. Molekylær analyse af afvigelser i

EGFR

ALK

er veletableret og anvendes til at identificere patienter, der er egnede til målrettede behandlinger såsom EGFR tyrosinkinasehæmmere (TKI’er) gefitinib, erlotinib og afatinib, og

ALK

hæmmere såsom crizotinib [3].

KRAS

er en vigtig spirende markør i NSCLC. Den kliniske værdi af oprettelse

KRAS

mutation status kan stige, hvis udviklingen af ​​MEK-inhibitorer i NSCLC med mutant KRAS levere positive risiko benefit resultater for patienterne. MEK er kendt for at være en nedstrøms effektor af

KRAS

signalering og er blevet impliceret i celleproliferation og tumorvækst. Selumetinib (AZD6244, Arry-142.886) er en potent og selektiv, ikke-ATP-konkurrence MEK1 /2-hæmmer [4]. En nylig fase II kliniske forsøg (NCT00890825) sammenlignede effekten af ​​selumetinib i kombination med docetaxel versus docetaxel alene i forbehandlede patienter med

KRAS

mutation-positive lokalt fremskreden eller metastatisk ikke-småcellet lungekræft. Median samlet overlevelse var 9,4 måneder (6.8-13.6) i selumetinib gruppen og 5,2 måneder (95% CI 3,8-ikke-beregnelige) i placebogruppen (hazard ratio (HR) for død was0 · 80, 80% CI 0 · 56 -1 · 14; ensidet p = 0,21). Median progressionsfri overlevelse var 5 · 3 måneder (4 · 6-6 · 4) i selumetinib gruppen og 2,1 måneder (95% CI 1,4-3,7) i placebogruppen (HR for progression 0,58, 80% CI 0,42-0,79 ; ensidig p = 0,014) [5]. Effekten af ​​selumetinib i vildtype

KRAS

NSCLC er endnu ikke fastlagt. Andre MEK-inhibitorer i udvikling omfatter cobimetinib (GDC-0973, XL-518) og trametinib. Sidstnævnte blev for nylig godkendt til brug af FDA i

BRAF

V600E muteret melanom. Demonstration af en klar klinisk fordel i en

KRAS

mutation-positive NSCLC befolkning fører til godkendelse narkotika ville drive behovet for at identificere relevante

KRAS

mutationer i NSCLC patienter på diagnose, foruden

EGFR

ALK

afvigelser, at informere behandlingen beslutninger.

i NCT00890825 forsøget de ARMS baserede DxS TheraScreen K-RAS Mutation Kit blev brugt til fremadrettet at identificere

KRAS

mutation-positive patienter er berettiget til randomisering og behandling. ARMS metode blev valgt, da det giver overlegen følsomhed og specificitet i formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) materiale end direkte sekventering [6], [7]. I det kliniske forsøg sætte denne qPCR metode kunne udføres med en hurtig turn-around tid på små tal patient som blev modtaget prøverne.

I en anden nylig undersøgelse med selumetinib i kutant melanom, NCT00936221 [8], prøver blev analyseret ved hjælp af en kombination af våben og sekventering metoder til at teste for

BRAF

mutationer i codon V600.

Sequenom IPLEX Pro MALDI-TOF-teknologi giver flere mutationer i FFPE prøver, der skal analyseres i en enkelt undersøgelse ved hjælp multiplex PCR reaktioner [9]. Teknologien anvender små (-80 basepar) PCR-produkt amplifikation, som er optimal til amplificering af fragmenterede DNA-templates, såsom dem, der hidrører fra FFPE tumorprøver. Efter forstærkning, er et enkelt basepar extension trin udføres på stedet for den muterede base af interesse med en masse modificeret ddNTP opsigelse mix. Fordelen ved denne fremgangsmåde er evnen til at løse de fire baser på spektrene. Det resulterende fragment, med modificeret base ved stedet for mutation, derefter analyseret ved anvendelse af Sequenom MassARRAY massespektrometeret som er konstrueret og optimeret specielt til nukleinsyre påvisning. En klar fordel ved dette system er muligheden for at identificere eventuelle mutant-basen i den givne position betyder en assay dækker alle tre mulige baseændringer uden behov for en separat analyse for hver potentiel mutation. For eksempel den Gly12Cys mutation i

KRAS

er forårsaget af en G T transversion ved position 34. Sequenom IPLEX Pro vil detektere enhver mutation i denne base position herunder Gly12Arg og Gly12Ser mutationer forårsaget af G C overgang og G En tranversion hhv. Dette reducerer skabelon-DNA krav, og minimerer dermed efterspørgslen væv.

Her rapporterer vi, hvordan MALDI-TOF metoden sammenlignes med ARMS som en metode til at opdage

KRAS

BRAF

mutationer i kliniske prøver og hvordan brugen af ​​en multiplex panel tilladt os at vurdere forekomsten af ​​mindre almindelige mutationer i vores NSCLC kohorte.

Materialer og metoder

Tumor Sample Analysis

de 238 NSCLC patientprøver kom fra NCT00890825 undersøgelse [5].

177 melanom prøver fra NCT00936221 undersøgelse [8] blev også indsamlet og behandlet som beskrevet i Robert et al [8].

alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen (1964, ændret i 1975, 1983, 1989, 1996 og 2000) af World Medical Association og alle patientprøver indsendt til analyse blev gjort med fuld informeret samtykke patienter

Patologi

patienter i denne NSCLC kohorte forudsat en tumor prøve stammer fra mellem maj 2007 og maj 2010. Prøverne blev bekræftet histologisk eller cytologisk som stadie IIIB-IV NSCLC efter H . E farvning af en kvalificeret histopatolog på Labcorp Center for Molekylær Biologi og Patologi (CMBP), Research Triangle Park, NC, USA.

Nucleic acid Extraction

nukleinsyre ekstraktion blev udført på Labcorp CMBP, Research Triangle Park, NC, USA, fra 4 × 5 um FFPE sektioner, med fjernelse af paraffin ved smeltning.

DNA-ekstraktion blev udført under anvendelse af Qiagen QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland), ifølge til sættet indsatsen. Eluering var i 100 pi vand.

DNA blev kvantificeret ved anvendelse af TaqMan RNase P detektionsreagenser kit og TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems, Carlsbad, Californien, USA) for at etablere amplificerbare udbytte.

KRAS

mutation status Analyse

Tumorprøver blev prospektivt vurderet for

KRAS

mutation status ved hjælp af TheraScreen K-RAS ARMS mutation Kit (QIAGEN Manchester [tidligere DxS Ltd.], Manchester, UK).

Kvantitativ Polymerase Chain Reaction (qPCR) blev udført ved hjælp af en ABI Prism 7900 qPCR-system (Applied Biosystems).

KRAS

mutation analyse blev udført af Labcorp CMBP, Research Triangle Park, NC, USA.

En prøve af den resterende DNA blev leveret til Sequenom GmbH, Hamburg til analyse ved hjælp Sequenom IPLEX kemi og MALDI-TOF.

Sequenom IPLEX Pro Assay design

tabel 1 viser den brugerdefinerede panel af mutation assays, der er designet for mutationer i 14 onkogener nemlig

BRAF, CDNK2A, CTNNB1, EGFR, ERBB2, FGFR, HRAS, KRAS, STK11, MET, nationale tilsynsmyndigheder, TP53, PIK3CA

PTEN

. Mutationer blev udvalgt baseret på kendt frekvens i NSCLC eller melanom, biologisk betydning eller tilstedeværelse af eventuelle væsentlige “hotspots” udlån sig til målrettede analyser [2], [10] – [13].

Mutationen analyse blev udført ved Sequenom GmbH (Hamburg) og bestod af 10 multiplex indeholdende 82 assays til påvisning over 160 forskellige mutationer. Fabrikantens standardprotokol blev fulgt [9]. Kort sagt blev 2 pi af template genomisk DNA amplificeret ved multiplex-PCR at udvide vildtype (WT) og muteret DNA, efterfulgt af en reje-alkalisk phosphatase behandling for at fjerne overskydende nucleotider. Dernæst blev en primerforlængelsesreaktion (IPLEX Pro) udført med masse-modificeret terminator nukleotider, og produkterne blev spottet på en SpectroCHIP (Sequenom). De forskellige masser blev bestemt ved MALDI-TOF massespektrometri. Data blev analyseret ved hjælp MassARRAY Typer Analyser software (Sequenom) [9].

Resultater

Analyse Succes Priser

DNA udbytte varierede fra ~ 10 genomiske kopier pr uL til ~30,000 kopier pr pi med en middelværdi på 1837 kopier pr pi (5,9 ng /uL). Elleve prøver med meget lavt kopital (≤10 kopier pr pi) mislykkedes analyse under anvendelse af ARMS kit. Alle prøver blev med held analyseret ved hjælp af MALDI-TOF-panelet.

Sammenligning mellem MALDI-TOF Panel og ARMS Kit for

KRAS

i NSCLC

238 prøver blev analyseret ved hjælp af ARMS kit, som er designet til at detektere følgende 7

KRAS

mutationer: G12C /R /S /V /A /D og G13D. 46/238 (19%) patientprøver blev klassificeret som

KRAS

mutant positive ved ARMS test. Den MALDI-TOF metoden dækker G12C /R /S /V /A /D, G13D /V /A /E og Q61L /R /P /E /K /H. 53/238 (22%) prøver blev klassificeret som

KRAS

positive ved MALDI-TOF, med en patient, der har to separate mutationer, et i codon 12 og en i codon 61.

A

KRAS

A146 mutation assay blev inkluderet på MALDI-TOF panel og ingen mutationer blev påvist i overensstemmelse med tidligere rapporter tyder netop denne mutation, selvom relevant i kolorektal cancer, er ikke vigtigt i NSCLC [12], [14] .

Overensstemmelse af MALDI-TOF metode med ARMS Kit

Overensstemmelse mellem blev bestemt ved hjælp af data fra prøver, der var evaluerbare ved begge metoder (dvs. vi udelukkede de 11 prøver, der mislykkedes med ARMS de to platforme metode). Den MALDI-TOF-metoden opdaget 6 (13%) mere

KRAS

mutationer i alt, i en del på grund af bredere dækning (tabel 2 3). For de mutationer påvises ved begge platforme var den positive procentvise aftale (PPA) mellem armene fremgangsmåde og MALDI-TOF-metoden 97,8% (tabel 4) og den samlede procentdel aftale (OPA) var 99,1%. Specificiteten af ​​Sequenom platformen i prøver, der er etableret som vildtype af ARMS var 98,3% (negativ procentdel aftale). Vejviser

De to disharmoniske prøver indeholdt en prøve, hvor MALDI-TOF detekteres en G12D-mutation med ARMS assay resultat overstiger kriterierne i kittet indsats til et positivt resultat. I den anden prøve, genereret MALDI-TOF intet påviseligt signal samtidig ARMS detekteret en G12C. Den mest sandsynlige forklaring på dette er, at den store andel af vildtype DNA kan have oversteget den analytiske sensitivitet standard IPLEX Pro kemi. Det er blevet vist ved denne gruppe (data ikke offentliggjort), at dette panel var i stand til at detektere mutationer robust ned til 5% (grænsen for vores analyse) under anvendelse af cellelinje iblandinger.

Derfor Sequenom MassARRAY platformen optræder på mindst lige så godt i (OPA = 99,1%) vurdering

KRAS

mutation status i klinisk tilgængelige NSCLC FFPE prøver som ARMS platform (tabel 4), med forbedret analytisk sensitivitet (tabel 3).

forekomsten af ​​andre mutationer i NCT00890825 NSCLC Kohorte

MALDI-TOF-data blev genereret på yderligere mutationer, herunder codon 12, 13 og 61 i

HRAS

De nationale tilsynsmyndigheder

og codon 600 i

BRAF

. 107 af de 238 prøver (45%) var positive for mindst en mutation (se tabel S1). 52/238 (22%) af patienterne havde mutationer i

KRAS

, i overensstemmelse med forventet prævalens i NSCLC [2] (tabel 5).

NTM

blev påvist mutationer i 5 patienter (2,1%), herunder 3 Q61 mutationer, en G12 og en G13 mutation. Der var 3

BRAF

V600E mutant prøver og 2

HRAS

mutant prøver i codon Q61 og G12.

En række kendte

TP53

mutationer blev undersøgt og fundet at være til stede i 23/238 (10%) af patienterne. Det skal bemærkes, at MALDI-TOF-analysen kun forhørt 10/480 (2%) af udskiftninger, der er blevet rapporteret i lunge ved systematiske skærme i COSMIC database [13], selv om de var de 10 mest almindelige muterede baser rapporteret deri ( tabel 5).

EGFR

mutationer blev påvist i 20/238 (8,8%) af vores prøver. Dette er lidt lavere end forventet fra tidligere rapporter, der tyder på

EGFR

mutationer er til stede fra 10% til 15% i kaukasiere med NSCLC [15]. En række faktorer kan have bidraget til den lave forekomst af

EGFR

mutationer i vores undersøgelse. Først 9% af vores prøver var pladecellecarcinom, der har meget lavere forekomst af

EGFR

mutationer end ADC. For det andet kan vi ikke udelukke lokale forvalg af patienter til vores undersøgelse, på grund af viden om

KRAS

positiv status efter lokal test,

EGFR

positive emner omdirigeres til TKI-terapi eller øget andel af forsøgspersoner med historie af rygning, hvilket ville være mindre tilbøjelige til at have

EGFR

mutationer [2], [12].

samtidighedskriteriet af mutationer i NSCLC

10/52 (19%) af patienterne med

KRAS

mutationer havde samtidig mutationer, den mest almindelige var

TP53

,

PIK3CA

CDNK2A

. Figur 1a. viser samtidighedsprincippet af mutationer i hver tumor prøve, der indeholdt mindst en mutation, n = 107.

B).

KRAS

muterede prøver i NCT00890825 med samtidige mutationer.

Figur 1b. viser de 10 prøver, der var

KRAS

positive og havde samtidig mutationer. Fire prøver havde

TP53

mutationer, som enten var i

TP53

R282 eller R175 DNA bindende domæne mutationer. Begge disse mutationer er i top 6 hyppigste

TP53

mutationer findes i kræft og er skadelige for TP53 funktion [16].

To prøver havde en

KRAS

G12D mutation co-forekommende med en aktiverende

PIK3CA

mutation. Samtidighedsprincippet af disse mutationer er blevet observeret tidligere [12]. En prøve indeholdt en R248C mutation i

FGFR

ekstracellulære domæne, som var sammenfaldende med

KRAS

G12C.

FGFR3

mutationer er til stede på omkring 3% i lungekræft [17] og R248C mutationen er kendt for at drive tumordannelse i xenograftmodeller som blev hæmmet af multi-kinase inhibitor ponatinib.

Én prøve med en

KRAS

mutation viste en samtidig mutation med en

EGFR

T790M mutation.

KRAS

EGFR

aktiverende mutationer anses generelt for at være gensidigt udelukkende [18] ikke desto mindre de er blevet observeret ved meget lave frekvenser [19], [20]. Den T790M-mutationen er kendt for at bibringe resistens over for

EGFR

TKI s. Usædvanligt, denne prøve indeholdt også en dobbelt

KRAS

mutation og en

PTEN

mutation. Det skal bemærkes, at koncentrationen af ​​DNA var ekstremt lav i denne prøve og yderligere bekræftelse ved sekventering ikke var muligt.

Udførelse af MALDI-TOF MS Panel i Melanom Prøver

Den samme MALDI -TOF MS-panelet blev også brugt på et sæt af 177 melanom prøver fra klinisk forsøg NCT00936221 som vurderede effekten af ​​selumetinib i kombination med dacarbazin sammenlignet med dacarbazin alene i første linje patienter med

BRAF

mutation positiv fremskreden kutant eller ukendt primære melanom [8]. 69/177 (39%) prøver var

BRAF

V600E positive ved hjælp af MALDI-TOF. Dette sammenlignet meget godt med resultaterne fra NCT00936221, som blev udført under anvendelse af en kombination af to forskellige våben baseret test og Sanger-sekventering, hvilket detekterede BRAF V600E mutationer i 69/177 prøver. Langt størstedelen af ​​prøver blev undersøgt ved anvendelse armene tests. To prøver var

BRAF

mutation positive ved MALDI-TOF og negative ved Sanger sekventering. MALDI-TOF spektrografer indikerede, at disse mutationer var til stede under den nominelle følsomhed Sanger-sekventering, som kan være så højt som 20% mutant DNA i vildtype baggrund. To prøver var negative ved MALDI-TOF, men positiv ved en ARMS baseret test. Armene test havde en 2% følsomhed, hvilket er bedre end de 5% sensitivitet vi etablerede for MALDI-TOF-panel (data ikke vist). Samlet 21/177 (12%) af melanom prøver mislykkedes analyse under anvendelse af enten en ARMS test eller Sanger-sekventering, hvorimod MALDI-TOF-metoden var vellykket i alle tilfælde.

NTM

mutationer blev også påvist i 38/177 (22%) melanom prøver ved hjælp af MALDI-TOF-panel. Som en direkte sammenligning mod de data, der genereres af ARMS og ved sekventering kollektivt MALDI-TOF den samlede procentdel aftalen var 97% (152/156).

Diskussion

I denne undersøgelse undersøgte vi anvendeligheden af ​​Sequenom MassARRAY MALDI-TOF platform i mutationsdetektering i NSCLC og melanom, sammenlignet med ARMS teknologi, som har vist overlegen følsomhed end direkte sekventering i FFPE prøver. MALDI-TOF-metoden havde en højere analyse succesrate i prøver med lav DNA udbytte, sandsynligvis på grund af den mindre amplikonstørrelse (-80 bp), et godt stykke under den gennemsnitlige fragment størrelse DNA opnåelig fra FFPE prøver (-200 bp). Tidligere undersøgelser har etableret den analytiske sensitivitet Sequenom s massespektrometri teknologi som 1-10% [21]. Disse data viser, at Sequenom s MALDI-TOF-teknologi er af tilstrækkelig følsomhed og specificitet, der skal anvendes til direkte behandling til

KRAS

mutation positive patienter, i NSCLC. Salg

Betydningen af ​​testning for mutationer i 3 codon (G12, G13 og Q61) i

KRAS

almindeligt muteret i NSCLC blev demonstreret ved påvisning af 13% mere

KRAS

positive patienter i denne kliniske kohorte. Et fase III studie, SELECT-1, (NCT01933932) er i øjeblikket i gang med at vurdere effekt og sikkerhed af selumetinib i kombination med docetaxel i

KRAS

mutation positive NSCLC patienter, der fik 2. linie behandling. I dette forsøg er patienter, der vælges ved hjælp af cobas

KRAS

Mutation Test (CE /IVD), som er designet til at detektere 19 mutationer i codon 12, 13 og 61 [22].

Andet mutationer i

HRAS

,

NTM

og

BRAF

blev også påvist. Da disse mutationer er blevet forbundet med MEK-aktivering, kan patienter, der bærer disse mutationer også være kandidater til behandling med en MEK-inhibitor, selv om betydningen af ​​disse mutationer i NSCLC er ukendt [23] – [25]. For eksempel lungekræft cellelinier indeholdende

De nationale tilsynsmyndigheder

mutationer har vist sig at være følsomme over for MEK-inhibitor selumetinib [26].

De data, der genereres i

BRAF

V600E mutationer i melanom prøver viste også konkordans i 152/156 (97%) af prøver med arme eller Sanger sekventering demonstrerer nøjagtigheden af ​​MALDI-TOF MS-metoden i

BRAF

V600E mutationer. Kutane melanom prøver indeholder ofte høje koncentrationer af melanin, som inhiberer PCR. Den vellykkede analyse af prøver, der ikke bruger ARMS demonstreret evne til MALDI-TOF MS metode til succes give data i melanom prøver.

En fremtidig udfordring i klinikken er sandsynligheden for nedsat tilgængelighed væv på grund af øget efterspørgsel til test. Sekventiel refleks test af genetiske afvigelser kan resultere i behovet for yderligere invasive biopsi procedurer, som kunne undgås i nogle tilfælde ved at teste for alle informative markører parallelt når patienten første præsenterer med NSCLC.

Værdien af ​​Sequenom platform var, at det bruges mindre stikprøve end andre metoder; 2 gange mindre DNA blev anvendt til genotype 27 gange så mange loci (82 vs. 3) tværs 14 gener, end der blev anvendt til ARMS test, der så kun på et enkelt gen. Tænkes 2 × 5 um snit elueret i 50 pi ville have tilstrækkeligt materiale til den molekylære karakterisering af prøverne i denne kohorte. Dataene i vores undersøgelse blev genereret på en arbejdsdag med angivelse af dets sporbarhed i klinikken i betragtning af turn around krav.

Vi har detekteret mutationer samtidig med

KRAS

i 10/52 (19%) af tilfældene. To prøver viste samtidige

PIK3CA

mutationer med

KRAS

.

PIK3CA

mutationer i kombination med

KRAS

har vist sig at give resistens mod MEK-inhibitorer

in vivo

[27]. Evnen til at opdage samtidige mutationer kunne give yderligere kliniske fordele og potentielt give et indblik i passende kombination tilgange til terapi. Patienten numre i NCT00890825 med samtidige mutationer var for lille til at observere nogen link til respons.

Vores data viser potentialet anvendelighed af Sequenom MALDI-TOF-panel i kliniske NSCLC prøver.

En potentiel begrænsende faktor for brugen af ​​panel tests såsom Sequenom i den diagnostiske indstilling er kravet ved forvaltningsmyndigheder for omfattende validering af hver påviselige variant, som ikke altid er ligetil på grund af tilgængeligheden af ​​prøver til validering.

det skal bemærkes, at anvendelsen af ​​denne teknologi til påvisning af mutationer i tumorsuppressorgener, såsom

TP53

CDNK2A

ville være en uanvendelig og ineffektiv anvendelse af væv på grund af antallet af baser, der vil være nødvendigt at blive afhørt.

Next Generation Sequencing (NGS) teknologi kan også omfatte flere gener. NGS er særligt fordelagtigt ved screening gener, der har forskellige mutation mønstre såsom

TP53

, og kan detektere hidtil ukendte mutationer, noget mindre let opnås på MALDI-TOF platform. NGS paneler kræver generelt en højere DNA input end dette system til at muliggøre produktion af brugbare sekventering biblioteker og følsomheder kan være begrænset til omkring 5% afhængig læst dybde krav og sekvens kontekst. NGS præsenterer også sine egne udfordringer i turn-around tid og omkostninger til analyse, datasikring og datastyring.

I en diagnostisk indstilling, hvor få mutationer er af kendt relevant for målrettede behandlinger, såsom i NSCLC, Sequenom MALDI-TOF har en klar fordel i forhold direkte sekventering metoder på grund af dens dokumenterede anvendelighed i FFPE afledt DNA, hurtig turn around tid, beskedne krav datalagring og minimal krav brugeranalyse.

Som konklusion Sequenom MALDI-TOF tilgang til mutation profilering er en effektiv og informativ brug af patientprøver. Det viser sammenlignelig følsomhed og god overensstemmelse med en veletableret ekstremt følsom

KRAS

ARMS test ved anvendelse i NSCLC prøver, med evnen til at identificere en bredere vifte af mutationer ved anvendelse af mindre væv. Samtidige mutation profiler i NSCLC FFPE prøver kunne oplyse behandlingen strategi, klinikere bruger på en enkelt patient grundlag.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Alle mutationer detekteres af tilpassede MALDI-TOF-panel, ved prøve

doi:. 10,1371 /journal.pone.0100566.s001

(XLSX)